一种诱导型慢病毒表达体系及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能基因组学研究领域，尤其设及一种诱导型慢病毒表达体系及其构 建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 过表达技术是研究基因功能的常用手段，而诱导型过表达是通过添加诱导物，精 确控制目的基因的诱导表达，是研究基因功能的一个强有力工具，尤其在转基因动物方面 得到很好的应用。
[0003] 目前已开发的诱导表达体系有四大类：化e-loxP系统（cre-loxp重组酶系统）、四 环素（Tet)诱导系统、蚁皮素诱导系统和乳糖诱导系统。其中，四环素诱导调控系统是应用 最广泛的诱导表达体系，它分为：tTA系统灯et-off)和的了4系统灯et-on)两大类。其中， Tet-on已经被广泛应用于转基因小鼠模型中。但是，ΚΤΑ(反式四环素控制转录因子）体 系存在着对诱导物不够敏感、本底水平较高（泄露表达）和诱导表达水平不高等不足。
[0004] 为此，研究人员致力于ΚΤΑ的改良，开发的第二代KTA-S2和ΚΤΑ-Μ2体系，在 一定程度上降低了诱导系统的泄露表达，并提高了诱导效率OJrlingerS，BaronUetal， ProcPfetlAcadSci，2000)。?<3ηιρα·等通过将VP16最小转录激活区与；rtTA-M2融合，使 目的基因本底表达水平进一步下降（:区姑巧就ΜR，GohlaGetal，阳BS，2002)。如等人 通过优化密码子等一系列手段构建的第二代KTA2S-M2体系进一步提高了稳定性、降低了 泄露，且对诱导物Dox的敏感度较原ΚΤΑ提高了 10倍（如Z，化ottasseryJVetal， Gene, 2004)。Das等构建的第^代ΚΤΑ3诱导体系，能在保持非诱导状态下背景表达不变 的同时，对Dox的敏感度较原ΚΤΑ提高25倍，且高浓度Dox诱导状态下目的基因表达水平 提高 5 倍值asAT，ZhouXetal，JournalofBiologicalQiemistry，2004)。同誉为第Ξ 代的Tet0N3G型Tet-ON系统是在KTA2S-M2系统的基础上进行了进一步的位点修饰，并结 合一个受Tet0N3G调控的改良型TRE3G诱导型启动子，可进一步降低泄露现象，降低诱导 剂Dox用量至仅为KTA2S-M2的1/10,且能减弱潜在的细胞毒性（FanX，PetittΜetal， Endocrinology，2012)。
[0005] 综合W上，研究人员致力于KTA的改良，开发的新体系在一定程度上降低了诱导 系统的泄露表达，并提高了诱导效率，但效果有限。Tet-ON诱导表达系统，尤其是利用慢病 毒载体建立的诱导体系还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种诱导型慢病毒表达体系，所要解决的技术问题在于进一步降低泄 漏现象，提高诱导表达水平。
[0007] 一种诱导型慢病毒表达体系，包括目的基因表达框和反义四环素转录激活因子 btTA)表达框，所述目的基因表达框包括含有四环素顺式应答作用元件的诱导型启动子 及目的基因，所述KTA表达框包括启动子、ΚΤΑ、连接肤W及筛选基因。所述筛选基因为 Puroo
[0008] 进一步地，所述诱导型启动子为Tet06或TRE3G，，其启动子可选用常见的CMV、 PGK、EFla、Ubc和SV40 ;所述ΚΤΑ为ΚΤΑ3 或Tet0N3G。
[0009] 进一步地，所述诱导型启动子为Tet06,所述ΚΤΑ为Tet0N3G。
[0010] 进一步地，采用PGK启动子表达Tet0N3G时，目的基因的诱导效率最高。
[0011] 作为优选，所述连接肤为P2A连接肤。为了减少慢病毒表达载体大小，采用P2A连 接肤同时表达反义四环素转录激活因子和抗性筛选基因化ro。
[0012] 本发明还提供了一种新型诱导型慢病毒表达体系的构建方法，包括W下步骤：
[0013] (1)改建pLVX-Puro载体：
[0014] 本系统选用pLVX-Puro载体作为慢病毒骨架载体，首先通过定点突变技术突变了 puro序列上的TthlllI、SacII和BsmBI位点，并在化rocDNA序列前后分别引入BamHI和 Spel位点；
