四环素诱导型人工MicroRNA元件的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请设及膀脫癌检测治疗领域。
【背景技术】
[0002]RNA干扰（RNAinterference,RNAi)被誉为20世纪十大科学发现之一，是由微 RNAOnicroRNA)诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因表达受到抑制。基于微RNA的RNA 干扰治疗可能会是一种更加安全有效的肿瘤治疗手段。但是，使用天然的微RNA容易出现 祀基因有限、体内易降解、药效时间短、易引发干扰素反应等缺点。
[0003] 人工microRNA是W天然microRNA前体短发夹结构为基本骨架，将天然microiRNA 的功能序列替换为人工设计的祀向基因的反义序列，而得到的与天然microRNA具有相同 结构、但与天然microRNA祀向序列完全无关的人工microRNA。人工microRNA通常由表达 性载体经过转录和加工生成，其生成机制和作用途径与天然microRNA相同。相对于天然 microRNA,人工microRNA具有表达成本低、干扰效率高、持续时间长和毒性低等优点。四环 素开关系统基因表达系统是新近发展起来的高效、无毒、具有严密开关功能的基因表达系 统，自推出W来，在很多方面得到了广泛的应用，尤其是在基因的表达调控及基因治疗上。
[0004] 随着合成生物学运一新兴学科的迅猛发展，W及合成生物学的工程原理与技术的 不断成熟，从而使开展高效的、定量可控的RNA干扰肿瘤治疗成为可能。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种新的人工MicroRNA元件。
[0006] 本发明提供一种四环素诱导型人工MicroRNA元件，其核巧酸序列如SEQNO: 1或 沈QNO: 2所示。
[0007] 人工MicroRNA元件可W针对不同的膀脫癌细胞系的祀向基因，如β-catenin基 因，此时，序列如SEQNO:1所示；也可W如HIF-1α基因，此时，序列如SEQNO:2所示。
[0008] -种所述的元件在制备抑制膀脫癌细胞系中β-catenin基因表达的试剂中的应 用，所述核巧酸序列如SEQNO: 1所示。
[0009] -种所述的元件在制备抑制膀脫癌细胞系中HIF-1α基因表达的试剂中的应用， 所述核巧酸序列如SEQNO:2所示。
[0010] 祀向基因在膀脫癌细胞系中高表达，通过上述人工元件，可W有效抑制该祀向基 因的表达。
[0011] 一种所述的元件在制备抑制膀脫癌细胞迁移的药物中的应用。
[0012] 所述膀脫癌细胞为T24和5637。
[0013] 一种所述的元件在制备促进膀脫癌细胞调亡的药物中的应用。
[0014] 一种非治疗方法的促进膀脫癌细胞调亡的方法，用所述的元件转染所述膀脫癌细 胞。
[0015] 一种所述的元件在制备治疗膀脫癌的药物中的应用。
[0016] 一种所述的元件在膀脫癌细胞中调控祀向基因表达的应用。
[0017] 所述勒1向基因是HIF-1α基因和β-catenin基因。
[0018] 本发明的有益效果是：该人工元件可W有效抑制膀脫癌细胞系中祀向基因的表 达，可W有效抑制膀脫癌细胞的增殖，促进膀脫癌细胞的调亡，抑制膀脫癌细胞的迁移，从 而为治疗膀脫癌提供了可能性。
【附图说明】
[0019] 图1是本实施方式四环素诱导型人工MicroRNA元件的构建示意图；
[0020] 图2是显示本实施方式四环素诱导型人工MicroRNA元件能够定量可控的抑制对 相关癌基因的表达的结果图，A、B、C、D部分中，由左至右的五个方柱分别表示0. 0μg/ml Dox、0.lμg/mlDox、0. 5μg/mlDox、2μg/mlDox、10μg/mlDox；
[0021] 图3是显示本实施方式四环素诱导型人工MicroRNA元件能够有效抑制其革己向 基因下祀游基因的表达的结果图，A、B部分中，由左至右的四个方柱分别表示NC值OX-)、 NC值OX+)、β-catenin值οχ-)、β-catenin值OX+) ;C、D部分中，由左至右的四个方柱分别 表示NC值OX-)、NC值OX+)、HIF-1α值OX-)、HIF-1α值OX+);
[0022] 图4是显示本实施方式四环素诱导型人工MicroRNA元件有效抑制膀脫癌细胞增 殖的结果图；
[0023] 图5是显示本实施方式四环素诱导型人工MicroRNA元件有效诱导膀脫癌 细胞调亡的结果图，E、F部分中，由左至右的四个方柱分别表示NC值ox-)、NC值OX+)、 β -catenin值OX-)(或HIF-1 α值OX-))、β -catenin值OX+)(或HIF-1 α值OX+));
