一种利用表面展示谷氨酸脱氢酶的全细胞测定l-谷氨酸含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和分析技术领域，具体地说是一种利用表面展示谷氨酸脱氢 酶的全细胞测定L-谷氨酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] L-谷氨酸是一种重要的氨基酸，在生物体的新陈代谢中占有重要地位，参与动物、 植物和微生物中的许多重要化学反应。L-谷氨酸是蛋白质的主要构成成分。L-谷氨酸盐在 自然界普遍存在，多种食品以及人体内都含有L-谷氨酸盐，L-谷氨酸主要用于生产味精、 香料，以及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等。L-谷氨酸本身可用作药物，参与脑内蛋 白质和糖的代谢，促进氧化过程，该品在体内与氨结合成无毒的谷酰胺，使血氨下降，减轻 肝昏迷症状。
[0003] 目前，定量检测L-谷氨酸的常用方法有瓦式呼吸仪和谷氨酸自动分析仪法，虽然 该方法精度比较高，但其设备投入大、技术要求高。高效液相色谱检测法测定谷氨酸的线性 范围为10-200μΜ，荧光检测谷氨酸的线性范围和检测限分别为4-20μΜ和3μΜ，但是这 些方法耗时长，设备费用高，而且检测灵敏度和选择性都不理想。近年来开发出多种检测 L-谷氨酸的生物传感器，如氧电极上固定有谷氨酸氧化酶的传感器检测谷氨酸的线性范围 和检测限分别为68-1271 μ Μ和68 μ Μ，修饰聚邻苯二胺/谷氨酸脱氢酶的电化学传感器检 测谷氨酸的线性范围和检测限分别为5-78和3. 8 μ Μ，该方法的缺点是需要花费大量的时 间、人力和财力进行酶的纯化和固定。因此，建立一种快速、灵敏、特异的L-谷氨酸检测方 法势在必行。
[0004] 细菌表面展示是指将外源蛋白或多肽与细菌表面锚定蛋白融合或嵌合并活性表 达于细菌表面。此技术解决了上述酶提取和纯化过程复杂以及固定化稳定性低等难题。至 今为止已开发出多种不同类型的锚定蛋白，例如：冰核蛋白和α-凝集素等，该技术在微 生物学、分子生物学和疫苗学等多个领域的基础和应用研究中得到了广泛应用。冰核蛋白 (ice-nucleation protein, ΙΝΡ))是丁香假单胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶 形成。INP由C端结构域、N端结构域和中间重复单元组成，其N端通过糖基磷脂酰肌醇而 锚定在细菌表面，此性质有利于大分子蛋白的表面呈现。
[0005] 谷氨酸脱氢酶（Gldh) (EC 1.4. 1.2-1. 4. 1.4)在生物体内广泛存在。L-谷氨酸 在Gldh的催化下，借助于辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+)，被氧化成α -酮戊 二酸，辅酶NADP+则被还原为还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)。目前国内 外对于Gldh在微生物表面展示的研究还未见报道。在酶的来源方面，研究人员从嗜热菌 Thermococcus waiotapuensis中分离得到一种耐高温的Gldh,以L-谷氨酸为底物进行酶 促反应时最适温度是70°C。另外，与已报道的Gldh相比，该酶对L-谷氨酸的特异性高，即 当以L-谷氨酸以外的其他类似物作为底物时，Gldh不发挥催化活性。因此，在生物催化和 生物传感领域，该酶将具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种利用表面展示有谷氨酸脱氢酶的全细胞测定L-谷氨酸 含量的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种利用表面展示有谷氨酸脱氢酶的全细胞测定L-谷氨酸含量的方法，通过构 建谷氨酸脱氢酶细菌表面展示系统，并利用紫外分光光度计检测信号，从而计算得到L-谷 氨酸的含量。
[0009] 具体的是，构建基于冰核蛋白的谷氨酸脱氢酶细菌表面展示全细胞；再向含全细 胞和辅酶NADP +的Tris-HCl (pH 8. 0)缓冲液中加入待测样品，酶促反应后测定340nm处的 光吸收值，根据标准曲线得出待测样品中L-谷氨酸的含量。
[0010] 所述表面展示系统为编码目标蛋白谷氨酸脱氢酶的基因序列gldh以及负责跨膜 定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N ;
[0011] 其中以菌株 Thermococcus waiotapuensis 基因组 DNA 为模板，Gldh-F/Gldh-R 为 引物，进行PCR扩增，得到编码谷氨酸脱氢酶的基因片段gldh ;
[0012] 引物是 Gldh-F: 5' -CGCGGATCCATGGTTGAACTCGACCCGTTTGAAATGG-3' 和 Gldh-R: 5' -CCCAAGCTTTCAGTGCTTGACCCATCCGCGG-3 '。
