，用1mL冰冷的lmol/L无菌D-山梨醇溶液(去离子水配置)，重悬菌体，4°C、5000r/min离心1min ;弃上清，用ImL冰冷的lmol/L的无菌D-山梨醇溶液(去离子水配置)，重悬菌体。
[0091](备注:YPD液体培养基的制备:称量蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，加去离子水至lOOOmL，121 °C高压灭菌20min，冷却至室温备用。)
[0092](3)电转化
[0093]将电击杯和单酶切线性化处理回收的重组载体置于冰上预冷；取新鲜制备的GSl 15感受态细胞80 μ L与线性化载体pPICZ a A-KS-2PFMAP溶液20 μ L混合，在电转杯中轻轻混匀，冰浴5min后；用电穿孔仪进行电转化，电转条件为:电压1500￥、电容25 4?、电阻200 Ω ;迅速加入冰冷的lmol/L的D-山梨醇溶液lmL，混匀后转入无菌EP管中30°C孵育Ih ;然后加入ImLYPD培养基，30°C，180rpm孵育Ih ;室温条件下5000r/min离心lmin，从上清中取200 μ L，剩余倾倒掉；用吸取的上清重悬菌体，随后取100 μ L涂布于YPD-Zeocin固体培养基平板上；30°C避光培养24h?48h，待重组菌落长出。
[0094](4)串联基因工程菌株诱导表达
[0095]挑单菌落于25/250mL含有BMGY培养基的锥形三角瓶中，于30°C、250rpm条件下培养至OD6qq= 2?6 ;室温下5000rpm离心5min，弃上清，并用BMMY重悬菌体，使OD 6。。值为1.0左右；于无菌的500mL三角瓶中继续培养，用封口膜封口，30°C、250rpm诱导培养；每24h向其中加入100%甲醇，至甲醇终浓度为0.5% ;按时间点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h)分别取样，取样量为ImL于1.5mL离心管中，5000rpm离心2min;收集上清液，即为诱导表达后的蛋白样品，与之对应的单菌落即为即毕赤酵母工程菌株 GS115-pPICZa A-pBluescript II KS-2PFMAP，如图1 中所示。
[0096]参照同样的方式，可以制得毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-4PFMAP、毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZa A-pBluescript II KS-6PFMAP或毕赤酵母工程菌株 GS115-pPICZa A-pBluescript II KS-12PFMAP。
[0097]蛋白样品用液氮或者干冰速冻后，于_80°C保存。
[0098]实施例3
[0099]与实施例2不同的是，KS-4PFMAP的构建方法如下:以构建好的pBluescript II KS-2PFMAP为模板，利用通用引物M13+、M13_进行PCR反应获得含有2PFMAP目的条带片段基因，然后将之利用限制性内切酶Xhol、Sail进行双酶切并与经单酶切后且去磷酸化后的重组载体pBluescript II KS-2PFMAP相连接，即可获得KS-4PFMAP重组载体，同理，可获得KS-6PFMAP或KS-12PFMAP重组载体。
[0100]参照实施例2中同样的方式，可以制得毕赤酵母工程菌株GS115_pPICZa A-PBluescript II KS-4PFMAP、毕赤酵母工程菌株 GS115-pPICZa A-pBluescript II KS-6PFMAP 或毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZa A-pBluescript II KS-12PFMAP。制备的工程菌株如图2-4中所示。
[0101]实施例1-3 中制得的重组载体 KS-PFMAP、KS-2PFMAP、KS-4PFMAP、KS-6PFMAP、KS-12PFMAP以及串联表达载体pPICZ a A-pBluescript II KS-PFMAP、串联表达载体pPICZ a Α-pBluescript II KS-2PFMAP、串联表达载体 pPICZ a Α-pBluescript II KS-4PFMAP、串联表达载体pPICZ a Α-pBluescript II KS-6PFMAP和串联表达载体pPICZa Α-pBluescript II KS-12PFMAP 的测序结果如下:
[0102](I)KS-PFMAP的测序结果如下:
[0103]AGCCATGACTGATTACGCCAGCGCGCATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTC
AAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAGAGTATGAGTATTCA
ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGCATTTTGCCTTCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAG
TAAAGATGCTGAGATCAGGTGGGTGCACGAGTGGTTACATCGACTGTATCTCACAGCGTTAGATCCTTGGAAGTTCG
CCCGAGACGTTTTCAATGATGAGCACTTTTAAGTTCTGGCTATTGTGG
[0104](2)KS_2PFMAP的测序结果如下:
[0105]AGGCCCTTGACATGATTACGCCAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGAT
[0106](3)KS_4PFMAP的测序结果如下:
[0107]GGGGGACTTGAAATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGG
[0108](4)KS_6PFMAP的测序结果如下:
[0109]AGGGAACAGACATGATTACGCCAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCA