专利名称：分子量可控聚l-谷氨酸制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基于ニ环己胺引发N-羧酸酐(N-carboxyanhydride,简称NCA)开环聚合，采用新型——三甲基碘硅烷脱保护剂等，去苄基，获得分子量可控的聚L-谷氨酸的制备方法，该制备方法属于高分子材料技术领域。
背景技术：
随着生物科学技术的发展，新一类可降解材料——聚氨基酸材料应运而生，成为研究热点。聚氨基酸的氨基酸単体单元是用酰胺键(氨基和羧基脱去小分子水)连接的。聚氨基酸作为医用材料具有明显优点其在体内可降解生成简单的a-氨基酸，降解产物无毒性。聚氨基酸是ー种重要的生物材料，它们被广泛地应用于载药、生物组织工程和传感器等领域。聚L-谷氨酸是ー种良好的聚氨基酸材料。其分子链上分布着大量的游离羧基，易于用药物来修饰，从而用于特殊药物的载体。由于其具有ー些特殊的性质，如手性、多肽链独特的ニ级结构，显示出与细胞良好的生物相容性，且其在体内能够自行降解成氨基酸单体，降解产物能被机体吸收和排泄，不会在体内积蓄并产生毒副作用，不用再经手术除去，已被广泛应用于药物缓释和生物组织工程领域。目前聚谷氨酸的制备主要有化学合成法(也称NCA法)[Chem. Ber. , 1906, 39:857 861]、提取法[专利ー种Y —聚谷氨酸的高效提取方法.申请号201010608782]和微生物聚合法[Troy FA. Chemistry and biosynthesis of the poly ( Y -D-glutamyl)capsule in bacillus lichenoformis [J]. J Biol Chem, 1973, 248:305 315],提取法的エ艺十分复杂，生产成本较高；微生物聚合法中培养基的配制受到各种因素的制約，因而生产エ艺也比较繁琐，并且所得到的聚Y -谷氨酸分子量在100万以上，不适合于在生物医药和组织工程领域应用；而NCA法是肽类合成的重要方法，它可以控制调节聚合物的分子星[E. Katchalskl. “Advance in Protein Chemistry, ” [M」Vol. VI. Academic Press,Inc, New York, N. Y. 1951: 123 185]。对于聚L-谷氨酸(PLGA)的化学合成，目前文献中使用的引发剂主要是三こ胺，脱保护时所采用的方法主要是酸法[E. R. BL0U. High Molecular WeightPoIy-a，L—glutamic Acid: Preparation and Optical Rotation Changes.Vol. 80，4630-4634]、碱法[Willy Agut et al. Langmuir 2007，23，11526-11533]或 Pd/C催化法[Peter Dubruel et al. Biomacromolecules. 2003，4，1168-1176]。目前化学法合成的聚L-谷氨酸最突出的问题是合成条件苛刻(需在手套箱中操作)，而且用酸法和碱法脱保护时，聚合物分子链容易断裂，而Pd/C催化法脱保护则耗时耗能，且成本较高，产率低，聚合物分子量不易控制[Adv. Polym. Sci. 2006, 202, 1-18]。本发明g在开发出一种新的合成聚L-谷氨酸的引发剂和脱保护剂，不仅使聚L-谷氨酸分子量容易控制，而且脱保护时不易断链，同时可实现批量合成，产率高，一次试验可合成聚L-谷氨酸量较多，可达几十克，从而使聚L-谷氨酸在生物医药和组织工程领域的应用成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种易于控制聚L-谷氨酸(Poly(L-glutamic acid),简称PLGA)分子量的引发剂，在常压下采用新型脱保护剂——三甲基碘硅烷脱去聚L-谷氨酸-Y -节酯(Poly ( y -benzyl-L-glutamate),简称PBLG)上的节基,避免聚合物分子链断链，能够获得不同分子量的聚L-谷氨酸，以满足其在生物医药及组织工程领域的应用。