专利名称：使用hplc定量测定具体组成肝素或低分子量肝素的方法
技术领域：
本发明的实施方案为检测分级分离的肝素或未分级分离的肝素的样品中具有1-6脱水结构或乙酰化糖类的成分或对其进行定量的方法。
肝素为糖胺聚糖族的生物活性剂，提取自天然来源并且具有抗凝和抗血栓形成特性。它们特别用于治疗术后静脉血栓形成。
为了从肝素源中产生低分子量肝素(LMWH)，必须将较长的肝素多糖链打断成较短的低分子量链。这一过程可以通过化学或酶的解聚来进行。结果可以为约5,000Da的LMWH多糖链的平均分子量。LMWHs，如未分级分离的肝素通过结合沿多糖链中的某些分布的特定戊多糖序列上的ATIII来抑制凝固。
每个经批准的产品的LMWH制造商均使用不同的解聚方法。除非两个制造商使用相同的方法，否则这种方法的差别产生具有不同化学结构的LMWHs和由此的不同药理学活性和不同的经批准的临床应用适应征。所得的LMWHs因用于其制备的解聚方法的不同而在结构上存在差异(R.J.Linhardt等，Seminars in Thombosis and Hemostatis1999；25(3 Supp.)5-16)。结果是LMWHs比肝素更具有不均匀性。每种不同的方法对多糖链产生了独特和高度复杂的结构修饰。这些修饰包括链长和链序列以及结构指纹的差异。因此，不同的LMWHs可能具有不同的药理学特性和不同的经批准的临床适应征。
依诺肝素钠购自Aventis并且在美国以依诺肝素钠注射剂形式销售，商标为Lovenox(在某些其它国家中为Clexane)。一般来说，通过对来源于猪肠粘膜的肝素苄基酯进行强碱降解获得依诺肝素钠。例如，其结构的特征在于该链非还原端上的2-O-磺基-4-烯吡喃糖基糖醛酸基和还原端上的2-N，6-O-二磺基-D-葡糖胺。平均分子量约为4500道尔顿。分子量分布为＜2000道尔顿 ≤20％2000-8000道尔顿≥68％＞8000道尔顿 ≤18％
在制备依诺肝素钠的过程中，存在葡糖胺的6-O-脱硫酸盐，导致形成称作“1，6脱水”的衍生物(国际专利申请WO 01/29055)，如下所示 这种类型的衍生物仅对末端葡糖胺为6-O-硫酸化的寡糖链获得。
末端被1，6-脱水键修饰的寡糖链的百分比为依诺肝素钠的寡糖混合物的结构特征，并且应能够测定它。基于现有的知识，依诺肝素钠中15％-25％的成分在其链的还原端上带有1，6-脱水结构。
本发明的一个实施方案由此提供了用于分析未分级分离的肝素和分级分离的肝素的方法。本文所用的“分级分离的肝素”指的是任意进行解聚的肝素，例如低分子量肝素(LMWH)，包括依诺肝素钠和正在依据引证Lovenox/Clexane(依诺肝素钠注射剂)作为列举药物的申请寻求管理机构批准的任意LMWH。
在一个实施方案中，本发明的分析方法如下通过肝素酶的作用使检测的样品解聚，如果合适，然后还原获得的解聚物，且然后通过高效液相色谱法进行分析。
如上所述方法由此的特征在于分析解聚物以便检测末端被1，6-脱水键(“1，6-脱水基”)修饰的寡糖链的存在。
在相关的实施方案中，首先使用肝素酶，例如肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)，例如使用各自以0.5个单位/ml存在的肝素酶的混合物使检测的样品完全解聚。(这些酶由Grampian Enzymes集团销售)。
