细胞凋亡显像药物⁶⁸Ga-NOTA-Duramycin及其制备方法

专利名称：细胞凋亡显像药物⁶⁸Ga-NOTA-Duramycin及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于检测细胞凋亡的显像药物，特别涉及以磷脂酰乙醇胺为结合靶点的显像药物及其制备方法。
背景技术：
细胞凋亡是一种主动发生的、受基因严密调控的细胞逐渐死亡现象，在许多疾病， 如心血管疾病和肿瘤的发生、发展和转归中都具有重要的作用。细胞凋亡是心梗早期心肌细胞的主要死亡形式，也是梗死范围扩大的独立预后因子；心肌细胞凋亡的持续存在和活性细胞的持续性缺失，是心衰进行性发展的主要机制； 心肌细胞凋亡增多也是心肌炎发展为扩张型心肌病，进而发展为心衰的重要机制之一。肿瘤的发生主要是由于细胞内癌基因、抑癌基因及其他相关调节基因突变，从而使细胞基因组失去稳定性。正常情况下，当修复机制不能完成损伤修复时，细胞凋亡机制将启动，异常细胞将被吞噬细胞识别而清除。如果调节机制出现障碍，凋亡机制不能正常启动，带有不稳定基因组的细胞发生失控性增殖，就很可能产生高度恶化状态的肿瘤细胞。在细胞癌变过程中，许多凋亡活化基因功能受阻，而凋亡抑制基因的功能得到增强。研究发现，许多肿瘤的发生机制就是由于凋亡受阻引起的。在肿瘤治疗方面，选择性诱导肿瘤细胞凋亡是目前最主要的治疗策略和目标。临床上采用的放射治疗、大多数化疗药物和生物治疗剂都是主要通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞的，以诱导细胞凋亡为目标的基因治疗也是目前重要的研究方向。因此，细胞凋亡的检测对于心血管疾病和肿瘤的诊断和疗效监测都具有极为重要的临床意义。分子影像技术被认为是检测细胞凋亡最有效的无创性方法。目前，国内外研究较多的分子探针是99mTc-AnnexinV,它能与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸(PtdS)位点特异结合。研究表明=99mTc-AnnexinV显像能够显示心肌、血管、肿瘤、炎症等组织的凋亡细胞，在急性心肌梗塞、心肌炎、心脏移植排异反应、不稳定动脉粥样硬化斑块、肿瘤化疗等方面有一定的应用价值。但99mTc-AnnexinV还存在着明显的不足,一是AnnexinV分子量较大 (36kDa)血液清除较慢，早期成像图像质量欠佳；二是用于单光子核素成像，分辨率受限； 三是生产成本高，价格昂贵。因此，该显像剂的实际应用受到了很大限制，目前的市场表现也不理想。

发明内容
为克服上述不足，本发明的目的在于提供一种更为理想的细胞凋亡显像剂 68Ga-NOTA-Duramycin,其主要特点在于针对的结合祀点为磷脂酰乙醇胺(PtdE),其主要结构Duramycin (耐久霉素)由19个氨基酸组成,与双功能螯合剂1,4, 7-三氮杂环壬烧-I, 4_7_ 三乙酸(I, 4, 7-triazacyclononane-l, 4, 7-triacetic acid,NOTA) I禹合，后者提供放射性正电子核素68Ga标记位点。与99mTc-AnnexinV 相比，68Ga-NOTA-Duramycin 具有明显的优势。首先，Duramycin分子量仅为2KD，远小于AnnexinV，因此血液清除较快，放射性本底较低，可提高早期图像质量；第二，Duramycin的结合位点PtdE在细胞膜磷脂中占约20%,是其含量是AnnexinV 结合位点磷脂酰丝氨酸(PtdS)的3 4倍；第三,68Ga-NOTA-Duramycin用于正电子核素显像(PET)，其分辨率明显高于单光子核素显像(SPECT)。为达到上述目的，本发明的主要技术方案如下由链酶菌属肉桂地菌DSM40005表达和后翻译修饰合成Duramycin ;化学偶联制备出NOTA-Duramycin ;采用直接标记法,取 PH4. 