[0015] (2)Tet0N3G基因合成及克隆：
[0016] 根据已经公布的TetONG序列进行基因合成并定点突变掉序列上的甜al位点，再 在Tet0N3G序列上游引入多克隆位点：Clal-Mlul-甜al-Agel-EcoRI-XhoI，在Tet0N3G序 列下游引入连接肤P2A及Smal和BamHI位点，Smal位点位于Tet0N3G和P2A之间，位于P2A 后的BamHI则介导着与化ro序列的融合连接。合成基因的全序列见SEQIDNO. 1。将合成 的基因片段用Clal-BamHI双酶切，然后通过相同的酶切位点克隆到改建后的pLVX-Puro载 体，新克隆载体命名为pLVX-Tet0N3G;
[0017] (3)pLVX-rtTA3 的构建：
[0018] WpTRIPz(Thermofisher)载体为模板，通过PCR扩增得到；rtTA3片段（其核巧 酸序列如沈QIDNO. 2)，用Bs巧I-Smal酶切后替换pLVX-Tet0N3G载体上的Tet0N3G，从而 得到新的克隆载体pLVX-rtTA3 ;
[0019] (4)亚克隆EFla启动子：
[0020] WpC畑-CMV-MCS-EFl-copGFP佛〇载体为模板，扩增得到EFla启动子片段（其 核巧酸序列如沈QIDNO. 3)，经化oI-BstBI双酶切后分别克隆到pLVX-Tet0N3G或pLV X-rtTA3,得到的新载体分别命名为pLVX-EFla-Tet0N3G或pLVX-EFla-rtTA3 ;
[0021] (5)亚克隆红色巧光蛋白RFP: 阳02引 WpTRIPz(Thermofisher)载体为模板，扩增得到RFPcDNA序列（其核巧酸序列 如沈QIDNO. 4)，经Agel-EcoRI双酶切后克隆到pLVX-EFla-Tet0N3G或pLVX-EFla-rtTA3， 得到的新载体分别命名为pLVX-RFP-EFla-Tet0N3G或pLVX-RFP-EFla-rtTA3 ;
[0023] (6)亚克隆含有四环素顺式应答作用元件诱导型启动子TRE3G或TET06 :
[0024]用甜al-Agel分别酶切pLVX-RFP-EFla-Tet0N3G或pLVX-RFP-EFla-rtTA3,然后将 合成的诱导型启动子TRE3G或TET06(核巧酸序列分别为SEQIDN05、6)启动子分别插入， 得到新的载体分别命名为 阳0巧]pLVX-TRE3G-RFP-EFla-Tet0N3G;pLVX-TRE3G-RFP-EFla-rtTA3
[0026]pLVX-TET06-RFP-EFla-Tet0N3G；pLVX-TET06-RFP-EFla-rtTA3 ；
[0027] 通过PCR扩增得到CMV、PGK、化c和SV40启动子，经化oI-BstBI酶切后，分别替换 pLVX-TET06-RFP-EFla-Tet0N3G载体上的EFla启动子，得到的新载体命名为
[0028] pLVX-TET06-RFP-CMV-Tet0N3G,
[0029] pLVX-TET06-RFP-PGK-Tet0N3G,
[0030]pLVX-TET06-RFP-Ubc-Tet0N3G,
[0031]pLVX-TET06-RFP-SV40-Tet0N3G。
[0032] 在上述方案中，目的基因两端设有限制性酶切位点Agel和EcoRI，用于构建不同 目的基因的诱导型表达体系。
[0033] 本发明还提供了一种新型诱导型慢病毒表达体系的应用，将所述诱导型慢病毒表 达体系用于内源基因或外源基因诱导表达。
[0034]本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明提供了一种新型高效的慢病毒诱 导表达体系，该诱导表达体系引入细胞后可在保持低背景表达的同时，最大水平地诱导表 达目的基因，该诱导表达体系对诱导剂反应灵敏、效率高、分子量小，可广泛应用于基因功 能研究中。
【附图说明】
[0035] 图1本发明构建的新型诱导型基因表达载体图谱。 W36] 图2启动子与反式作用因子的四种组合灯et06-rtTA3、Tet06-T