[0024] 图6是显示本实施方式四环素诱导型人工MicroRNA元件对膀脫癌细胞迁移运 动能力的抑制的结果图，最下方左侧由左至右的四个方柱分别表示NC值ox-)、NC值OX+)、 β -catenin值OX-)、β -catenin值OX+);最下方右侧由左至右的四个方柱分别表示 NC值OX-)、NC值OX+)、HIF-1 α值OX-)、HIF-1 α值OX+)。
【具体实施方式】
[00巧]技术与方法 [002引 1.细胞培养
[0027]膀脫癌细胞系Τ24 和 5637 购自AmericanTypeQiltureCollection(ATCC， Manassas,USA)，细胞培养液由 90 % 的DMEM(Invitrogen，CA)，10 % 的胎牛血清 (Invitrogen)，1% -2%的谷氨酷胺和0. 5% -1%的双抗配成。
[0028] 2.四环素诱导型人工MicroRNA元件的构建
[0029]W天然的MicroRNA-30为基本骨架，将成熟MicroRNA的功能序列替换为所选取 祀基因的干扰序列，从而得到特定祀基因的人工MicroRNA。同时，为了使转录后的人工 MicroRNA能够被更加准确有效的加工与修饰，在设计的人工MicroRNA两端加入了一种名 为RGR的核酶序列。转录后的核酶RGR片段可经过自我剪切修饰，帮助其中间的目的片段 形成有效的空间结构。接下来将构建好的人工MicroRNA导入到四环素诱导型质粒内，从而 得到了能产生四环素诱导型人工MicroRNA的合成元件。
[0030] 3.细胞转染
[0031] 转染前一天，4-5ΧΙΟ4个细胞接种在24孔板上，加入0. 5ml培养基，放在37°C、5% C〇2培养箱内。生长24小时后，细胞汇合度达到70%，在50ul的无血清培养基内加入lug 重组质粒，柔和混匀。在50ul无血清培养基内加入lulLipofectamin2000(Invit;rogen， CA)试剂，轻轻混匀，室溫放置5min。将稀释好的质粒和Lipo2000轻柔混匀，室溫放置20分 钟，W便形成质粒^ipofectamin复合物。将质粒/lipofectamin混合物加入24孔板内， 轻柔摇晃24孔板。放入培养箱内，4-6小时后更换培养基，48小时后收集细胞，准备下一步 实验。
[0032] 4.总RNA提取
[0033] 使用美国nvitrogen公司的Trizol试剂提取总RNA。使用紫外分光光度计和2% 琼脂糖凝胶检测提取的总RNA质量。定量后于-80°C储存备用。
[0034] 5.实时定量PCR
[003引实时定量PCR检测选用U6(snRNAU6)作为内源对照基因。使用All-in-化eTM miRNAqRT-PCRDetectionKit(GeneCopoieaInc,MD,USA)进行实时逆转录合成cDNA 和定量PCR验证。先进行miRNA逆转录合成cDNA。逆转录反应体系为总RNA1μ1， 2. 5U/μ1PolyAPolymerase1μ1,RTaseMix1μ1，5χReactionbuffer5μ1,dd 肥0(RNase-/面asefree)17yl。瞬时离屯、，37°C解育 60min，然后，85°C酶灭活 5min。实 时定量PCR总反应体系为 20μ1，包括 10μ1 2xAll-in-0neTMqPCRMix, 2μ1Universal AdaptorPCRPrimer(2μM), 2μ1All-in-OneTMqPCRPrimer(2μM), 2μ1First-Strand cDNA(dilutedin1:5), 50xROXReferenceDye0.4μ1和3.6μ1双蒸水。使用ABIPRISM 7000Fluorescent如antitativePCRSystem(AppliedBiosystems，CA，USA)进行qPCR 反应和分析。PCR反应均设3个重复。PCR反应参数如下：（1)95°C预变性15min; (2)40个 循环，每循环包括95°Cxl5s，55°Cx20s，70°Cx30s0All-in-0neTMmiRNAqPCRPrimer货 号为：has-miR-210,血iRQP0317 ;snRNAU6,血iRQP9001。取3个重复的中值计算相对miRNA 表达量（ACt=Ctmedianm測A-Ctmedian遍J。表达倍数用2 & &G端。
[003引 6.细胞增殖检测
[0037]使用CellCountingKit(CCK-S)，即 2-(2-甲氧基-4-硝苯基）-3-(4-硝苯 基）-5-(2, 4-二横基苯）-2H-四挫单钢盐检测细胞增殖。用含10%胎小牛血清的培养液配 成单个细胞悬液，W每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μ1。分别于转染后24， 48和72h，取相应的孔做检测。每个样本设3个复孔。每孔加CCK-8溶液巧mg/ml) 10μ1。 解育比，终止培养。选择450nm波长，用酶标仪度io-Rad，