编码人肝活素的基因、载体、转基因细胞和它们的应用及人肝活素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物工程领域，具体地，设及一种编码人肝活素的基因，含有该基因的 载体和转基因细胞，W及它们在制备用于预防和/或治疗肝损伤的药物中的应用，还设及 一种在细胞中，尤其是在哺乳动物细胞中W高水平产生人肝活素的方法。
【背景技术】
[0002] 我国是病毒性肝炎高发区，根据现有调查推算，我国有1.3亿人携带乙肝病毒， 3800万人携带丙肝病毒，全国每年发生急性病毒性肝炎约120万例，每年死于肝病者约30 万人。其中重症肝炎、急性肝功能衰竭等有着起病急、预后差、病死率高的特点，临床尚缺乏 有效的治疗手段。"阻止肝细胞坏死，促进肝细胞再生"仍然是主要的治疗策略，其预后也主 要取决于病损肝细胞的坏死程度和再生能力，运一原则后面的科学问题是肝损伤修复的分 子机制。
[0003] -些低等动物比如壁虎的尾、蝶顺的肢等，海参甚至全部的内脏都可W再生，但是 高等动物尤其是哺乳动物组织再生能力非常有限，然而肝脏却是为数不多的具有强大再生 能力的器官之一。肝脏至少承担着5000种W上的生理功能，是人体最重要的器官之一。虽 然正常肝组织中处于有丝分裂状态的肝细胞仅占0. 0012% -0. 01 %，但是肝脏的增殖能力 和适应代谢变化需求的能力并未丧失。肝脏具有很强的损伤修复能力，当肝脏被部分切除 或肝细胞受到破坏（如中毒、缺血、缺氧、病毒感染）时，剩余的肝细胞迅速进入分裂周期， 通过强大的再生能力迅速修复损伤的肝组织，例如，鼠类在进行70%肝切除后在8-10天即 可恢复正常肝脏大小。
[0004] 寻找阻止肝细胞坏死，促进肝细胞再生的药物一直是研究的热点，而基于肝再生 的特点，从肝脏本身寻求治疗严重肝病的有效物质一直是人们梦寐W求的愿望，尤其是特 异性的作用于肝脏的细胞增殖因子更是人们重点研究目标之一。早在屯十年代LaBrecque 等即报道在哺乳动物再生肝中存在一种特异性促肝增殖的细胞活性因子一一肝细胞刺激 物质化巧aticStimulatcxrySubstance,HSS)，随后研究表明该因子广泛存在于哺乳动物 幼仔的肝、胚胎肝及再生肝组织中。80年代我国学者陈成伟等应用4-6月人胎肝细胞悬液 化-FLC巧治疗肝功能衰竭并获得较好疗效，从而推动了此项研究在国内的开展应用。
[0005] 肝损伤的修复机制十分复杂，细胞因子、生长因子、免疫系统、代谢网络等共同参 与其中。肝脏受到损伤后，一方面表现为肝细胞的调亡或坏死，机体在感知损伤后，相应的 代谢、免疫等系统会发生相应的变化W适应新的情况；另一方面表现为肝细胞的增殖，损 伤后，一些即刻早期基因（immediateearlygenes)如c-fos，c-jun等表达迅速升高，同 时诱导枯否（氏）细胞、巨隧细胞等产生包括TNF-a在内的炎性细胞因子，进而激活产生 NF-KB、IL-6、STAT3等，细胞由GO期进入G1期；此外，TNF-α还刺激产生TGF-α，协同其 它生长因子比如HGF、EGF等促使细胞由G1期进入Μ期。在肝细胞增殖的过程中，细胞因子、 生长因子起到关键的作用，它们通过相应的信号转导通路产生级联反应，相互作用，不仅启 动而且维持肝的再生过程。目前已知能够促进肝细胞分裂的物质很多，主要包括两大类： 细胞分裂素类和辅有丝分裂生长因子类，前者包括肝细胞生长因子化巧ato巧tegrowth factor,HGF)、肝细胞生成素化巧atopoietin，ΗΡΟ)、表皮生长因子巧GF)、转化生长因子 (TGF-a)等等，后者包括去甲肾上腺素（Norepine地rine)、雌激素（Estrogens)、膜岛素 (Insulinum)和膜高血糖素（Glucagon)等。比如在肝再生过程中，HGF由肝非实质细胞合 成分泌，作用于肝实质细胞膜上的特异受体c-Met而刺激肝细胞DNA合成，HGF和c-Met形 成的旁分泌途径调控肝细胞的生长和分化；HP0在肝脏中存在自分泌循环，通过肝细胞表 面的特异受体启动MPK通路促进肝细胞的增殖；TGF-αW自分泌的形式为肝细胞提供促 有丝分裂刺激物，而EGF则W内分泌的形式促进肝细胞的分裂。
