一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr引物及探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及致病菌检测技术领域，特别设及一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR引物及探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鲜活农产品是我国消费者除粮食外最主要的食物营养来源，在日常生活中占据着 举足轻重的位置。鲜活农产品在原料，加工，储藏，运输过程中容易受到多种病原微生物 (主要是细菌和真菌）的侵染。因微生物侵染产生的病害发生后的交叉感染会造成果蔬的 大量损失，失去商品价值，极大地限制了果蔬产业的发展。同时被各种病原微生物污染的鲜 活农产品一旦被消费者购买、食用会造成食物中毒，疾病传播等严重后果，危害食品安全， 给消费者的身体健康和生命安全带来巨大威胁。
[0003]基因忍片检测微生物的基本原理是在忍片表面合成待检验微生物的特异性核酸 探针，微生物样品DNA经巧光标记PCR扩增，然后再与忍片上寡核巧酸点杂交，最后通过扫 描仪分析巧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。与传统的检测方法（细 菌培养、生化鉴定、血清分型等）相比，基因忍片技术的先进性主要体现在：①基因忍片可 W实现微生物的高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；②操作简便快速，整个检 测只需24h基本可W出结果（而传统方法一般需4~7d);③特异性强，敏感性高。
[0004] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加W改进，于一个PCR反应体 系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR技术。采用运一技术可同时扩增多种病原微生物特异核酸序列，可大大提高病原微生物 的检测效率。目前同时对食品或食源性疾病多种病原菌进行分子诊断时常常采用多重PCR 方法，因为该方法可同时检测3~4种病原菌，既提高检测速度降又降低了检验成本，由此 得到广泛应用。但传统的多重PCR体系中，由于存在多对引物，引物之间的干扰W及引物 与模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题，制约多重PCR技术的发 展。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于提供一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR引物，可同时检 测沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌0-157和单核细胞增生李斯特菌等 5种致病菌，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提 高检测速度降又降低了检验成本。
[0006]本发明还提供了检测上述五重PCR引物扩增产物的探针。
[0007]同时本发明还提供了检测鲜活农产品中致病菌的试剂盒。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0009]-种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR引物，包括5对引物对，5对引物对分别 为：沙口氏菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 1所示，沙口氏菌反向引物序列信息见SEQ IDNo. 2 所示；
[0010] 金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 3所示，金黄色葡萄球菌反向引 物序列信息见SEQIDNo. 4所示；
[0011] 大肠杆菌0-157正向引物，序列信息见SEQIDNo. 5所示，大肠杆菌0-157反向引 物序列信息见SEQIDNo. 6所示；
[0012] 副溶血弧菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 7所示，副溶血弧菌反向引物序列信 息见SEQIDNo. 8所示；
[0013] 单核细胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQIDNo. 9所示，单核细胞增生李 斯特菌反向引物序列信息见SEQIDNo. 10所示。
[0014] 本发明针对沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌0-157和单核细 胞增生李斯特菌，筛选出各个菌种种间特异性强同时种内保守性强的基因区段设计引物。 引物特异性强，本发明特定设计的5对引物对，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少， 保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。