本发明的主题由此为用于分析未分级分离的肝素或分级分离的肝素的方法，包括下列步骤(a)通过肝素酶的作用使样品解聚；(b)如果合适，还原解聚物；(c)通过高效液相色谱法分析步骤(a)或(b)的样品。
在一个实施方案中，本发明的主题为如上所述方法，其中肝素酶为肝素酶1(EC 4.2.2.7.)，肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物形式。
然后处理由此制备的解聚物以便减少非1，6-脱水形式的还原端(专利申请WO01/72762中所述产品)。在一个实施方案中，用在乙酸钠中的NaBH4溶液处理解聚物以便减少非1，6-脱水形式的还原端。最终，为了能够对下述的二糖类1和2进行定量，可以通过还原剂，诸如，NaBH4的作用还原使用肝素酶解聚的低分子量肝素的样品。
本发明的主题由此为如上所述方法，其中随后还原解聚的肝素。
本发明的主题还在于如上所述方法，其中所述还原剂为NaBH4。还可以使用其它硼氢化物的碱金属盐，诸如锂或钾盐。
本发明的检测方法能够清楚地区分依诺肝素钠与其它不含“1，6-脱水”衍生物的低分子量肝素。相反，本发明的方法能够确定低分子量肝素不具有依诺肝素钠的物理化学特征并且由此在性质上不同。
例如，本发明的方法应用于样品的工序间控制过程中的工业化方法中，以便提供制备依诺肝素钠的标准化方法并且获得均匀批量。
在酶解聚和可选的还原端还原后，依诺肝素钠的1，6-脱水衍生物以4种主要形式存在，即二糖1、二糖2、二糖3和四糖1。
本发明的主题由此还在于如上所述方法，其中在解聚反应过程中获得的1，6-脱水残基包括如下部分 二糖 1二糖 2 二糖 3 四糖 1末端二糖单元上含有1，6-脱水端并且在所述末端二糖的糖醛酸上不带有2-O-硫酸盐的寡糖类或多糖类被肝素酶完全解聚并且为二糖1和2的形式。另一方面，当末端糖在糖醛酸上含有2-O-硫酸盐并且当它为甘露糖胺形式时，1，6-脱水衍生物为四糖1形式(耐肝素酶的形式)。
三糖1(参见下文)也可以存在于混合物中。它来源于另一个产生如下结构的降解过程(在依诺肝素钠的化学解聚过程中观察到的剥离现象)。
三糖 1混合物中的其它成分并非是依诺肝素钠的惟一特征。当然存在肝素链的8种基本二糖类。这8种基本二糖类特别由Sigma公司销售。
通过本发明的方法鉴定混合物中的其它二糖类二糖ΔIISgal和ΔIVSgal，它们具有作为其来源的-IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和-IdoA(2S)-GlcNS-的碱2-O-脱硫酸化物，从而形成2半乳糖醛酸。它们通常并不存在于肝素的原始结构中(U.M.Desai等，Arch.Biochem.Biophys.，306(2)461-468(1993))。
含有3-O-硫酸化葡糖胺类的寡糖类耐肝素酶裂解并且保持以四糖类的形式存在。
就大部分低分子量肝而言，肝素提取自猪粘膜并且这些主要的四糖类以如下形式为代表。
这些四糖类耐酶解聚并且反映出对抗凝血酶III具有亲合性的序列。如下标记这些四糖类ΔIIa-IIsglu和ΔIIa-IVsglu。(S.YAMADA，K.YOSHIDA，M.SUGIURA，K-H KHOO，H.R.MORRIS，A.DELL，J.Biol.
