一种制备低分子量γ-聚谷氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备低分子量Y -聚谷氨酸的方法，属于工业微生物技术领域。
【背景技术】
[0002]γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物合成的高分子氨基酸聚合物。其对环境无污染，为绿色生物产品，具有极佳的生物可降解性、成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性、保湿性等许多独特的理化和生物学特性。在注重环保、强调可持续发展的今天，这种由生物合成的可降解型功能材料受到人们的青睐，正逐渐地被应用于医药制造，食品加工，蔬菜、水果、海产品的防冻、保鲜，也可开发应用于化妆品工业，烟草、皮革制造业及植物种子保护等许多领域，是一种有极大开发价值和广阔前景的多功能新型生物制品。
[0003]目前γ-PGA的生产公司比较少，且γ-PGA产品以高分子量级别居多。低分子量Y-PGA是通过微生物发酵得到的高粘度γ-聚谷氨酸发酵液经过后期降解得到的。低分子量γ-PGA可用作新型的药物载体，实验表明，γ-PGA用作药物载体的最佳分子量范围是2万?6万，其分子量小，体积小，活泼基团比例大，易与药物结合，形成较稳定的复合物。低分子量γ-PGA具有维持和增强HA(透明质酸)的功能。HA是一种人体皮肤结构的成分，保持皮肤的水润和弹性；实验证明，低分子量γ-PGA能高效抑制透明质酸酶的活性，而且能大大提高HA在透明质酸酶面前的稳定性，从而减缓皮肤里HA的损失。低分子量γ-PGA能提高天然保湿因子水平。天然保湿因子(NFM)是皮肤产生的吸湿物质，可提供位于皮肤最外层的角质层的保湿功能，研宄报告显示，在人类TESTSKIN培养基皮肤，低分子量γ -PGA在低至0.1 %的使用量时可以提高皮肤内在的数种NMF的水平达95 %，皮肤NMF水平的持续增加可促进皮肤的保水性。除此之外，低分子量γ-PGA还具有增强表皮细胞结构完整性、改善皮肤水分和弹性、减少表皮水分丢失及减缓免疫反应等功能。
[0004]由于低分子量γ -PGA制备工艺复杂，生产成本高，尤其是分离纯化和精制工艺方面对于大规模化生产有障碍，且国内众多研发机构及企业在这方面经验不足，研发投入不够，导致产品质量不高，生产能力十分有限，也限制了 γ -PGA的推广应用。
【发明内容】
[0005]针对市场上Y-PGA产品以高分子量级别居多，产品类型较少的状况，本发明的目的是提供一种制备低分子量γ-聚谷氨酸的方法，分离提纯得到高纯度的低分子量γ-PGA产品，丰富γ-PGA产品类型，扩大γ-PGA的应用市场。
[0006]本发明的技术方案是:一种制备低分子量γ -聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007](I)发酵液制备:以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC N0.6772 为生产菌株，发酵生产γ-聚谷氨酸，得到发酵液；
[0008](2)高温酸降解得低分量γ-聚谷氨酸:调节发酵液pH值至3.5?4.0，温度75?100°C，保温降解4-8h，此过程将发酵液中100KDa以上的γ -聚谷氨酸降解为分子量范围为10KDa-500KDa的低分子量γ-聚谷氨酸；待温度降至降温至0_60°C，加入活性炭脱色0-2h，脱色结束后，板框过滤，除菌体、活性炭及杂蛋白，得澄清无色料液；
[0009](3)沉淀析出:料液用盐酸调pH至1.5-3.0，静置12-24h，析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用PH1.5-3.0的纯化水洗至废水无色澄清为止；
[0010](4)沉淀重溶:将经步骤(3)处理得到的白色粉末加入纯化水，并调PH4.5-6.5，搅拌溶解，得到浓度为40%以上的溶液；
[0011](5)带式干燥:将经步骤(4)处理得到的高浓度水溶液经过带式干燥、粉碎得到低分子量Y _聚谷氨酸成品。
