一种基于下一代测序技术检测egfr/kras/braf基因突变位点的多重pcr引物和方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，特别是设及一种基于下一代测序技术检EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的多重PCR引物和方法及应用。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是位于 7 号染色 体短臂上的原癌基因C-erbB-1 (肥R-1)的表达产物，是表皮生长因子受体家族（肥R)中的 4个成员之一，肥R家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR酪氨酸激酶区域的 突变主要发生在18~21号外显子，其中19和21号外显子突变占总突变的90%。EGFR信 号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。研究表明，EGFR在多种肿瘤中都有表达，如结 直肠癌、乳腺癌、膜腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等。
[0003]K-ras基因是一种原癌基因，长约35化，位于12号染色体短臂上，是ras基因家族 成员之一，编码KRAS蛋白。K-ras基因常见的突变位点位于2号外显子的12号密码子和 13号密码子上、3号外显子的61号密码子，其中有7个突变热点：G12C、G12R、G12S、G12V、 G12D、G12A、G13V/D，占K-ras基因总突变的98%W上。研究表明体细胞K-ras基因突变与 多种人类恶性肿瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、膜腺癌、结直肠癌有关，而生殖细胞K-ras 基因突变与努南综合征和屯、脏-面部-皮肤（cardio-化ci〇-cutaneous，CFC)综合征相关。
[0004]BRAF基因是一种原癌基因，定位于7号染色体上，编码丝/苏氨酸特异性激酶。约 90%的BRAF基因突变发生在外显子15的1799位核巧酸上，T突变为A，导致鄉氨酸被谷氨 酸取代（V600E)。BRAF基因突变在黑色素瘤、结直肠癌、神经胶质瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌 W及肺癌等肿瘤细胞系中的发生率依次为59%、18%、11%、9%、14%、2%、3% ;此外，BRAF V600E在甲状腺乳头状癌中的发生率高达35. 8%。BRAF基因突变是晚期及复发性结直肠癌 最重要的预后指标之一，与患者较差的总体生存期密切相关。
[0005] 目前常见的检测运Ξ个基因突变的方法有Sanger测序法和巧光定量PCR法。 Sanger测序法中，单对引物可检测多个突变，但对多个基因、或同一基因的不同外显子上的 突变位点就需分别进行扩增测序，操作繁琐，并且灵敏度较低约20%，假阴性率较高。巧光 定量PCR法虽然灵敏度高，但每对引物只能检测一种突变，且每种突变需单独建立一个PCR 反应体系，同时检测多个样本多个突变位点操作繁琐。运两种方法对样本的需要量都较大， 不适合同时检测多个基因突变位点。
【发明内容】
[0006] 鉴于此，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变 位点的多重PCR引物和方法及应用。
[0007]第一方面，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突 变位点的多重PCR引物，包括如下a)-f)引物对中的至少两对：
[0008] a)用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对：SEQIDN0:1和沈QIDN0:2 所示引物对和/或SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物对；
[0009] b)用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对：SEQIDN0:5和沈QIDN0:6 所示引物对和/或SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物对；
[0010] c)用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对：SEQIDN0:9和SEQIDNO: 10 所示引物对、SEQIDNO: 11和沈QIDNO: 12所示引物对和沈QIDNO: 13和沈QIDNO: 14 所示引物对中的一种或多种；
[0011] d)用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对：SEQIDNO: 15和SEQID NO: 16所示引物对、SEQIDNO: 17和沈QIDNO: 18所示引物对和沈QIDNO: 19和沈QID N0:20所示引物对中的一种或多种；
[001引 e)用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对：SEQIDN0:21和沈QIDN0:22 所示引物对和/或SEQIDN0:23和SEQIDN0:24所示引物对；
[001引f)用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对：SEQIDN0:25和SEQID NO:26所示引物对和/或SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示引物对。
