提取缓冲液，加入lul琉基乙醇，混匀；
[0184] (3) 65°C水浴30分钟，期间轻摇离屯、管几次； 阳化5] (4)取出离屯、管，待冷至室溫（25°C)，加入等体积氯仿：异戊醇（24 : 1)，小屯、充 分摇动试管； 阳186] (5)室溫下12000巧m离屯、10分钟；
[0187] (6)取上清到另一个离屯、管，加入等体积的异丙醇，缓慢颠倒离屯、管10次W 上，-20°C放置 15-30min;
[0188] (7) 1200化pm离屯、lOmin，弃上清，用70 %乙醇洗2次，无水乙醇洗涂一次，超净工 作台吹干。加入lOOuld地2〇 65°C水浴15-20min; 阳189]做加入加1lOmg/mlRNaseA小屯、混匀，37°C溫育化；
[0190] (9)用等体积氯仿：异戊醇（24 : 1)抽提一次，室溫下1200化pm离屯、lOmin，吸 取上清液到另一个离屯、管，加1/10体积的3MNaAC(抑5. 2)，2倍体积无水乙醇。放于-20°c沉淀DM; 阳1W] (10) 1200化pm离屯、lOmin，弃上清，用70%乙醇洗1次，无水乙醇洗涂一次，超净工 作台吹干； 阳192] (11)溶于适量TE或d地2〇中。 阳193] 2. 5阳性克隆的鉴定
[0194] 利用人工合成的引物P1-P4,W玉米再生系化II愈伤组织DNA为模板进行扩增。 阳1巧]PCR反应体系（ιομ?: 阳196] 阳197]
[0198]注：Prime引物稀释：5,primer加1+3，primer5ul+d地2〇240ul
[0199] 按照W下程序进行扩增：94°C预变性5min;94°C变性40sec;56°C退火45sec; 72°C延伸lmin，30个循环；72°C保持5min，4°C保溫。（对愈伤组织阳性克隆的鉴定结果参 见【附图说明】图6) 阳200] 2. 6 RNA提取操作步骤 阳2〇U(1)将拟南芥叶片在液氮中磨碎，每1. 5mlEppendcxrf管加入lOOmg左右样品。 阳20引（2)每管加入1ml Trizol(每lOOmg样品加1ml Trizol)。迅速混匀，室溫下静置 5-lOmin，使核酸蛋白复合物完全分离。 阳20引（3)4°C12000巧m离屯、lOmin，取上清。 阳2〇4] (4)加入200ul的氯仿（每使用1ml化izol加0. 2ml氯仿），盖好管盖，剧烈震荡 15s，室溫放置3-5min。 阳205]巧)4°C 1200化pm离屯、15min，样品分为底层黄色有机相，中间层和上层无色水 相Ξ层，RNA主要在水相中，水相大致占用了60%的试剂体积。取上清转移至新1. 5ml Eppendo;rf管中。 阳2〇6] (6)加入0. 5ml异丙醇（每使用1ml Trizol加0. 5ml异丙醇），混匀，室溫放置 lOmin。 阳207] (7) 4°C1200化pm离屯、lOmin，弃上清，RNA在管底和管侧形成胶状沉淀 阳208] (8)加入1ml75 %乙醇（DEPC水配的乙醇溶液，每使用1mlTrizol至少加1ml乙 醇）洗涂RNA沉淀（务必使沉淀悬浮起来）。 阳2〇9]巧）4°C 12000巧m离屯、5min，弃上清。 阳210] (10)室溫放置惊干5-lOmin，加入30ulDEPC处理水，60°C放置lOmin溶解RNA。 悦11] (11)去除总RNA中混杂的DNA，具体如下： 阳212] W下混合溶液在37°C水浴40min降解DNA 阳21引
[0214] (12)将反应体系37°C水浴40min 阳215] (13)加入60ulDEPC处理水，lOOulTris饱和酪/氯仿/异戊醇（25:24:1)，充分 混匀，12000巧m离屯、lOmin。
[0216] (14)取上清，加入400ul氯仿/异戊醇（24:1)，充分混匀，12000rpm离屯、lOmin
[0217] (15)取上清，加入1/10体积的3MNaAc(P册.2)，加入2倍体积无水乙醇，-20°C沉 淀 30-60min 阳2化](16) 12000巧m离屯、15min，回收沉淀，用70%乙醇洗涂两次，将RNA沉淀惊干后溶 于30ulDEPC处理水。电泳检测后-70°C保存。
[0219] 2. 7 反转录成cDNA 阳。0] (1)每个200μΙPCR管中加入0.lyg/yL的总RNA2yL，2yM错定引物2化，小 屯、混匀，65°C水浴中保溫5min; 阳221] (2)接着冰浴2min，离屯、将管内液体收集至管底；
[0222] (3)在冰上依次加入下表所列各种组分：
悦巧](4)混匀，离屯、将管内液体收集至管底，在PCR仪上42°C进行反转录90min;阳226] (5)70°ClOmin使反转录酶失活； 阳223] 阳224]
[0227]做保存于-2〇°C。 阳22引反应完成后稀释10倍取1μL准备做PCR扩增 阳229] 2.8GUS全长cDNA的克隆
[0230] 200μLPCR管中一次加入W下组分： 阳231]
阳2巧注：
[0233]GUS-F: 5' -GTCGCGCAAGACTGTAACCA-3' 阳2；34]GUS-R: 5，-CGGCGAAATTCCATACCTG-3' 阳235]Prime引物稀释：GUS-Fprimer5ul+GUS-Rprimer5ul+d地2〇 240ul: 阳236] W反转录GUScDNA为模板，设计一对特异引物，严格控制循环数。本实验引物使 用GUS-F和GUS-R，RT-PCR的循环数控制在30。PCR反应的循环参数为：94°C预变性3min，SOcycles:94°C30sec;60°C40sec;72°C40sec，72°C延伸 7min。重复实验 3 次W确保结果 可靠。GUS表达量检测结果参见图7。