Chem.；270(7)，4780-4787(1993))。
使用肝素酶裂解的混合物中的最终成分为葡糖丝氨酸末端ΔGIcA-Gal-Gal-Xyl-Ser(K.Sugahara等，J.Biol.Chem.；270(39)，22914-22923(1995)；K.Sugahara等；J.Biol.Chem.；267(3)，1528-1533(1992))。后者一般几乎不存在于依诺肝素钠中(参见实施例5中的NMR)。
本发明在另一个方面中提供了检测1，6-脱水基团的方法。在一个实施方案中，所述方法包括分离解聚后获得的各种寡糖类并且可选地用还原剂，诸如NaBH4处理。
可以通过HPLC(高效液相色谱法)对本发明的各种寡糖类进行分离。在一个实施方案中，HPLC为阴离子交换色谱法。在相关的实施方案中，阴离子交换色谱法为强阴离子交换色谱法(SAX)。
本文所用的术语“强阴离子交换色谱法”(SAX)包括在约pH 2-12范围内维持恒定的净正电荷的任意树脂上进行的阴离子交换色谱法。在本发明的某些实施方案中，强阴离子交换色谱法使用应用季铵交换基团官能化的固相支持物。例如，可以使用具有约5um颗粒大小的柱，诸如SpherisorbSAX(Waters Corp，Milford MA)，可以使用约25cm的柱长和约1mm-约4.6mm的柱直径。
所用的设备可以为能够形成洗脱梯度并且安装了适合于选择性检测乙酰化糖类的合适的UV检测器的任意色谱仪。在本发明的一个实施方案中，所述UV检测器为二极管阵列，它能够产生所述成分的UV光谱并且能够产生因所记录的2个不同波长处的吸收度之间的差异而产生的复杂信号。这类二极管阵列检测器能够进行乙酰化寡糖类的特异性检测。在相关的实施方案中，使用可透过达200nm的UV区的HPLC流动相。在该实施方案中，不使用基于NaCl的常用流动相，它们存在需要被动色谱仪以抵抗氯化物的腐蚀能力的额外缺陷。可以按照本发明该实施方案使用的流动相包括，但不限于基于高氯酸钠、甲磺酸盐或磷酸盐的流动相。在一个实施方案中，流动相为甲磺酸铵的水溶液。
本发明的主题由此还在于如上所述通过阴离子交换色谱法进行的分析方法，其中使用可透过约200nM-约400nM的UV区的流动相。
在某些实施方案中，在约2.0-约6.5的pH下进行强阴离子交换色谱分离。在相关实施方案中，使用约3左右的pH。例如，可以通过向在pH＝3下具有缓冲能力的流动相中添加盐来控制pH。在本发明的某些实施方案中，使用在pH 3具有大于高氯酸盐的缓冲容量的盐，诸如磷酸盐。典型的色谱分离条件如下所示流动相溶剂ANaH2PO4，2.5mM，通过添加H3PO4达到pH 2.9溶剂B在1N NaH2PO4中的NaClO4，2.5mM，通过添加H3PO4达到pH 3.0洗脱梯度可以如下T＝0分钟％B＝3；T＝40分钟％B＝60＝T＝60分钟％B＝80按照使用的柱选择合适的温度，例如约40℃-约50℃，和泵流速。
通过SAX色谱法纯化样品的其它方法为本领域技术人员所公知。例如，SAX法描述在下列文献中K.G.Rice和R.J.Linhardt，Carbohydrate Research 190，219-233(1989)；A.Larnkjaer等，Carbohydrate Research，266，37-52(1995)；和专利WO 90/01501(实施例2)。将这些参考文献的全部内容引入本文作为参考。
本发明的另一个方面为检测未分级分离的肝素或分级分离的肝素中发现的具体基团的方法。
在一个实施方案中，该方法增加了肝素或LMWH基团的UV检测的特异性。当未乙酰化多糖类在指定pH下均具有相当类似的UV光谱时，能够通过取在所选的2个波长处吸收度之间的差异作为信号，以便抵消未乙酰化糖类的吸收性选择性检测乙酰化糖类。
正如下文通过实施例解释的，可以将202nm和230nm选作检测和参比波长并且可以记录202-230nm的信号。本领域技术人员可以理解可以按照本发明使用的波长的选择取决于流动相的pH(调整几个nm可能是必不可少的，以便处于最佳pH下)。
在本发明中可以使用可以同时在两个或多个波长处测定吸收度的任意UV检测器。在本发明的一个实施方案中，使用来自AgilentTechnologies公司的DAD 1100检测器。在该实施方案中，一方面在234nm处，而另一方面在202-230nm处进行双重检测。附
图1中解释了乙酰化寡糖类的选择性检测原理，其中将硫酸化二糖ΔIs的UV光谱与乙酰化二糖ΔIa的UV光谱进行比较。
本发明的主题由此还在于如上所述分析方法，其中该检测方法能够选择性检测乙酰化糖类。
在某些实施方案中，所述分析方法使用了通过SAX色谱法进行分离的方法并且通过测定所选的两个波长处的吸收度之差，以便抵消未乙酰化糖类的吸收性来选择性检测乙酰化糖类。
上述4个1，6-脱水残基的定量要求色谱系统在涉及混合物中所有其它成分时的足够选择性。然而，就ΔIIa而言，难以拆分一般共同洗脱的两种二糖1和2，尤其是当后者以其两种α和β异头物的形式存在时。