2,0. IM的乙酸-乙酸钠缓冲液150 u L加入到含50 y g NOTA-Duramycin的标记瓶中， 20°C轻轻振荡混匀5min，然后加入放射性活度为370 740MBq (10 20mCi)、体积为100 300 ii L的68Ga淋洗液，轻轻振荡混匀后静置15min，得到68Ga-NOTA-Duramycin。进一步地,是68Ga-NOTA-Duramycin作为显像剂用于检测心肌缺血损伤后心肌细胞凋亡方面的应用。进一步地，是68Ga-NOTA-Duramycin作为显像剂用于化疗后检测肿瘤细胞凋亡方面的应用。


图I68Ga-NOTA-Duramycin 高压液相分析(HPLC)结果；图2实验猪缺血再灌注损伤模型PET/CT显像可见心肌局灶性异常放射性浓聚影;图3实验猪心肌组织病理凋亡分析结果HE染色可见大量的核碎片、核固缩(左图)；TUNEL染色显示大量黄染的凋亡细胞(右图)；图4非小细胞肺癌裸鼠模型Micro PET显像结果化疗后24h，肿瘤部位有明显的放射性摄取(右图)，而未化疗(对照)组肿瘤部位未见明显的放射性摄取增高(左图)。
具体实施例方式一 . 68Ga-NODA-Duramycin 的制备方法I. Duramycin的表达和纯化链酶菌属肉桂地菌DSM40005表达和后翻译阶段修饰而成带有特殊氨基酸残基的硫醚抗生素，修饰肉桂霉素的结构基因(cinA)生成Duramycin。2. NOTA-Duramycin 的合成Duramycin溶解在二甲基酰胺溶液中，三乙胺溶液调整PH值至9. 0， p-SCN-Bn-NOTA加入反应体系中，室温下反应2h，三氟醋酸加入后去除保护基团。反应结束后，NOTA-Duramycin过柱分离和纯化后,经质谱确认,冻干后备用。3.68Ga 的淋洗用5ml注射器抽取0. 05M HCl 5mL对锗-镓发生器进行淋洗，淋洗流速lmL/min， 同时收集流出液，每瓶lmL，共5瓶。对每只淋洗瓶进行活度检测，取活度最大的一瓶用于标记。
4.68Ga-NOTA-Duramycin 的标记取PH4. 2,0. 2M的乙酸-乙酸钠缓冲液150 u L加入到含50 y g NOTA-Duramycin 标记瓶中，20°C轻轻振荡混匀5min，然后加入放射性活度为370 740MBq(10 20mCi)，体积为100 300 i! L的68Ga淋洗液，轻轻振荡混匀后静置15min。5.质量控制HPLC的分析条件色谱分析柱为C18柱(4. 6 X 250mm)，流动相A为磷酸盐缓冲液 (0. I %三氟醋酸)，流动相B为CH3CN (0. 1%三氟醋酸)。流速为lml/min，0 5min :流动相 B，10% ；30min :流动相B，90%。检测紫外波长为220nm，柱温20°C。放射性检测应用HPLC 专用放射探测器。HPLC分析结果显示68Ga-N0TA-Duramycin的放射性出峰时间为16min (图
I)，标记率为92. 5 ±2. I % (n = 10)，无需进一步纯化。6.体外稳定性测定68Ga-NOTA-Duramycin 标记后 30min、60min 和 120min 分别用 HPLC 测定其放射化学纯度。取标记物100 yL，加入人血清400 yL，混匀后用同样方法测定其放化纯。结果显示 68Ga-NOTA-Duramycin 标记后 30min、60min 和 120min 的放化纯分别为 93%、93% 和 92%， 加入血清后放化纯分别为92. 5%、92%和92%。二 . 68Ga-NOTA-Duramycin在正常小鼠体内的生物学分布健康Balb/c小鼠12只，体重(20 ± 2) g，6 8周龄，分4组(每组3只)，尾静脉注射68Ga-NOTA-Duramycin 100 u Ci，分别在5，15，30，60min将各组小鼠处死，取心、肝、脾、
