一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法。
【背景技术】
[0002]合浦珠母贝又称马氏珠母贝，属软体动物门双壳纲珍珠贝目珍珠贝科，是海水养殖珍珠贝主要品种，生产“南珠”的母贝。它主要分布在广西、广东和台湾海峡南部沿海一带，是我国养殖面积最广、数量最大的人工养殖海水珍珠贝类之一。合浦珠母贝肉是一种高蛋白、低脂肪、低糖、营养价值高的优质蛋白来源的海产品，其粗蛋白干重含量在66.71%?81.2%之间，具有较高的开发利用价值。中国水产科学研究院南海水产研究所近几年来一直致力于合浦珠母贝肉的开发利用，通过对珠母贝肉进行定向酶解，得到小分子抗氧化活性肽，经质谱结构解析得到相对应的氨基酸序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg ;与之对应的氨基酸序列简写为GAGLPGKRER(具体参阅申请号为201410040473.4的发明专利中所述)；该肽抗氧化活性强，且较稳定，为了将这个抗氧化肽大量生产应用，如果只是采用酶解珍珠贝肉的方法，由于酶解过程副反应较多，含有多种其他肽类和小分子物质，纯化成本较高，产量又低。因此，急需寻找一种专一性强、成本低的方法来生产这种序列的合浦珠母贝肉抗氧化肽(PFMAP，Pinctada fucata meat ant1xidant peptides) ο
[0003]基因重组技术是当前世界比较流行的方法，是大量制备多肽的研究热点之一，现有技术中存在以下三种体外基因串联的方法:一是随机定向串联法，该种方法串联结果是不定向的，是随机的，这在表达翻译过程中可能导致产生错误的蛋白；二是化学拼接法，这个方法对于构建多拷贝的(4倍以上)就不太适合，原因是人工合成序列成本高；三是PCR扩增串联法，这个与化学拼接法类似，也是随着拷贝数增加，合成成本增加。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，该方法通过构建合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株来获取合浦珠母贝肉抗氧化肽，专一1性强，成本低。
[0005]本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案来实现的:一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，包括以下步骤:
[0006](I)选取合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP，根据其氨基酸序列并按照毕赤酵母偏好密码子设计出其对应的核苷酸序列，并进一步构建其核苷酸全长序列，根据全长序列，合成对应的两条单链，将两条单链进行PCR变性反应，获得合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP目的基因，将PFMAP目的基因经限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切，与同样经Xho I和Sal I双酶切的pBluescript II KS质粒相连接，得重组载体，然后将重组载体经热激转化至DH5 α感受态细胞，制得单倍体重组载体pBluescript II KS-PFMAP ；
[0007](2)以单倍体重组载体pBluescript II KS-PFMAP为模板，加入上下游通用引物M13+、M13-进行PCR特异性扩增，得到的PCR产物经电泳检测为单倍体目的条带基因pBluescript II KS-PFMAP,将目的条带基因 pBluescript II KS-PFMAP 经限制性内切酶Quick Xba I和Quick Kpn I双酶切后的基因，与同样经Quick Xba I和Quick Kpn I双酶切的P PIC Z a A质粒的基因相连接，制得合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体pPICZa A-pBluescript II KS-PFMAP ；
[0008](3)制备毕赤酵母菌GS115感受态细胞，将GS115感受态细胞与用限制性内切酶SacI单酶切线性化后的串联表达载体pPICZ a A-pBluescript II KS-PFMAP进行电转化和诱导培养，即制备得毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-PFMAP。
[0009]在上述合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法中:
[0010]步骤(I)中构建其核苷酸全长序列的过程是:选取合浦珠母贝肉抗氧化肽，在抗氧化肽的两端加入内切酶XhoI和Sail，并在两端分别加上3?5个保护碱基，且在内切酶和合浦珠母贝肉抗氧化肽基因之间加上溴化氰和羟胺所识别的蛋白切割位点，构建得合浦珠母贝肉抗氧化肽的核苷酸全长序列。
[0011]步骤(I)中PCR变性反应时的温度为92?96°C，变性时间为2?5min。
[0012]进一步的:步骤(I)中将单倍体重组载体pBluescript II KS-PFMAPgXho I单酶切和去磷酸化处理后的基因，与PFMAP目的基因经Xho I和Sal I双酶切(Xho I和Sal I互为同尾酶)后的基因相连接，获得2倍体重组载体pBluescript II KS-2PPFMAP，同理，可获得 4倍体重组载体pBluescript II KS-4PFMAP、6 倍体重组载体pBluescript II KS-6PFMAP和 12 倍体重组载体 pBluescript II KS-12PFMAP。
[0013]其中去磷酸化采用去磷酸化酶SAP;经Xho I和Sal I双酶切和去磷酸化处理后的PFMAP目的基因与经Xho I单酶切和去磷酸化处理后的单倍体重组载体pBluescript II KS-1PFMAP 的基因的摩尔比为 3 ?10:1。
[0014]进一步的，步骤(2)中同样能以2倍体重组载体pBluescript II KS_2PFWM、4倍体重组载体 pBluescript II KS_4PFMAP、6 倍体重组载体 pBluescript II KS-6PFMAP 或 12倍体重组载体pBluescript II KS-12PFMAP为模板，制得合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体 pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP、pPICZ α Α-pBluescript II KS-4PFMAP、pPICZa Α-pBluescript II KS-6PFMAP 或 pPICZ a Α-pBluescript II KS-12PFMAP。