易于验证对两种二糖1和2的鉴定，因为它们在室温下在通过添加NaOH达到pH 13的ΔIIs的水溶液中和几小时内形成。然而，如果使用双重检测，那么易于鉴定乙酰化寡糖ΔIVa、ΔIIa、ΔIIIa、ΔIa、ΔIIa-IVsglu和ΔIIa-IIsglu。
一方面，峰分裂的原因为异头物形式，并且在较低程度上，就ΔIIs、ΔIIIs和ΔIs而言并非存在葡糖胺甘露糖胺差向异构化，此时，它们位于寡糖链的末端位置上。
在本发明的某些实施方案中，通过经NaBH4的作用还原预先用肝素酶解聚的低分子量肝素样品对二糖1和2进行定量。
α异头物+β异头物这种还原具有通过使末端寡糖环开放消除αβ正位异构的优点。因为消除了正位异构，所以获得的色谱图更为简单。此外，ΔIIa的还原减少了其在柱上的保留并且易于检测二糖1和2。
附图2和3中所述色谱图的实例清楚地解释了这些现象和该方法的优点。
附图简述附图1解释了乙酰化寡糖类的选择性检测，其中将硫酸化二糖ΔIs的UV光谱与乙酰化二糖ΔIa的UV光谱进行比较，其中x-轴代表波长(nm)，而y-轴代表吸收度(mAmps)。
附图2表示使用NaBH4还原前后用肝素酶解聚的依诺肝素的色谱分离(细黑的信号在234nm处的UV；粗黑的信号在202-234nm处的UV at)，其中x-轴为洗脱时间(分钟)，而y-轴代表吸收度(mAmps)。
附图3表示使用NaBH4还原前后用肝素酶解聚的肝素的色谱分离(细黑的信号在234nm处的UV；粗黑的信号在202-234nm处的UV at)，其中x-轴为洗脱时间(分钟)，而y-轴代表吸收度(mAmps)。
实施例实施例用于解释本发明的各种特征。本领域技术人员可以理解本发明并不限于如下典型的实施方案。
实施例1酶解聚的一般性描述下面是对如何进行酶解聚的一般性描述并且可以用于本发明。
在室温下通过下列步骤将酶解聚进行48小时将含有所检测的20mg/ml依诺肝素钠的50ul溶液、在pH 7.0下的含有2mM乙酸钙和1mg/ml BSA的200ul 100mM乙酸/NaOH溶液与50ul 3种肝素酶的储备溶液混合。将肝素酶贮存在-30℃下。肝素酶为缓冲溶液形式并且每种肝素酶的滴度为0.5IU/ml(该缓冲溶液的组成浓度为0.01mol/l并且补充了2mg/ml牛血清清蛋白(BSA)的pH 7的KH2PO4水溶液)。
通过添加使用前即刻制备的10ul在100mM乙酸钠中的30g/lNaBH4溶液对使用肝素酶解聚的60ul产品进行还原。
实施例2按照实施例1的一般性描述获得的二糖3的NMR在D2O中的质子光谱，400MHz，T＝298K，以ppm计的δ3.34(1H，dd，J＝7和2Hz，H2)，3.72(1H，t，J＝8Hz，H6)，3.90(1H，m，H3)，4.03(1H，s，H4)，4.20(1H，d，J＝8Hz，H6)，4.23(1H，t，J＝5Hz，H3′)，4.58(1H，m，H2′)，4.78(1H，m，H5)，5.50(1H，s，H1)，5.60(1H，dd，J＝6和1Hz，H1′)，6.03(1H，d，J＝5Hz，H4′)]。
实施例3按照实施例1的一般性描述获得的四糖1的NMR在D2O中的质子光谱，400MHz，T＝298K，以ppm计的δ3.15(1H，s，H2)，3.25(1H，m，H2″)，3.60(1H，m，H3″)，3.70-4.70(14H，未拆分的复合物，H3/H4/H6，H2′/H3′/H4′/H5′，H4″/H5″/H6″，H2/H3)，4.75(1H，m，H5)，5.20-5.40(2H，m，H1′和H1″)，5.45(1H，m，H1)，5.56(1H，m，H1)，5.94(1H，d，J＝5Hz，H4)实施例4按照实施例1的一般性描述获得的三糖1的NMR
在D2O中的光谱，600MHz，T＝298K，(以ppm计的δ)3.28(1H，m)，3.61(1H，t，7Hz)，3.79(1H，t，7Hz)，3.95(1H，d，6Hz)，4.00(1H，s)，4.20(1H，m)，4.28(2H，m)，4.32(1H，d，4Hz)，4.41(1H，s)，4.58(1H，s)，4.61(1H，s)，4.90(1H，宽峰s)，5.24(1H，s)，5.45(1H，s)，5.95(1H，s)。
实施例5按照本发明获得的ΔGIcA-Gal-Gal-Xyl-Ser的NMR。
在D2O中的光谱，500MHz(以ppm计的)3.30(1H，t，7Hz)，3.34(1H，t，8Hz)，3.55(1H，t，7Hz)，3.60(1H，t，7Hz)，3.63-3.85(10H，m)，3.91(2H，m)，3.96(1H，dd，7和2Hz)，4.02-4.10(3H，m)，4.12(1H，d，2Hz)，4.18(1H，m)，4.40(1H，d，6Hz)，4.46(1H，d，6Hz)，4.61(1H，d，6Hz)，5.29(1H，d，3Hz)，5.85(1H，d，3Hz)。
实施例6定量的原理通过标准化面积的百分比方法测定使用还原的溶液获得的色谱法中1，6-脱水物的含量。
将不饱和糖醛酸的摩尔吸收系数定为恒定值并且由此多糖的响应因子与其分子量成正比。