[0237] (S)结果与分析 阳23引1.烟草M17基因的克隆 阳239] 2.载体的构建
[0240]为了更好地理解MR-M17在植物中的功能，我们利用PCAMBIA3301构建了花挪菜 花叶病毒CaMV35S启动子调控下的表达植物载体。 阳241] W不含M17序列的植物表达载体PCAMBIA3301为对照，此载体只含有CaMV35S启 动子控制的GUS基因。利用克隆的M17序列，WCaMV35S启动子控制的GUS基因为报告基 因构建了 3个带有M17的植物表达载体，其中P3301-M17-N和P3301-M17-B为一端分别连 接带化0I酶切位点的M17和带Bs巧II酶切位点的M17的载体。具体操作如下： 阳242] 用含化0I和Bs巧II酶切位点的引物分别扩增M17片断，并连接到T-easy载体。 之后用化0I和Bs巧II分别单酶切含有M17的T-easy质粒，获得带有化0I和Bs巧II酶 切位点的M17片断（命名为M17-N和M17-B)，再用相同的酶单酶切PCAMBIA3301获得带有 NcoI和Bs巧II的2个PCAMBIA3301载体，回收载体和目的片断，再进行连接，就得到了含 目的基因M17-N,M17-B的2个单侧构建植物表达载体P3301-M17-N,P3301-M17-B。用同样 的方法将带有化0I酶切位点的M17与经过化0I单酶切P3301-M17B获得的载体进行连 接最终得到含有2个M17目的基因的P3301-M17-N-B的双侧构建载体。 阳243] 连接后的载体经过酶切鉴定，鉴定结果表明得到正确的载体：
[0244]M17-N为带化〇1酶切位点的M17片段克隆；M17-B为带Bs巧II酶切位点的M17片 段克隆 阳245] 3.基因枪转化 阳246] 转M17基因的质粒一共有4个：P3301空质粒，单侧构建M17的P3301-M17-N和 P3301-M17-B，双侧构建M17的P3301-M17-N-B。将质粒稀释成l(K)ng/μL进行轰击准备， 将枪击后的愈伤组织恢复培养7d后转移到含有草下麟的培养基上继代筛选5-6轮，每轮 15-20d左右。然后再挑选白色，干燥，松散的抗性愈伤组织，转入基因枪-再生I培养基，暗 培养2-3周后，当细胞开始变大后，转入基因枪-再生II培养基，光照培养。分化出小苗后， 转入壮苗培养基。 阳247] 4.RT-PCR检测
[0248] 我们提取了转基因玉米愈伤组织的RNA，反转录为cDNA，用RT-PCR的方法检测GUS 的转录情况，在所有的转基因玉米愈伤组织中，双侧构建M17的P3301-M17-N-B中GUS的条 带亮度无论和对照还是单侧构建的载体相比，亮度明显增加，而单侧构建的两个载体体现 的GUS转录水平也高于对照即P3301空载体。也就是说，M17除了在转化拟南芥中对GUS表 达量有提高的作用，在转化玉米愈伤中也有一定的作用。
[0249] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种增强玉米外源基因表达的方法，其特征在于，所述方法为将含MAR序列的载体 转入玉米受体材料胚性愈伤组织中，增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默； 所述MAR序列为来自烟草的MAR片段M17,核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体为重组表达载体，所述重组表达 载体中启动MAR序列转录的启动子为花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述载体为在pCAMBIA3301载体的多 克隆位点处插入MAR序列后得到。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多克隆位点为Ncol和BstEII。 5. MAR序列在增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默方面的应用，其特征在 于，所述MAR序列为来自烟草的MAR片段M17,核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米。
【专利摘要】本发明提供了一种增强玉米外源基因表达的方法，所述方法为将含MAR序列的载体转入玉米受体材料胚性愈伤组织中，增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默；所述MAR序列为来自烟草的MAR片段M17，核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105331630
【申请号】CN201510719363
【发明人】康定明, 刘永健, 贺舒雅, 郭二艳, 叶凌风, 刘琳, 曹金伶, 王映皓, 张少蔓
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年10月29日