[0015]步骤(2)中PCR 反应的参数为:94 °C 2min，94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 30s，72 °C 2min，4°C 5min ;35个循环；步骤⑵中经Quick Xba I和Quick Kpn I双酶切的pPICZ a A质粒的基因与经Quick Xba I 和 Quick Kpn I 双酶切的 pBluescript II KS-PFMAP的基因的摩尔比为3?10:1。
[0016]进一步的，步骤⑶中同样能将GS115感受态细胞与用限制性内切酶SacI单酶切线性化后的串联表达载体pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP、pPICZ α Α-pBluescript II KS-4PFMAP、pPICZαΑ-pBluescript II KS-6PFMAP 或pPICZ a Α-pBluescript II KS-12PFMAP进行电转化、阳性平板筛选和诱导培养，制备得毕赤酵母工程菌株 GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS_2PFMAP、GS115_pPICZ a Α-pBluescriptII KS-4PFMAP、GS115-pPICZa Α-pBluescript II KS-6PFMAP 或 GS115_pPICZ a A-pBluescript II KS-12PFMAP。
[0017]步骤(3)中电转化时电压优选为1200?1800V、电容优选为25 μ F、电阻优选为200 Ω ;步骤⑶中诱导培养时采用BMMY培养基。
[0018]本发明首次利用分子生物学和基因工程的方法构建多倍体串联基因pBluescript II KS_nPFMAP、构建毕赤酵母串联表达载体pPICZ a A-pBluescript II KS-nPFMAP 及毕赤酵母工程菌株 GS115_pPICZ α Α-pBluescriptII KS-nPFMAP，其中n为1、2、4、6或12 ;为其后期高效、稳定表达抗氧化肽、工业化规模生产及其在化妆品、保健食品等领域应用奠定基础。
[0019]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0020](I)本发明就合浦珠母贝抗氧化肽活性小分子肽段而言，相对于传统的酶解方法得到的纯度高，这是因为毕赤酵母表达系统诱导表达后、纯化后有标签蛋白更易纯化；而传统方法获取的酶解液的酶解程度控制在不同批次会受到原料、操作人员、环境的影响而导致酶解程度的不一样，从而使得合浦珠母贝肉酶解的小分子活性肽的大小不一，给后期的纯化处理带来不便；
[0021](2)本发明由于诱导培养条件简单，毕赤酵母菌生长用培养基原料价格低廉，易于大规模生产获得大量的抗氧化活性肽物质；然而传统的酶解方法由于受到原料成本、加工处理方式等条件的限制，在实际生产过程中，相对于毕赤酵母发酵系统来讲有着成本上、工艺上、单位时间产量上等诸多限制；
[0022](3)与【背景技术】中的3种常规方法相比，本发明方法采取的同尾酶法，可控制串联体的大小和方向，适合10?20个氨基酸小分子活性肽的多拷贝构建；
[0023](4)本发明采用体外基因串联的方法，使得氨基酸序列增长，而毕赤酵母工程菌株本身就是真核表达系统，具有亚细胞结构，可以对长链目的蛋白(20个氨基酸以上)进行糖基化、磷酸化等进一步修饰；体外基因串联的方法刚好克服了小分子操作和表达效率不高这两个问题，从而提高其应用性；
[0024](5)本发明操作简单，可以快速构建体外串联小分子活性肽基因工程菌株，为后期小分子活性肽的在化妆品、保健食品领域中的应用打下基础。
【附图说明】
[0025]图1是实施例2中制备的毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP ；
[0026]图2是实施例3中制备的毕赤酵母工程菌株GS115_pPICZa A-pBluescript II KS-4PFMAP ；
[0027]图3是实施例3中制备的毕赤酵母工程菌株GS115_pPICZa A-pBluescript II KS-6PFMAP ；
[0028]图4是实施例3中制备的毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-12PFMAP0
【具体实施方式】
[0029]实施例1
[0030]本发明涉及的合浦珠母贝肉抗氧化肽(PFMAP)的串联表达载体和工程菌株的构建方法如下:
[0031]1.修饰合浦珠母贝肉抗氧化肽(PFMAP)单倍体基因序列
[0032]按照毕赤酵母基因工程菌株的密码子的偏好性，运用计算机软件Primer Premier5.0 设计出与该 10 个氨基酸序列(Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg，参阅申请号 201410040473.4 的专利)对应的基因序列:5’ -GGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGA-3’ ；其中AT含量为0.46，GC含量为0.54。在活性肽两端加入的酶切位点分别为限制性内切酶XhoI和SalI ;为了后期限制性内切酶能顺利的将酶切位点切开，选择在两端分别加上3?5个保护碱基(在XhoI酶切位点左边加上CCG三个保护碱基；在SalI右边加上GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 二十二个保护碱基)。为了后期构建的串联表达重组载体在诱导表达出多拷贝目的蛋白能重新切割成单倍体蛋白，因此设计在酶切位点和目的基因序列之间加上蛋白切割位点，分别是溴化氰(CNBr)[能识别甲硫氨酸(Met)]和羟胺(NH2OH)[能识别天冬酰胺(Asn)-甘氨酸(Gly)]。
[0033]设计完成后的基因全长序列如下:
[0034]5，-CCGCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA-3，；
[0035]将上述分析完成的基因序列，合成对应的两条链如下:
[0036]PFMAP-Pl:
[0037]5 ’ -CCGCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA-3，；
[0038