[0006] 但上述各种生长因子对肝细胞的刺激作用都是非特异性的。WHGF为例，研究表 明，HGF作用的祀细胞非常广泛，生物学作用多种多样如负向调控肿瘤细胞的增殖，促进非 肝细胞再生与肾、胃、脑等组织损伤修复，正向调控造血，促进胚胎与多种器官发育，促进肾 细胞等运动等。肝再生具有很强的器官特异性，寻找肝脏特异性的刺激因子对于深入认识 肝再生的分子机制有重要意义，并可能为严重肝病治疗提供新药物。
[0007] 2000年，Hara等通过差减cDNA克隆和爪赡卵母细胞表达筛选方法从大鼠肝脏中 获得一种新的促肝细胞生长因子一一胎passocin(HPS，也称为人肝活素）。次年，人源性HPS 也被克隆。序列检索表明人源性HPS与HFREP1 (}fepatoc5fte-De;rivedFibrinogen-Related Protein1)高度同源。HFREPl是FGLl基因表达产物，而FGLl(Fibrinogen-like1)是 Yamamoto等于1993年通过差减杂交方法筛选到的一种基因，其表达产物HFREP1属于纤 维蛋白原家族。纤维蛋白原和纤维蛋白原相关蛋白C端具有4个保守的半脫氨酸残基， HFREP1同纤维蛋白原0、丫的C末端同源一一包含4个半脫氨酸，但缺少纤维蛋白凝血 形成所必需的血小板结合位点、交联区和凝血酶敏感位点，故Yamamoto推测该蛋白是一 种与血液凝固不相关的分泌蛋白。2002年，化ηYAN等在小鼠中发现了鼠HPS的同源蛋 白MFREP-1(mousefibrinogen-relatedprotein-l)，2004 年，JunΥΑΝ等又获得了人 LFIRE-1(liverfibrinogen-relatedgene- 1)，而LFIRE-1 是HPS和HFREPl的同源基 因，因此化ηYAN又将其命名为LFIRE-1/HFREP1基因，LFIRE-1/HFREP1基因与HFREPl基因 具有相同的阅读框架的penReading化ame，0RF)，只是在5'非翻译区有些不同，并且发现 LFIRE-1/HFREP1是一种肝脏特异性表达的基因，该基因在肝癌细胞中表达下调同时还具有 抑制肝癌细胞生长的特性。
[0008] 人化passocin基因位于染色体8p22-p21.3,由8个外显子组成，mRNA长度为 1. 2化，0RF全长93化P，编码312个氨基酸的多肤，其中N末端22个氨基酸为其信号肤序 列。人HPS多肤与HFREPl蛋白只有3个氨基酸位点的不同，即Asn69,Ile72，Leul05,而 HFREPl则分别为Asp69,Val72,Prol05。鼠HPScDNA为1. 4化，蛋白多肤全长314个氨基 酸，其中N末端24个氨基酸为其信号肤序列。人WS与鼠WS蛋白的同源性在切除信号肤 前为81. 4%，而切除信号肤后为83.8%。人HPS蛋白多肤单体为34kDa，内含有5个半脫 氨酸残基，并且加入还原剂后册S促肝增殖活性消失。Westernblot结果也显示册S存在 34kDa和68kDa两种天然形态，故此推测HPS在体内W同源二聚体的形式发挥作用。