在本发明的方法中，获得了广泛可接受的推定，即包含在混合物中的所有不饱和的寡糖类均具有相同的摩尔吸收度，等于5500mol-1.cm-1。
将两种共同洗脱的1，6-脱水残基，即二糖1和2彼此进行积分。
因此，能够测定起始未分级分离的肝素或分级分离的肝素中解聚混合物的所有成分的重量百分比，例如，诸如1，6-脱水衍生物或乙酰化糖衍生物这类成分。就相当于峰7、8、13和19的4种1，6-脱水衍生物，即二糖1、二糖2、二糖3和四糖1而言，获得了如下的重量百分比
面积8、面积13和面积19相当于峰7、8、13和19各自的面积。这4种化合物各自的摩尔质量分别为443、443、545和1210。∑MwX·面积x相当于色谱图中每个峰的面积与相应产物的摩尔质量之比。
如果Mw为所研究的低分子量肝素的平均质量，那么按照下列方式获得以1，6-脱水环终止的寡糖链的百分比 类似地，可以测定选自未分级分离的肝素和分级分离的肝素的物质样品中其它成分的重量百分比。
确切分子量由色谱图上所有鉴定的峰决定(参见表1)
表1
下面是相当于附图2和3峰编号的糖类的名称1ΔGlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser24-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡糖基钠盐3ΔGlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-CH2-COOH44-脱氧-[α]-L-苏型-己-4-烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃葡糖二钠盐
54-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-α-D-吡喃葡糖基钠盐64-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基二钠盐74-脱氧-[α]-L-苏型-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺酰氨基-p-D-吡喃葡糖二钠盐(二糖1)84-脱氧-α-L-苏型-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃甘露糖二钠盐(二糖2)94-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-a-D-吡喃葡糖基二钠盐104-脱氧-α-L-苏型-己-4-烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-β-D-吡喃葡糖三钠盐114-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-β-D-吡喃葡糖基三钠盐124-脱氧-2-O-磺基-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1o4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-α-D-吡喃葡糖基三钠盐134-脱氧-2-O-磺基-[α]-L-苏型-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸-(1-4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺酰氨基-p-D-吡喃葡糖三钠盐(二糖3)144-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(144)-2-脱氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基三钠盐154-脱氧-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-3-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基)五钠盐164-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基四钠盐174-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-3，6-二-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基)六钠盐184-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-[α]-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸六钠盐194-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-[α]-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