[0013] 所述编码目标蛋白谷氨酸脱氢酶的基因序列gldh以及负责跨膜定位和转运的冰 核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N融合，重组质粒转入表达菌株，在诱导剂的存在下表 达出融合蛋白，得到谷氨酸脱氢酶细菌表面展示全细胞。
[0014] 检测原理是L-谷氨酸在菌体表面的谷氨酸脱氢酶的催化下，借助于辅酶烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +)被氧化成α-酮戊二酸，辅酶NADP+则被还原为还原态的烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)。NADPH在340nm处有特征吸收峰，因此可以根据340nm处 的吸光值来求得L-谷氨酸的含量。
[0015] 本发明的效果是：
[0016] 1.本发明利用冰核蛋白表面展示系统将谷氨酸脱氢酶稳定地展示在细菌的表面， 从而解决了胞内酶提取过程复杂和稳定性低的难题，本发明细菌表面展示的谷氨酸脱氢酶 在4°C条件下放置一个月之后，全细胞能保持100%的活性，进而为下一步的测定提供最优 的材料。
[0017] 2.本发明细菌表面展示的谷氨酸脱氢酶特异性好，以其他氨基酸（如：天冬氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甘 氨酸）为底物时，表面展示有谷氨酸脱氢酶的全细胞无活性，即其他氨基酸对L-谷氨酸的 测定没有干扰。
[0018] 3.本发明测定L-谷氨酸含量的方法灵敏度高，具有较宽的检测范围（4-400 μ M) 和较低的检测限（2 μ Μ)。
[0019] 4.通过本发明提供的细菌表面展示系统建立了 L-谷氨酸快速检测的方法。此 方法灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低，可用于鲜味剂、食品调味剂等食品行业，营养 药物、表面活性剂等日用品和医药行业，以及发酵、生物转化、生物能源等生物过程领域中 L-谷氨酸的监测。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例提供的编码谷氨酸脱氢酶的基因的PCR产物电泳图。其中， A是DL5000分子量标准；B是基因 gldh的PCR产物胶回收条带。
[0021] 图2为本发明实施例提供的谷氨酸脱氢酶细菌表面展示系统的载体构建流程图。
[0022] 图3为本发明实施例提供的紫外分光光度计检测L-谷氨酸的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0023] 本发明目的、功能及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
[0024] 本发明构建谷氨酸脱氢酶细菌表面展示系统，利用紫外分光光度计检测信号，从 而得到L-谷氨酸的含量，进而用于L-谷氨酸的快速检测，具体为：
[0025] 1.构建基于冰核蛋白的谷氨酸脱氢酶细菌表面展示全细胞；
[0026] 2.制作L-谷氨酸检测的标准曲线；
[0027] 3.测定实际样品中的L-谷氨酸，根据标准曲线计算得出L-谷氨酸的含量。
[0028] 实施例1
[0029] 细胞表面展示谷氨酸脱氢酶菌体的获得：
[0030] 1.重组表达载体的构建。
[0031] 编码Gldh的基因最初来自于T. waiotapuensis的基因组。gldh基因通过PCR反 应扩增得到，反应程序为：94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，35个循环。PCR反 应的正向引物P1和反向引物P2分别是 ：
[0032] P1 为 5, -CGCGGATCCATGGTTGAACTCGACCCGTTTGAAATGG-3'
[0033] P2 为 5, -CCCAAGCTTTCAGTGCTTGACCCATCCGCGG-3,，
[0034] 其中，BamHI和Hindlll作为限制性内切酶的酶切位点。PCR反应体系为：ddH20 34. 7 μ L，模板 DNA lyL，10XPCR Buffer(Mg2+Free)5yL，MgCl2(25mmol/L)3yL，弓 | 物 PI(20pmol/μ L)1 μ L,引物 P2(20pmol/μ L)1 μ L, dNTPMixture (各 2. 5mmol/ L) 4 μ L，TaKaRa Taq? (5U/ μ L) 0. 3 μ L。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收（参 见图1)。PCR产物转入到pMD18-T载体中得到的重组载体被命名为pMDGldh，TA-克隆后 的质粒由BamHI和Hindlll限制性内切酶在相应的位点进行酶切。然后将其导入到具有相 同酶切位点的pTInaPb-N载体（该载体由本实验室利用pET-28a(+)和IN