[0014] 优选地，所述多重PCR引物中，至少包括扩增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意两个 或Ξ个基因的引物对，其中，每个基因扩增一个或多个外显子的区域，每个外显子区域采用 一对或多对引物对。
[001引 优选地，多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQIDN0:1和SEQIDN0:2 所示引物对、569 10^:5和沈010^:6所示引物对、569 10^:9和沈010^:10所示 引物对、SEQIDNO: 13和沈QIDNO: 14所示引物对、SEQIDNO: 15和沈QIDNO: 16所示 引物对、SEQIDNO:21和沈QIDNO:22、沈QIDNO:25和沈QIDNO:26所示引物对。
[0016] 优选地，多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQIDN0:3和SEQIDN0:4 所示引物对、SEQIDN0:7和沈QIDN0:8所示引物对、SEQIDNO: 11和沈QIDNO: 12所 示引物对、SEQIDNO: 17和沈QIDNO: 18所示引物对、SEQIDNO: 19和沈QIDNO:20所 示引物对、SEQIDNO: 23和沈QIDNO: 24所示引物对、SEQIDNO: 27和沈QIDNO: 28所 示引物对。
[0017] 优选地，多重PCR引物为SEQIDNO: 1~SEQIDNO: 27所示的核巧酸序列组成的 引物组。
[001引本领域技术人员可W理解的，若摸索的多重PCR引物组（比如，SEQIDN0:1~SEQ IDN0:27所示的核巧酸序列组成的引物组）获得了较佳的扩增效果，一般情况下，设计引 物的时候，适当的将多重PCR引物组中任一一条引物的长度延长或截短0~3个碱基，也可 W获得不错的多重PCR扩增效果，也应纳入本发明保护范围。
[0019] 第二方面，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突 变位点的多重PCR方法，包括如下步骤：
[0020] 取待测样品；
[0021] 采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，多重PCR反应采用的引 物组包括如下a)-f)引物对中的至少两对：
[002引 a)用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对：SEQIDNO: 1和沈QIDN0:2 所示引物对和/或SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物对；
[0023]b)用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对：SEQIDN0:5和沈QIDN0:6 所示引物对和/或SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物对；
[0024]c)用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对：SEQIDN0:9和沈QIDNO: 10 所示引物对、SEQIDNO: 11和沈QIDNO: 12所示引物对和沈QIDNO: 13和沈QIDNO: 14 所示引物对中的一种或多种；
[00巧]d)用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对：SEQIDNO: 15和SEQID NO: 16所示引物对、SEQIDNO: 17和沈QIDNO: 18所示引物对和沈QIDNO: 19和沈QID N0:20所示引物对中的一种或多种；
[0026]e)用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对：SEQID N0:21和沈Q ID N0:22 所示引物对和/或SEQID N0:23和SEQID N0:24所示引物对；
[0027]f)用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对：SEQIDN0:25和SEQID NO:26所示引物对和/或SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示引物对。
[002引优选地，所述待测样品为DM样品或RNA样品。
[0029] 当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通PCR体系进行配 置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时， 逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR(只采用上游引物组或下游引物组），合 成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组）。
[0030] 如本发明所述的，所述的上游引物组选自SEQIDNO: 1~SEQIDNO: 28中奇数编 号所示的核巧酸序列的至少一种。
[0031] 优选地，所述的上游引物组选自沈QIDN0:l、5、9、13、15、21、25所示的核巧酸序 列中的至少一种或沈QIDN0:3、7、ll、17、19、23、27所示的核巧酸序列中的至少一种。 [003引如本发明所述的，所述的下游引物组选自SEQIDNO: 1~SEQIDNO: 28中偶数编 号所示的核巧酸序列的至少一种。
[003引优选地，所述的下游引物组选自SEQID^:2、6、10、14、16、22、26所示的核巧酸序 列中的至少一种或沈QID^:4、8、12、18、20、24、28所示的核巧酸序列中的至少一种。 [0034] 优选地，所述待测RNA样品为（优选采用RNA试