根据的反应机理可结合附图(1)，其中1) Y-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(y -benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride,简称BLG-NCA)合成的反应机理或过程；2)以ニ环己胺为引发剂聚合得到聚L-谷氨酸-Y-苄酯制备过程。然后采用三甲基碘硅烷脱去聚L-谷氨酸-Y-苄酯上的苄基制备聚L-谷氨酸。 据反应机理，可采用如下技术实施方案，以实现本发明的目标实现ニ环己胺引发N-羧酸酐(N-carboxyanhydride,简称NCA)开环聚合,可得到分子量可控的聚L-谷氨酸产物，其中包括ニ环己胺引发Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐聚合，继而制备聚L-谷氨酸-Y -苄酯，后采用三甲基碘硅烷，脱去聚L-谷氨酸-Y-苄酯上的苄基。获取了分子量可控的聚L-谷氨酸。其中有两个过程
A. ニ环己胺引发Y-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐制备聚L-谷氨酸-Y-苄酷
(I)在金属钠存在的条件下，减压蒸馏ニ环己胺，以除去ニ环己胺中残留的水分，并将其在无水、无氧条件下储存。(2)在干燥的反应瓶内加入BLG-NCA，抽真空，充氮气，反复三次，再注入溶剂ニ氧六环；待其充分溶解后注入引发剂ニ环己胺，単体BLG-NCA与引发剂的摩尔比，即M/I为M/I在50:1到200:1之间，搅拌均匀后，置于低温恒温槽中，温度控制在15-20°C，至反应液变为粘稠液，将反应液缓慢倒入无水こ醇中沉淀，此时有白色纤维状物质析出，经过滤，真空干燥，得白色纤维状聚合物，即为PBLG。B.采用三甲基碘硅烷脱去PBLG上的苄基制备聚L-谷氨酸(PLGA):将PBLG溶于新蒸的ニ氯甲烷中，再按I克PBLG加入0. 3-0. 4毫升的三甲基碘硅烷的比例，将三甲基碘硅烷倒入反应器，并搅拌，在40-50°C温度下反应8-12小吋，将反应液倒入水饱和的正己烷中沉淀，抽滤，并用无水こ醚和大量去离子水冲洗数遍后，干燥可得白色块状产物，即为PLGA0上述步骤B中，所用的単体BLG-NCA与引发剂ニ环己胺的摩尔比，即M/I (M-単体BLG-NCA, I-引发剂ニ环己胺)分别为 50:1，100:1，150:1 和 200:1
上述方法中，控制单体BLG-NCA与引发剂ニ环己胺的摩尔比，所合成的聚L-谷氨酸的分子量在I. 2-5. OX IO4之间。同现有技术相比，本发明具有如下突出优点本发明方法中使用ニ环己胺作引发齐IJ，ニ氧六环作溶剂，可通过调节M/I比值，以制备不同分子量的PBLG ;使用三甲基碘硅烷作为PBLG上苄基的脱保护剂，不会导致聚合物分子断链，可利于进一歩制得不同分子量的PLGA。如上所述，本发明以L-谷氨酸为原料，合成了 BLG-NCA，并以其为单体，优化选择溶齐U、引发剂和脱保护剂，合成了不同分子量的PBLG。又在常压下，采用脱保护剂三甲基碘硅烷脱去苄基，得到几乎无分子断链的不同分子量的PLGA。
所得聚合物用凝胶渗透色谱(GPC)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、核磁共振氢谱(1H-NMR).粘度法等手段进行了表征，产品的相关结构和分子量都得到了证实。
图I制备聚L-谷氨酸-Y-苄酯或聚L-谷氨酸前驱工作的反应机理1) Y-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(Y -benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride,简称 BLG-NCA)合成的反应机理或过程；2)以ニ环己胺为引发剂聚合得到聚L-谷氨酸-Y-苄酯制备过程。