[001引一种用于检测五重PCR引物扩增的PCR产物的探针，包括5组探针，5组探针分别 为：
[0016] 检测沙口氏菌的探针20个，序列见SEQIDNo. 132~151所示；
[0017] 检测金黄色葡萄球菌的探针24个，序列见SEQIDNo. 108~131所示；
[001引检测大肠杆菌0-157的探针25个，序列见沈QIDNo. 11~35所示；
[0019] 检测副溶血弧菌的探针46个，序列见SEQIDNo. 62~107所示；
[0020] 检测单核细胞增生李斯特菌的探针26个，序列见SEQIDNo. 36~61所示。
[002。 为了精确检测细菌加强检测效率，本发明针对五重PCR引物扩增的PCR产物设计 了特定的DNA探针，探针固定在基因忍片上，便于大通量、快速检测，检测精度高。一种检测 鲜活农产品中致病菌的检测试剂盒，包括五重PCR反应体系和具有针对5种致病菌设计的 DNA探针的原位合成忍片，所述五重PCR反应体系W总体积50μL计，其组成如下：
[0022] lOXExTaqbuffer10μL,
[0023] 浓度为 2. 5mmol/L 的 dATP 1. 0 μL，
[0024] 浓度为 2. 5mmol/L 的 dTTP 1. 0 μL
[00巧]浓度为 2. 5mmol/L的dGTP1. 0μL
[0026] 浓度为 2. 5mmol/L 的 dCTP 0. 75μL，
[0027] 浓度为Inmol/μL 的 cy3_dCTP 2. 0 μL，
[0028] 引物混合物5.0μL，
[0029] DNA模板 20ng或lOng，
[0030] 浓度为抓/μL的ExTaq酶 0. 5μL
[0031] (1地2〇 补足至 50yL。
[0032] 本发明在反应体系中渗入一定比例的cy3-dCTP是为了在PCR产物中渗入巧光素， 在后续的杂交反应中，如果带有巧光素的PCR产物与忍片上的探针成功杂交，则在杂交清 洗完毕后，W扫描仪对忍片进行扫描时（扫描波长根据染料进行选择，比如cy3采用532nm) 成功杂交的探针位置会发巧光，从而可W得知样品中是否存在探针对应的细菌。
[0033] 本发明的试剂盒结合多重PCR技术和基因忍片技术，可同时检测沙口氏菌、金黄 色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌0-157和单核细胞增生李斯特菌等5种致病菌，该方 法具有准确性高，灵敏度高，特异性强，高效快速等优点。
[0034] 作为优选，所述引物混合物的由W下引物混合而成：
[0035] 浓度为20mmol/L的沙口氏菌正向引物19 μL浓度为20mmol/L的沙口氏菌反向引 物19 μ L ;
[0036] 浓度为20mmol/L的金黄色葡萄球菌正向引物20μL浓度为20mmol/L的金黄色葡 萄球菌反向引物20μL;
[0037] 浓度为20mmol/L的大肠杆菌0-157正向引物7. 3μ L浓度为20mmol/L的大肠杆 菌0-157反向引物7.3μL;
[0038] 浓度为20mmol/L的副溶血弧菌正向引物20μL浓度为20mmol/L的副溶血弧菌反 向引物20化；
[0039] 浓度为20mmol/L的单核细胞增生李斯特菌正向引物20 浓度为20mmol/L的单 核细胞增生李斯特菌反向引物20μ L。
[0040] 作为优选，针对5种致病菌设计的DM探针如下：
[0041] 检测沙口氏菌的探针20个，序列见SEQIDNo. 132~151所示；
[0042] 检测金黄色葡萄球菌的探针24个，序列见SEQIDNo. 108~131所示；
[0043] 检测大肠杆菌0-157的探针25个，序列见沈Q ID No.11~35所示；
[0044] 检测副溶血弧菌的探针46个，序列见SEQIDNo. 62~107所示；
[0045] 检测单核细胞增生李斯特菌的探针26个，序列见SEQID No.36~61所示。
[0046] 本发明的有益效果是：五重PCR引物，可同时检测沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、畐U 溶血性弧菌、大肠杆菌0-157和单核细胞增生李斯特菌等5种致病菌，引物之间的干扰小， 非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成 本。
【附图说明】
[0047] 图1是巧光多重PCR验证结果图；图中：1、五种菌混合，2、副溶血弧菌（理论扩 增长度44化p)3、沙口氏菌（理论扩增长度93化p)，4、金黄色葡萄球菌（理论扩增长度 547bp)，5、单核细胞增生李斯特菌（理论扩增长度958bp)，6、大肠杆菌0-157 (理论扩增长 度 350bp)，L、Marker。
[004引图2是沙口氏菌巧光多重PCR产物杂交结果图。
[0049] 图3是金黄色葡萄球菌巧光多重PCR产物杂交结果图。
[0050] 图4是大肠杆菌0-157巧光多重PCR产物杂交结果图。
[005。图5是副溶血弧菌巧光多重PCR产物杂交结果图。
[0052] 图6是单核细胞增生李斯特菌巧光多重PCR产物杂交结果图。
【具体实施方式】
[0053] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0054]本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。