-磺酰氨基-β-D-吡喃甘露糖，六钠盐(四糖1)204-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-葡糖醇钠盐214-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-p-D-葡糖醇二钠盐224-脱氧-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-a-D-葡糖醇二钠盐234-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-葡糖醇二钠盐244-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-葡糖醇二钠盐254-脱氧-α-L-苏型-己烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-β-D-葡糖醇三钠盐264-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-葡糖醇三钠盐274-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-α-D-葡糖醇三钠盐28-4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-葡糖醇三钠盐294-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-3-O-磺基-[α]-D-葡糖醇)五钠盐304-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-葡糖醇三钠盐314-脱氧-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖基-糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-3，6-二-O-磺基-[α]-D-葡糖醇)六钠盐324-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-[α]-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-[α]-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸六钠盐(使用NaBH4还原的形式)。
使用的缩写IdoAα-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸；GIcAβ-D-吡喃葡糖基糖醛酸；ΔGlcA4，5-不饱和酸4-脱氧-[α]-L-苏型-己烯吡喃糖基糖醛酸；GalD-半乳糖；Xyl木糖；GIcNAc2-脱氧-2-乙酰氨基-[α]-D-吡喃葡糖；GIcNS2-脱氧-2-磺酰氨基-α-D-吡喃葡糖；2S2-O-硫酸盐；3S3-O-硫酸盐；6S6-O-硫酸盐。
不脱离本发明实质或几本属性的其它具体形式可以包括在本发明中。
权利要求
1.用于对选自未分级分离的肝素和分级分离的肝素的物质样品中成分的量进行定量的方法，包括(a)通过酶方法使所述样品解聚；和(b)通过高效液相色谱法检测步骤(a)的解聚样品中的成分的量。
2.如权利要求1中所述方法，其中使用至少一种肝素酶进行所述酶方法。
3.如权利要求1中所述方法，其中使用肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物进行所述酶方法。
4.如权利要求1中所述方法，其中所述分级分离的肝素为依诺肝素钠。
5.如权利要求1中所述方法，其中步骤(b)中使用的高效液相色谱法为阴离子交换色谱法。
6.如权利要求1中所述方法，其中步骤(b)中使用的高效液相色谱法为强阴离子交换色谱法(SAX)。
7.如权利要求6中所述方法，其中使用SpherisorbSAX柱进行所述强阴离子交换色谱法。
8.如权利要求1中所述方法，其中在可透过具有约200nm-约400nm波长的UV光的流动相中进行高效液相色谱法。
9.如权利要求1中所述方法，其中在流动相中进行高效液相色谱法，所述流动相包括至少一种选自高氯酸钠、甲磺酸盐和磷酸盐的盐。
10.如权利要求1中所述方法，其中在包括高氯酸钠盐的流动相中进行高效液相色谱法。
11.如权利要求6中所述方法，其中在约2.0-约6.5的pH下进行所述强阴离子交换色谱法。
12.如权利要求6中所述方法，其中在约3的pH下进行所述强阴离子交换色谱法。
13.如权利要求1中所述方法，其中所述流动相包括维持在约pH3.0下的高氯酸钠溶液。
14.如权利要求1中所述方法，其中解聚的样品包括至少一种选自如下的寡糖链
15.如权利要求1中所述方法，其中解聚的样品包括至少一种寡糖链，其末端被1，6-脱水键修饰。
16.如权利要求15中所述方法，其中至少一种寡糖链选自如下