[0009]HPSmRNA在正常的大鼠肝脏中有低的表达，而当肝切除或D-氨基半乳糖做致损 伤时，HPSmRNA表达迅速上调，并在24-7化或10-4化维持较高水平，之后逐渐恢复到正常 水平。纯化的鼠源册S通过巧田-TdR渗入法实验证明在体外能强烈的刺激原代培养的鼠 肝实质细胞DNA合成，具有很强的促有丝分裂活性。原位杂交的结果表明，WS表达于肝实 质细胞。对于人HPSmRNA组织斑点杂交研究的结果表明册S高表达于成人肝，次表达于胎 肝，在骨髓和膜腺中有微弱的表达，其它组织中均不表达HPS。此外，WS的促肝增殖活性具 有很强的组织特异性，HPS只对正常的肝细胞具有促增殖活性，而对其它组织和肝癌细胞没 有相应的活性；同时HPS还具有一定的种属特异性。HPS是肝特异性转录因子HNF-1的调 控基因，白介素-6通过STAT通路也参与其表达调控。本实验室的研究表明HPS在体内也 可促进肝细胞增殖，并具有明确的抗肝损伤作用。注射外源WS可促进肝大部分切除大鼠 肝细胞增殖，有效地降低肝损伤大鼠血清转氨酶水平，促进肝损伤修复，提高急性实验性肝 衰竭大鼠存活率。
[0010] 尽管册S具有较好的抗肝损伤活性，但在其生产应用中仍存在较多问题。具有生 物活性的重组HPS已在各种细胞中被表达，如大肠杆菌、毕赤酵母、中国仓鼠卵巢细胞，虽 然在大肠杆菌中的表达水平可W达到44.Ig/l，但其表达形式多为无活性的包涵体形式，而 在C册细胞中的表达水平仅为lOmg/l，远远无法满足商业上的可行性。因此，急需开发新的 HPS的生产方法W获得大量的高纯度的具有生物学活性的重组册S蛋白。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是为了克服W上缺陷，提供一种优化的编码HPS的基因，含有该基 因的载体和转基因细胞，W及它们在制备用于预防和/或治疗肝损伤的药物中的应用，还 设及一种册S的制备方法W及一种药物组合物。本发明提供的编码册S的基因可实现在真 核细胞培养系统下高效大量的表达具有活性的重组HPS。由优化的核巧酸序列编码的蛋白 质序列与由相应的未优化的核巧酸序列编码的蛋白质序列相同。
[0012] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种编码人肝活素的基因，其中，该基 因具有SEQIDNo:1所示的核巧酸序列。
[0013] 第二方面，本发明提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有权利要求1所述的 基因和表达载体。
[0014]第Ξ方面，本发明提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有权利要求1所 述的基因。
[0015] 第四方面，本发明提供了如上所述的编码人肝活素的基因、如上所述的重组载体、 如上所述的转基因细胞在制备人肝活素中的应用。
[0016] 第五方面，本发明提供了一种人肝活素的制备方法，其中，该方法包括：在编码人 肝活素的基因能够表达的条件下，培养如上所述的转基因细胞，W使其表达人肝活素。
[0017] 第六方面，本发明提供了如上所述的编码人肝活素的基因、如上所述的重组载体、 如上所述的转基因细胞、如上所述的制备方法在制备用于预防和/或治疗肝损伤的药物中 的应用。
[0018] 本发明提供的优化的编码HPS的基因，能够在宿主细胞中高效表达HPS，有效避免 多聚体沉淀的形成，并且得到的册S对肝损伤具有良好的疗效，如能够有效促进肝细胞的 增殖、抗肝损伤、降低肝损伤组织转氨酶水平W及组织肝细胞坏死。
[0019] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部