一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α -酮戊二酸的方法。
【背景技术】
[0002]α -酮戊二酸(a -ketoglutarate，a -KG)是一种重要的生物化合物。作为三羧酸循环的重要中间代谢产物之一，α-酮戊二酸参与氨基酸、糖类、蛋白质以及脂肪代谢等重要生理过程，并且在微生物的碳氮代谢调控中起着重要作用。由于α-酮戊二酸在细胞代谢上的重要性，其被广泛用于食品、医药、精细化工和化妆品行业，市场需求量巨大。特别地，L-精氨酸-α -酮戊二酸(1:1)和L-精氨酸-α -酮戊二酸(2:1)是目前国际市场上销量日益增加的一种氨基酸盐类保健品，作为功能性营养强化剂和护肝药物，主要用于增强体格、促进肌肉的快速增长和恢复、促进肝细胞对营养和能量的吸收、维护肝功能正常等(中国发明专利申请公开号CN104109698A、CN101591271)。
[0003]目前，α-酮戊二酸的生产制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法和酶催化转化法。其中化学合成所使用的大量氰化物、重金属离子、强酸强碱等有害试剂，严重限制该方法在医药、化妆品和食品等行业的应用。微生物发酵法制备α-酮戊二酸，具有生产条件温和、工艺步骤简单、对环境友好等优点。但是其存在生产周期长、产品与发酵产物中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂等缺点，总成本偏高，不适合工业化生产(中国发明专利申请公开号CN101717735A、CN102391977A)。酶催化转化法具有催化反应条件温和、转化率高、转化时间短、反应形成的副产物少，产物易分离等优点，非常适合α -酮戊二酸的工业化生产(中国发明专利申请公开号CN102994467A、CN104109698A、)。
[0004]L-谷氨酸氧化酶(LGOX) [EC1.4.3.11]可以催化L-谷氨酸氧化脱胺生成α -酮戊二酉爱，氨和过氧化氢(Arima J, Tamura T, et al.The Journal of B1chemistry,2003, 134，805-812)。利用大肠杆菌表达系统生产的重组L_谷氨酸氧化酶是胞内酶，它的分离纯化需要经过细胞裂解、亲和层析等处理步骤(Niu P, Dong X，et al.Journal ofB1technology, 2014，179:56-62)。其中的亲和层析虽然具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点，并已成为目前纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一，但它的缺点也很明显，主要包括耗时大、成本高、处理量小等，这些缺陷不但使得这种纯化蛋白质的生产工艺成本较高，而且也限制了其大规模的工业化应用。
[0005]类弹性蛋白多肽(elastin like polypeptides, ELP)是根据弹性蛋白相关序列人工合成的生物大分子，由五肽重复序列VPGXG (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，其中Xaa是除Pro以外的任意一种氨基酸)。ELP具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度细胞中呈溶解状态，在高于相变温度溶液中呈凝聚状态，因此可以用简单的离心法与细胞自身的杂蛋白进行有效分离。ELP融合蛋白仍能保持ELP的可逆相变特性，因此ELP可以作为分离重组蛋白一种很好的工具，并且该分离过程相比亲和纯化，具有简单、价格低廉、易操作等优点，具有工业化应用的前景(中国发明专利申请公开号CN10955960A、CN104725515A)。
[0006]L-谷氨酸氧化酶在大肠杆菌中表达后仅能得到谷氨酸氧化酶的前体，需要通过特殊处理后才能得到成熟的蛋白(Arima J, Tamura T, et al.The Journal ofB1chemistry, 2003, 134, 805-812)。据报道，通过使用金属内肽酶(Arima J, Tamura T,et al.The Journal of B1chemistry, 2003, 134, 805-812)和 Factor X 蛋白酶(中国发明专利公开申请号CN104726472A)的酶切，可获得成熟的L-谷氨酸氧化酶。本发明利用蛋白酶K代替金属内肽酶和Factor X蛋白酶，发现酶切获得的L-谷氨酸氧化酶具有与报道的经金属内肽酶酶切的L-谷氨酸氧化酶同样的酶学特性。因此，本发明将ELP的温度敏感特性与L-谷氨酸氧化酶的酶切特性相结合，将重组大肠杆菌表达的LG0X-ELP融合蛋白用于重组L-谷氨酸氧化酶的快速分离纯化，从而可满足α -酮戊二酸的规模化生产。
【发明内容】
[0007]
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α -酮戊二酸的方法，采用本发明可进一步降低L-谷氨酸氧化酶的生产成本和使用成本，实现大规模的分离纯化L-谷氨酸氧化酶，以满足α -酮戊二酸的规模化生产。
[0008]为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案:
(1) L-谷氨酸氧化酶基因的合成:根据Streptomyces sp.X_119_6的L-谷氨酸氧化酶的原始基因序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化，并进行L-谷氨酸氧化酶基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用Afcol和及01酶切位点并连接到原核表达载体pET28a (+)上，获得融合表达载体pET28a-LG0X。优化的L-谷氨酸氧化酶基因序列如SEQ N0.1所示。