肺、肾、胃、肠等主要脏器并称重，用Y计数器测量其放射性。经时间衰减校正后，计算每克组织百分注射剂量率ID/g)。68Ga-NOTA-Duramycin 在正常小鼠体内的分布见表 I，68Ga-NOTA-Duramycin 从血液、心、肝中清除较快；肾脏放射性分布较多，注射后60min时摄取为8. 12±2. 74% ID/g，表明该显像剂主要经肾脏排泄。早期心脏、肝脏、肺有少量放射性摄取，但随时间延长，放射性摄取迅速减少，注射60min后，心脏和肝脏的摄取仅为1. 05 ± 0. 31 % ID/g和0. 97 ± 0. 28 % ID/g。该显像剂在胃、肠、脾、胰中有少量分布，脑组织摄取很少，表明该显像剂不能透过血脑屏障。
表I正常小鼠注射68Ga-NOTA-Duramycin后不同时间点各脏器放射性摄取％ ID/g
权利要求
1.一种细胞凋亡显像药物68Ga-NOTA-Duramycin,其主要结构是由19个氨基酸组成的Duramycin与双功能螯合剂I，4, 7-三氮杂环壬烧-1,4-7-三乙酸(1,4, 7-triazacyclononane-l, 4, 7-triacetic acid,NOTA) f禹合，以直接标记法进行核素 68Ga 标记，所述放射性药物为无色透明液体针剂。
2.权利要求I中所述的68Ga-NOTA-Duramycin放射性药物的制备方法,其特征在于所述方法包括以下步骤a.Duramycin溶解在二甲基酰胺溶液中，三乙胺溶液调整PH值至9. 0，p-SCN-Bn-NOTA 加入反应体系中，室温下反应2h，三氟醋酸加入后去除保护基团，反应结束后， NOTA-Duramycin过柱分离和纯化后,经质谱确认,冻干后备用；b.用5ml注射器抽取0.05MHCl 5mL对锗-镓发生器进行淋洗，淋洗流速ImL/ min,同时收集流出液，取PH4. 2，0. 2M的乙酸-乙酸钠缓冲液150 y L加入到含50 y g NOTA-Duramycin标记瓶中，20°C轻轻振荡混匀5min，然后加入放射性活度为370 740MBq(10 20mCi)，体积为100 300 y L的68Ga淋洗液，轻轻振荡混匀后静置15min ；c.HPLC的分析条件色谱分析柱为C18柱(4. 6 X 250mm)，流动相A为磷酸盐缓冲液 (0. I %三氟醋酸)，流动相B为CH3CN (0. 1%三氟醋酸)，流速为lml/min，0 5min，流动相 B，10%，30min,流动相B，90%，检测紫外波长为220nm，柱温20°C。
3.68Ga-NOTA-Duramycin作为显像剂用于检测心肌缺血损伤后心肌细胞凋亡方面的用途。
4.68Ga-NOTA-Duramycin作为显像剂用于化疗后检测肿瘤细胞凋亡方面的用途。
全文摘要
本发明涉及一种细胞凋亡显像药物68Ga-NOTA -Duramycin，其主要特点在于针对的结合靶点为凋亡细胞表面的磷脂酰乙醇胺，其主要结构Duramycin由19个氨基酸组成，与双功能螯合剂1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4-7-三乙酸(1，4，7-triazacyclononane-1，4，7-triacetic acid，NOTA)耦合，以直接标记法进行核素68Ga标记。所述放射性药物为无色透明液体针剂。用于检测心肌缺血损伤后心肌细胞凋亡和化疗后肿瘤细胞凋亡。
文档编号A61K103/00GK102614536SQ201210091388
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者华子春, 方纬, 汪蕾, 王峰 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院, 南京市第一医院