图2以ニ环己胺为引发剂聚合得到的PBLG的GPC谱图与GPC测试结果包括数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和分子量分布(Mw/Mn)等若干參数。图3在实施例一、ニ、三和四中，PLGA分子量对M/I所作的图。图4 PBLG与PLGA的傅里叶红外光谱(FT-IR)图比较。图5 PBLG的1H-NMR谱图，其中a, b , c, f, g, h, i, j是上图示分子式的1H
位谱线。图6 PLGA 的1H-NMR 谱图，其中a，b , c, d, e, f, g, h, i, j 是上图示分子
式的1H位谱线。图7 三种脱保护方法，脱去苄基后PLGA分子量比较含采用三甲基硅碘烷(Me3SiI)脱保护后的PLGA分子量，明显高于酸法(HBr)和碱法(NaOH)脱保护后脱去苄基后的PLGA分子量，第一峰位值即为三甲基硅碘烷(Me3SiI)脱保护PLGA分子量。
具体实施例方式实施例一
I.Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG-NCA)的合成
A.L-谷氨酸-Y-苄基酯(BLG)的合成在三ロ烧瓶中加入IOOg L-谷氨酸和83ml苯甲醇，将三ロ烧瓶置于60-80°C油浴中搅拌，当温度恒定吋，缓慢滴加60%浓硫酸80ml，待反应液澄清后，停止搅拌和加热。待其冷却至室温后，将反应液缓慢倒入800ml溶有108g碳酸氢钠的过饱和冰水溶液中，充分搅拌均匀后放入冰箱内冷冻3-4小时。抽滤后得到的滤饼用1200ml 80°C的蒸馏水溶解，然后自然冷却至室温，再冷冻3小时左右，抽滤，滤饼用蒸馏水和こ醇分别清洗三次，室温真空干燥24小时，得到白色鱗片状物质即为BLG。B.在干燥的250ml两ロ烧瓶内加入IOg新制备的BLG和IOOml新蒸的四氢呋喃，将烧瓶置于50°C的集热式搅拌器中，反复进行三次抽真空-通氮气，当温度恒定吋，加入
5.5g用氯仿重结晶过的双(三氯甲基)碳酸酯(俗称“三光气”)，至反应液变澄清，停止搅拌和加热。自然冷却至室温后，在強烈搅拌下，将反应液倒入500ml冰冻的石油醚中沉淀，过滤，得白色晶体为BLG-NCA初产品。将所得初产品溶于IOOmlこ酸こ酯中，然后加入等体积的新蒸石油醚进行重結晶，过滤，滤饼用50mlこ酸こ酯溶解后加入50ml左右石油醚进行重结晶，如此反复重结晶三次后得到聚合级単体，室温下真空干燥12h，得到白色针状晶体即为BLG-NCA，产率约为70%。2. ニ环己胺引发BLG-NCA制备聚L-谷氨酸-Y _苄酯(PBLG)
在烘干的反应瓶内放入Ig Y -苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐単体，抽真空通氮气，反复进行三遍，注入15ml新蒸的ニ氧六环，单体溶解后注入计量(与单体的摩尔比为50:1)的处理过的ニ环己胺，混合均匀后室温静置3天，反应液变得十分粘稠。在強烈搅拌下，将此反应液倒入过量的无水こ醇中，此时有大量白色纤维状物质析出。经过滤后，真空干燥24h，所得聚合物即为PBLG。3.采用三甲基碘硅烷脱去PBLG上的苄基制备聚L-谷氨酸(PLGA)
室温下，取新制备的PBLG溶于新蒸的ニ氯甲烷中，再按IgPBLG加入0. 3-0. 4ml三甲基碘硅烷溶液的比例加入三甲基碘硅烷(或与之具有类似结构的三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷)，置于35-45°C集热式搅拌器中恒温10-12h，待其自然冷却后，将反应液缓慢倒入无正己烷中沉淀，过滤并反复用石油 醚和蒸馏水分别洗涤三遍，真空干燥24h，得到白色块状物质，即为PLGA，分子量约为I. 2 X 104，转化率约为65%。实施例ニ 本实施例与实施例一基本相同，所不同的是单体与ニ环己胺的摩尔比为100:1，在步骤3中，所用的三甲基碘硅烷(或与之同类结构三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷)，加入量不变。