[0012]进一步的，所述步骤⑴中发酵液的制备方法，其步骤如下:
[0013]a.种子培养
[0014]将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC N0.6772接种于装有种子培养基的三角瓶中，于35?37.5°C, 180?220r/min摇床震荡培养16_32h，得到种子液；
[0015]b.发酵培养
[0016]将步骤(I)的种子液接种于发酵培养基中，接种量为2?3% (质量比)，于35?37.5°C通气搅拌培养45?50h，得发酵液。
[0017]各培养基成分如下:种子培养基:葡萄糖5?10g/L，酵母提取物3?5g/L，硫酸铵2?10g/L，谷氨酸钠5?10g/L，硫酸镁0.2?2g/L，pH 7.2?7.5，115°C灭菌20min ；发酵培养基:蔗糖、葡萄糖、甘油、柠檬酸中任一种或至少两种的混合物30?150g/L，蛋白胨5?30g/L，酵母提取物5?30g/L，硫酸铵5?20g/L，谷氨酸钠30?100g/L，硫酸镁0.2 ?2g/L，磷酸氢二钾 2 ?10g/L，pH 7.2 ?7.5，121°C灭菌 20min。
[0018]上述发酵过程也可以采用本申请人自己的发明专利中的方法；该专利的申请号:201210555304.5 ;申请日:2012.11.02 ;发明名称:一株产γ -聚谷氨酸基因工程菌及其高产rT _聚谷氨酸方法(见权利要求6及实施例5-6)。
[0019]进一步的，所述步骤(2)中，活性炭用量为发酵液重量的1%?2%，室温搅拌60 ?90mino
[0020]进一步的，所述步骤(5)带式干燥工艺条件为:加热区温度为75?95°C，进样速度为20?30L/h，履带速度为20?30cm/min。
[0021]本发明的有益效果是:
[0022](I)本发明中的高温、酸降解过程将100KDa以上的高分子量γ-PGA降解为10KDa-500KDa的低分子量γ-PGA，丰富了 γ-PGA产品类型，扩大了 γ-PGA的应用市场；
[0023](2)本发明利用在低pH值的澄清液中只有Y-聚谷氨酸沉淀析出的特性，达到了分离纯化高纯度低分子量γ-聚谷氨酸的目的。酸析出沉淀代替醇沉工艺，不仅提高了产品回收率，降低了工业成本和危险性，还节省了能源；
[0024](3)本发明制备的低分子量γ-PGA收率达到85%以上，纯度达到95%以上，提高了产品质量。
【具体实施方式】
[0025]实施例1:
[0026](I)发酵液制备:将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC N0.6772 进行发酵培养，得发酵液，具体步骤包括:
[0027]a.取冰箱内_20°C条件下甘油保藏的菌种I支，接种环接一环种子于装有10ml种子培养基的500ml三角瓶中，于35?37.5°C，200r/min摇床震荡培养24h，得到种子液，菌种浓度达到OD600L 5?2.0 ;
[0028]b.将备好的种子液接种于发酵培养基中，接种量为2.5%，于35?37.5°C通气搅拌培养48h，得发酵液，发酵产量可达67g/l。
[0029]种子培养基:葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，硫酸钱5g/L，谷氨酸钠10g/L，硫酸镁 lg/L，pH 7.2 ?7.5，115°C灭菌 20min ；
[0030]发酵培养基:鹿糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，硫酸钱5g/L，谷氨酸钠50g/L，硫酸镁 lg/L，磷酸氢二钾 10g/L，pH 7.2 ?7.5，121°C灭菌 20min。
[0031](2)低分量γ -聚谷氨酸获取:
[0032]调节发酵液pH至3.5，升温至85°C，保温4h，待温度降至60°C，加入I %的活性炭脱色90min，脱色结束后，板框过滤，除菌体、活性炭及杂蛋白，得澄清无色料液；此过程将发