一种增强玉米外源基因表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程，具体地说，设及一种增强玉米外源基因表达的方法。
【背景技术】
[0002] 转基因技术的研究和应用，既需要研究开发出高效、易操作和低成本的外源基因 遗传转化技术，也要求使已经整合到转基因受体生物染色体上的外源转基因能够高水平的 稳定表达，W在受体生物上实习外源基因的功能，但是，外源转基因进入受体后常常发生表 达量降低，甚至转基因沉默等现象，并没有达到预期表达水平。据报道，外源基因插入受体 染色的位置效应，转录中基因沉默和转录后的基因沉默等影响了外源基因在转基因植物中 表达效率（李宏，2004)。目前，提高外源基因表达主要采用选择强的启动子和诱导型启动 子；选择强的终止子；使用增强子等方法；也可W选择适宜的转化方法；或者用叶绿体作为 转化受体；筛选单拷贝后代植株；使用信号肤；使用病毒编码蛋白；外源基因的修饰与改 造；消除DNA甲基化的影响；使用受体生物偏爱的密码子；包括使用核质结合区序列（MAR 序列）等（StiefAetal，1989)。而研究证实，将MR与外源基因作为共同单元，构建表达 载体可W不受物种限制，并具有操作简单效率高的特点，可W使外源基因在当代稳定表达 而且促进外源基因在后代的稳定遗传（Migueletal，2007)，赢得重视。
[0003] MR序列是染色质上的一段与核基质结合的DM序列，分布间隔为5-200化，MR 的长度一般为300-1000bp，少数可达几个肺。常含一些特征基序，如A-box(AATAAAYAAA)、 T-boxOTWTWTTWTT)、酵母自主复制序列ARS、拓扑异构酶II识别位点和能形成蛋白质识 别位点的松散DNA、弯曲DNA，富含AT区等。除了上述的一般特征外，不同的MRS还具有其 特殊的结构序列或特征。一些基因两侧的MR有着不同的属性，玉米a化I基因附近区域的 MAR与核基质结合时能形成7-70化的染色质环，在运个染色质区域a化I基因5'端的MAR 对核酸酶的酶解尤其敏感，而它对a化I基因的表达调控又是必需的。西红柿hsc80基因的 5' -MAR与3' -MAR有着截然不同的结合属性。β-菜豆蛋白基因5' -MAR与3' -MAR有着 截然不同的调节属性（刘峰等，2003)。
[0004] MAR通过与核基质结合使外源基因形成Loop环，而MAR处于Loop环的边界处，每 一个Loop环形成一个拓扑上独立的区域，环的大小不影响其对外源基因的表达，染色体的 凝结与DNA的转录在此区域不受干扰的独立进行，从而造成一种分割作用，使每个转录单 元保持相对的独立性，从而使环内基因免受周围染色质的影响（XuMYetal，2010)。Loop 结构模型暗示MR序列可能作为一个边界元件阻止染色体的凝缩区域或外源基因附近的 调控元件对外源基因表达的影响，既可W使基因上游调控序列和基因启动子相互靠近，又 使环中的DNA序列靠近核基质，便于基因的启动子和增强子与RNA聚合酶和转录因子相互 作用，降低其受周围染色质状态的影响，从而增强启动子的活性，提高基因的转录水平，减 少基因沉默度roweretal，2002;Maximovaetal，2003)。 阳0化]根据MR序列在生物体内功能的不同，可W简单地把MR序列分为3类：第一类位 于基因的下游较远处，此类MR序列和核基质的亲和力比较高，在整个细胞周期中都保持 与核基质的结合状态，它们的作用是将染色质分成许多大小不等的环，运些DM环除了作 为染色质高级组织结构的基本成分，同时也是基因表达调控单位。第二类MR序列通常位 于基因的启动子区和上游调控序列的附近，与核基质亲和力较弱，只是在基因表达，启动转 录时才与核基质暂时性地结合。第Ξ类MR和第二类MR相同之处是它也只和核基质暂 时性地结合，不同之处是它们位于DNA复制起始区附近，和DNA复制起始点相邻或在DNA复 制起始点中，在DNA复制时便于复制叉的形成度reyneet曰1，1994)。
[0006]MR和核基质之间的相互作用具有进化上的保守性，MR可W与异源的核基质相 互作用灯etkoIVetal，2006)。张可伟等（2002)用水稻的核基质来验证来自烟草和拟南 芥的MAR序列与核基质的结合情况效果理想，李旭刚等（2001)的研究结果显示来源于魏豆 的MR可W在烟草中提高外源基因的表达水平，表明不同生物种类的MR与核基质是能够 相互结合的，但并不是所有的MR都能够与异源的核基质相互作用，如人β-珠蛋白基因中 的MAR与烟草核基质之间的结合能力就很弱。但已报到的结果中MAR序列都是从双子叶植 物即烟草、拟南芥、大豆等中克隆，其次验证基因表达的是GUS报告基因，只是对功能基因 进行验证，而见对外源功能基因表达效率验证的报道。因此通过GUS报告基因结果分析，可 W进一步设想分析验证MR序列对外源抗虫、抗除草剂基因在玉米等单子叶粮食作物中表 达的效率，W分析如何增强农产品作物的抗性，为粮食生产做出突出贡献。
[0007] 黄慧珍等人（2005)从烟草DNA中克隆到的M17基因的AT%含量大于70%，有明 显的90%AT等结构域，进一步的序列分析表明，M17大小为674bp，AT%含量为71. 5%， 均含有MARs的部分特征基序如：A-box，T-box，拓扑异构酶II识别位点，自主复制序 歹U(ARS，autonomouslyreplicatingsequences)，碱基非配对区（BUR，baseunpairing region),MAR识别序列（MRS,MARreco即itionsequence),复制起始点（ORI，originof replication),弯曲DNA序列kurvedDNAmotifs)等，M17 与原烟草MAR的特征motif及 其他序列特征并不相同，Blast分析认为与GenBank中已登录MARs无明显相似性，因此认 为是新的MR片段。现已登录GenBank，登录号为AY766247。 阳00引 其中A-box=AATAAAYAA，5个；T-box=TTWTWTTWTT，7个；ARS= WTTTATRTTTW，2个；T0P0II=GTNWAYATTNA?NR，2个；BUR=AATATATTT，！个；MRS=TAWAWWWNNAWWRTAANNWWG，2个；0RI=ATTAorATTTAorATTTTA，23个；curved= AAAAN7AAAAN7AAAAorTTTAAA，3个；ATATTT，2个。