最终可得到分子量为2. 5 X IO4左右的PLGA，转化率约为70%。实施例三本实施例与实施例一基本相同，所不同的是单体与ニ环己胺的摩尔比为150:1。在步骤3中，所用的三甲基碘硅烷(或与之同类结构三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷)加入量不变。最终可得到分子量为3. 5 X IO4左右的PLGA，转化率约为78%。实施例四本实施例与实施例一基本相同，所不同的是单体与ニ环己胺的摩尔比为200:1。在步骤3中，所用的三甲基碘硅烷(或与之同类结构三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷)加入量不变。最终可得到分子量为5. OX IO4左右的PLGA，转化率约为70%。图3——反映在上面所述实施例一、ニ、三和四中，PLGA分子量对M/I所作的图。
权利要求
1.一种基于引发剂使N-羧酸酐(N-carboxyanhydride,简称NCA)开环聚合,及脱保护剂应用，合成得到分子量可控的聚L-谷氨酸的制备方法，其特征在于该方法包括如下エ艺过程和步骤 A.ニ环己胺引发Y-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG-NCA)制备聚L-谷氨酸-Y-苄酯(PBLG) (1)在金属钠存在的条件下减压蒸馏ニ环己胺，以除去ニ环己胺中残留的水分，并将其在无水无氧条件下储存； (2)在干燥的反应瓶内加入BLG-NCA，抽真空充氮气，反复三次，再注入溶剂ニ氧六环；待其充分溶解后注入引发剂ニ环己胺，单体BLG-NCA与引发剂的摩尔比，即M/I在50:1到200:1之间，搅拌均匀后置于低温恒温槽中，温度控制在15-20°C，至反应液变为粘稠液，将反应液缓慢倒入无水こ醇中沉淀，此时有白色纤维状物质析出，经过滤，真空干燥，得白色纤维状聚合物，即为PBLG ； B.采用三甲基碘硅烷或类似结构硅烷等作脱保护剂，脱去PBLG上的苄基制备聚L-谷氨酸(PLGA)Jf PBLG溶于新蒸的ニ氯甲烷中，再按0. 8-1. 0克PBLG加入0. 3-0. 4毫升的三甲基碘硅烷的比例加入三甲基碘硅烷，在40-50°C温度搅拌，反应8-12小吋，将反应液倒入水饱和的正己烷中沉淀，抽滤，并用无水こ醚和大量去离子水冲洗数遍后，干燥可得白色块状产物，即为PLGA。
2.根据权利要求书I所述的，基于引发剂及脱保护剂从NCA开环聚合，及脱保和剂应用，得到分子量易控的聚L-谷氨酸的制备方法，其特征在于步骤A中所用的単体BLG-NCA与引发剂ニ环己胺的摩尔比应为M/I=50:1-200:1 ;并通过三甲基碘硅烷、或与之具有类似结构的三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷等，脱去聚合物链上的苄基后，聚合物分子不会断链，所得聚レ谷氨酸的分子量范围在I. 2X104-5. OXlO4之间，产率65%—78%，产量数十克。
全文摘要
本发明涉及一种由引发剂引发N-羧酸酐(N-carboxyanhydride，简称NCA)的开环聚合，并通过脱保护后，从而获得分子量容易控制的，聚L-谷氨酸的制备方法，此发明属于高分子材料技术领域。其目的和要点在于与原有技术相比，引发剂为二环己胺，可有效控制聚L-谷氨酸分子量；三甲基硅碘烷为脱保护剂，可避免了聚合物分子断链。从而使制备的聚L-谷氨酸分子量分布较窄。此法制备条件温和，分子量容易控制，适合于聚L-谷氨酸规模合成，以满足此材料在生物医用和组织工程领域的应用需求。
文档编号A61K47/34GK102617851SQ201210091218
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者刘志文, 尹静波, 张鑫, 王志春, 陈学思, 颜世峰 申请人:上海大学