17.如权利要求4中所述方法，其中解聚的样品包括至少一种选自如下任一种的1，6-脱水残基
18.如权利要求17中所述方法，其中至少一种1，6-脱水残基在15％-25％样品的重均分子量的范围。
19.如权利要求1中所述方法，其中在步骤(b)的解聚样品中检测的成分为乙酰化糖类。
20.如权利要求19中所述方法，其中通过从在乙酰化，而不是非乙酰化糖吸收的波长处测定的吸收度中扣除在既包括乙酰化，又包括非乙酰化糖类吸收的波长处测定的吸收度来选择性检测乙酰化糖类。
21.如权利要求19中所述方法，其中所检测的乙酰化糖类选自乙酰化寡糖类ΔIVa、ΔIIa、ΔIIIa、ΔIa、ΔIIa-IVsglu和ΔIIa-IIsglu。
22.依诺肝素钠样品中的1，6-脱水残基的定量方法，包括(a)使用肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物使所述样品解聚；和(b)通过高效液相色谱法检测步骤(a)的解聚样品中1，6-脱水残基的量。
23.如权利要求22中所述方法，其中1，6-脱水残基的量占样品平均寡糖分子量的15％-25％。
24.用于对选自未分级分离的肝素和分级分离的肝素的物质样品中成分的定量方法，包括(a)通过酶方法使所述样品解聚；和(b)还原步骤(a)的解聚样品；(c)通过高效液相色谱法检测(b)的还原样品中成分的量。
25.如权利要求24中所述方法，其中使用至少一种肝素酶进行所述酶方法。
26.如权利要求24中所述方法，其中使用肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物进行所述酶方法。
27.如权利要求24中所述方法，其中通过接触还原剂对步骤(a)的解聚样品进行还原。
28.如权利要求27中所述方法，其中所述还原剂为NaBH4或硼氢化物阴离子的碱金属盐。
29.如权利要求24中所述方法，其中分级分离的肝素为依诺肝素钠。
30.如权利要求27中所述方法，其中所述还原步骤还原了非1，6-脱水形式的依诺肝素钠的还原末端。
31.如权利要求24中所述方法，其中步骤(c)中使用的高效液相色谱法为阴离子交换色谱法。
32.如权利要求24中所述方法，其中步骤(c)中使用的高效液相色谱法为强阴离子交换色谱法(SAX)。
33.如权利要求32中所述方法，其中使用SpherisorbSAX柱进行强阴离子交换色谱法。
34.如权利要求24中所述方法，其中在可透过具有约200nm-约400nm波长的UV光的流动相中进行高效液相色谱法。
35.如权利要求24中所述方法，其中在包括选自高氯酸钠、甲磺酸盐和磷酸盐的至少一种盐的流动相中进行高效液相色谱法。
36.如权利要求24中所述方法，其中在包括高氯酸钠盐的流动相中进行高效液相色谱法。
37.如权利要求32中所述方法，其中在约2.0-约6.5的pH下进行强阴离子交换色谱法。
38.如权利要求32中所述方法，其中在约3的pH下进行强阴离子交换色谱法。
39.如权利要求24中所述方法，其中所述高效液相色谱法使用了包括维持在约pH 3.0下的高氯酸钠溶液的流动相。
40.如权利要求28中所述方法，其中所述解聚样品包括至少一种选自如下任一种的寡糖链 ；其中该寡糖链为其还原形式。
41.如权利要求24中所述方法，其中所述解聚样品包括至少一种末端被1，6-脱水键修饰的寡糖链。
42.如权利要求41中所述方法，其中所述至少一种寡糖链选自如下的任一种
43.如权利要求29中所述方法，其中所述解聚样品包括1，6-脱水残基的混合物，所述1，6-脱水残基包括
44.如权利要求43中所述方法，其中1，6-脱水残基的混合物占样品重均分子量的15％-25％。
45.如权利要求24中所述方法，其中步骤(b)的解聚样品中检测的成分为乙酰化糖类。
46.如权利要求45中所述方法，其中通过从在乙酰化，而不是非乙酰化糖吸收的波长处测定的吸收度中扣除在既包括乙酰化，又包括非乙酰化糖类吸收的波长处测定的吸收度来选择性检测所述糖类。
47.如权利要求45中所述方法，其中所检测的乙酰化糖类选自乙酰化寡糖类ΔIVa、ΔIIa、ΔIIIa、ΔIa、ΔIIa-IVsglu和ΔIIa-IIsglu。
48.依诺肝素钠样品中的1，6-脱水残基的定量方法，包括(a)使用肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物使所述样品解聚；(b)还原步骤(a)的解聚样品；和(c)通过高效液相色谱法检测步骤(b)的还原样品中1，6-脱水残基的量。
49.如权利要求48中所述方法，其中1，6-脱水残基的量占样品重均分子量的15％-25％。
全文摘要
分析肝素或低分子量肝素的方法，其特征在于通过肝素酶的作用使检测的样品解聚，且然后如果合适，还原获得的解聚物且然后通过高效液相色谱法进行分析。
文档编号G01N30/00GK1934135SQ200580009444
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月22日 优先权日2004年3月24日
发明者P·穆里耶, C·维斯科夫 申请人:艾文蒂斯药品公司