[0009] 黄慧珍等人已经证实：在烟草中发现的新MR序列M17,单侧连接M17的转化植 株，其平均GUS活性提高2. 43倍，两侧顺式重复连接M17的转化植株中GUS活性可提高3. 14 倍。与单侧连接的外源基因相比，两端顺式连接的外源基因与核基质的结合更稳定，可W富 集更多的调控因子促进转录，所形成的空间拓扑结构也更有利于环内转录。
【发明内容】
[0010] 目前对于MR序列的研究，多数为将其转入同源受体W提高目的基因表达量，而 对于转入异源受体（尤其是玉米）的研究相对较少，如今玉米已经成为我国第一大粮食作 物，随着转基因玉米的推广，利用MR序列增强转基因玉米外源的表达尚未报道。本发明的 目的是利用从烟草基因组中克隆到已报道的MR片段M17，W玉米化II转化受体为材料，通 过基因枪轰击法将构建好的含MR序列的载体转入玉米受体材料胚性愈伤组织，探讨MR 序列转入异源受体（玉米）后对外源基因表达的调控作用。证实了MR序列增强转基因玉 米外源基因高效稳定表达的作用，为进一步开展玉米等粮食作物抗虫、抗除草剂基因工程 奠定基础。
[0011] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种增强玉米外源基因表达的方法，所述 方法为将含MAR序列的载体转入玉米受体材料胚性愈伤组织中，增强植物外源基因的高效 稳定表达，减少基因沉默；所述MR序列为来自烟草的MR片段M17,核巧酸序列如SEQID No. 1所示。
[0012] 序列分析表明，它们具有90%AT-box，A-box，T-box，碱基非配对区域，拓扑异构 酶II识别位点，弯曲DNA序列，复制起始序列和ATATTT等典型的MR序列特征。
[0013] 进一步地，所述载体为重组表达载体，所述重组表达载体中启动MR序列转录的 启动子为花挪菜花叶病毒（CAMV)35S启动子。
[0014] 进一步地，所述载体为在PCAMBIA3301载体的多克隆位点处插入MR序列后得到。
[0015] 更进一步地，所述多克隆位点为化〇1和Bs巧II。
[0016] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0017] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双 元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、地1121、 PCAMBIA2301或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻 译区域，即包含聚腺巧酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺 巧酸信号可引导聚腺巧酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述MAR片段构建重组表达载体 时，在其转录起始核巧酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子， 例如花挪菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、泛素基因化iquitin启动子（P化i)、胁迫诱导型启 动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建 重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，运些增强子区域可W是 ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，W保证整个序 列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可W是天然的，也可W是 合成的。翻译起始区域可W来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或 植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可 产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基 因等。但从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接W表型筛选转化 植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因 植株进行检测，W确定其是否转化有目的基因。
[0018] 植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法（Ca2\PEG)、Ti质粒、化质粒、植 物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学 方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组 织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果芙、愈伤组织、茎尖、叶片和种 子等。
[0019] 本发明还提供了MR序列在增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默方 面的应用，其特征在于，所述MR序列为来自烟草的MR片段M17,核巧酸序列如SEQID No. 1所示。
[0020] 作为优选，所述植物为