[0009](2)融合表达载体pET-LGOX-ELP的构建:根据L-谷氨酸氧化酶基因序列，设计一对引物，上游引物:5 ’ -CATGCCATGGGCACGACCGATACTGC
AAGAAGGC-3 '下游引物:5 ’ -CCCTCGAGCTAGAATTCCATATGTGAGGTCAAGGCTTCCTCACGCATTG-3 ’，其中上游引物含有Afcol酶切位点，下游引物含有ZAol、EcoRi和Nde\酶切位点。以pET28a-LG0X为模板，通过PCR获得的目的片段，割胶纯化后经Afcol和ΖΑοΙ双酶切后与同样经过双酶切的载体pET28a进行连接，获得载体pET_LG0X。用Ndel和EcoRi对载体pET_EICM_MBP进行双酶切，获得ELP基因片段并与同样经过双酶切的载体pET-LGOX进行连接，获得融合表达载体pET-LGOX-ELP。
[0010](3)将融合表达载体转化到大肠杆菌中:将融合表达载体pET-LGOX-ELP通过热激转化法转到表达菌株Rosetta (DE3)中，然后涂布到含有卡那霉素(Kana)和氯霉素(Chi)的琼脂平板上进行抗性筛选，37°C培养过夜。挑取单菌落，小量扩增后提取质粒，然后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，含有质粒条带的为实验所需的重组大肠杆菌。
[0011](4)LG0X-ELP融合蛋白的表达:将5 μ L甘油菌加入到5 mL含卡那霉素(Kana)和氯霉素(Chi)的LB培养液(1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，pH 7.0)中，37°C，200转/分，摇床培养过夜，次日取1 mL菌液加入到含卡那霉素(Kana)和氯霉素(Chi)的100 mLLB培养基中，37°C下振荡培养至细胞生长密度0D_=0.6-0.8，然后添加异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1 mM，25_28°C下诱导培养8_16 h。
[0012](5)细胞破碎:5000 g 离心 10 min 后收集菌体，用 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液洗涤菌体三次，然后再用0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液重悬，超声破碎后13000 g，4°C离心10 min，取上清，即为粗酶液。
[0013](6)融合蛋白的纯化:在粗酶液中添加硫酸铵至终浓度为0.4 M，37°C水浴10 min使得融合蛋白发生凝聚，13000 g室温离心10 min后，弃上清。用预冷的0.1 M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液重悬沉淀部分，使其重新溶解在缓冲液中。反复几次获得纯的融合蛋白LG0X-ELP。
[0014](7)融合蛋白的酶切:用蛋白酶K对融合蛋白进行4°C过夜酶切，酶切后置于70°C水浴中使得蛋白酶K变性，13000 g，4°C离心10 min后去除变性的蛋白酶K，获得成熟的
L-谷氨酸氧化酶。
[0015](8)酶切前后热稳定性的比较:将LG0X-ELP融合蛋白和成熟的L-谷氨酸氧化酶分别至于一系列不同温度下保温1 h，然后测定所残余酶活。
[0016](9)利用酶切后的L-谷氨酸氧化酶催化生产α -酮戊二酸:在3 L发酵罐中配置含有120 g/L L-谷氨酸的磷酸缓冲液，添加15 U/mL的L-谷氨酸氧化酶和200 U/mL过氧化氢酶后在30 °C，220 rpm下进行转化反应。
[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果是:采用本发明可进一步降低L-谷氨酸氧化酶的生产成本和使用成本，实现大规模的分离纯化L-谷氨酸氧化酶，以满足α -酮戊二酸的规模化生产。
【附图说明】
[0018]图1是本发明L-谷氨酸氧化酶的纯化重组过程图。
[0019]图2是本发明构建的重组L-谷氨酸氧化酶的表达质粒pET28-LG0X的过程图。
[0020]图3是本发明构建的重组L-谷氨酸氧化酶的表达质粒pET-LGOX-ELP的过程图。
[0021]图4 是大肠杆菌 Rosetta (DE3)、Rosetta (DE3)/pET28_LG0X、Rosetta (DE3) /PET28-ELP 和 Rosetta (DE3) /pET-LGOX-ELP 诱导表达后目标蛋白的 SDS-PAGE 电泳图。
[0022]图5是融合蛋白经一轮ITC纯化后的SDS-PAGE电泳图。
[0023]图6是融合蛋白经酶切前后对热稳定性的图。
[0024]图7是成熟的L-谷氨酸氧化酶催化谷氨酸生产α -酮戊二酸的曲线图。
[0025]图8是融合蛋白的亲和纯化表。
图中说明:
图4、图5中:Μ表示目标蛋白，1表示大肠杆菌Rosetta (DE3)，2表示Rosetta (DE3) /pET28_LG0X，3 表不 Rosetta (DE3) /pET28_ELP，4 表不 Rosetta (DE3) /pET-LGOX-ELP。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做一个详细的说明。
[0027]如图1?图8所示的一种利用L-谷氨酸氧化酶