专利名称：受四环素诱导表达系统调控uPA表达的载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种受四环素诱导表达系统调控UPA表达的载体及其建立四环素诱 导表达系统调控uPA表达的转基因小鼠模型中的应用。
背景技术：
uPA(urokinase-plasminogen activator),艮口 尿激Bl型纤溶Bl原激 舌齐U，属于 丝氨酸蛋白水解酶家族，uPA催化纤溶酶原转化为纤溶酶，启动纤维蛋白和细胞外基质蛋 白溶解级联反应。一般来说，uPA主要在生理、病理条件下参与细胞的分化、迁移、组织重 建、细胞外基质降解、肿瘤浸润及转移等过程。uPA纤溶途径的主要成分包括uPA，uPA受 体(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)及其 I 型抑制齐[J (plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1) (Nicholl SM, Roztocil E，Davies MG. Plasminogen activator system and vascular disease. Curr Vasc Pharmacol 2006 ;4 :101_116)0 石if 究发现，uPA纤溶途经不仅与纤维化发病机制有关，而且在固有性免疫和获得性免疫系统 的形成中发挥作用(Mondino A, Blasi F. uPA and uPAR in fibrinolysis, immunity and pathology. Trends in Immunology, 2004, 25 (8) :450_455)。此外，uPA 在组织损伤及修复 过程中起重要作用，如uPA在肝脏修复中发挥重要作用，但是其在转基因鼠中的过表达却 导致新生鼠的严重肝损伤。Tet-On系统是比较成熟的真核生物外源基因诱导表达系统之一，它利用大肠杆菌 TnlO转座子中四环素操纵子原理来实施调控外源基因在真核细胞中定量并特异地表达，具 有高效、无毒、开/关较严密等特点，已被成功地应用于细胞和转基因小鼠诱导表达外源基 因的研究。四环素操纵子(tet operon)诱导表达系统利用细菌四环素操纵子的阻遏与去 阻遏作用，实现外源基因在真核细胞中的表达，由于该系统调控元件来自原核生物，对真 核细胞的基因表达不会有影响，具有高效和操作方便等优点。Tet-On系统由两部分组成 ①Tet反应性元件(tetracycline responsive element, TRE)，由7拷贝的细菌四环素 耐药操纵子的操纵基因序列(TetO)和人类巨噬细胞的立早启动子(PminCMV)组成；②融 合的转录活化因子 rtTA(reverse tet-controlled transcriptional activator)，是由 细菌的四环素阻遏物TetR和人类单纯疱疹病毒(HSV)的毒粒蛋白VP16转录激活蛋白融 合而成的一个融合蛋白，能被强力霉素(Dox)所诱导和激活，并与TetO结合，通过VP16 发挥转录活性。此系统既有四环素阻遏物-操纵子相互作用的特异性，又具有VP16转 录活化因子的激活潜能，它们在体外培养细胞和转基因小鼠中能使目的基因的表达提高 约 IO5 倍(Urlinger S，Baron U，Thellmann M，et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators :novel mutations yield expanded range and sensitivity[J]. Pro Natl Acad Sci USA，2000，97 :7963_7968)。
发明内容
本发明的目的是提供本发明的目的是提供一种受四环素诱导表达系统调控UPA 表达的效应载体及其应用。本发明所提供的受四环素诱导表达系统调控UPA表达的效应载体，其核苷酸序列 包括细菌四环素耐药操纵子和人类巨噬细胞的立早启动子序列、小鼠尿激酶原激活剂表 达框和小鼠尿激酶原激活剂表达框最后一个外显子后的序列；所述小鼠尿激酶原激活剂 表达框的核苷酸序列为自GENBANK号(Accession. Version)为NM_008873. 3的5'端第 104-1405位核苷酸序列；所述小鼠尿激酶原激活剂表达框最后一个外显子(第11外显子) 后的711bp的序列的核苷酸序列为自GENBANK号(Accession. Version)为NM_008873. 3的 5'端第1363-2074位核苷酸序列，所述细菌四环素耐药操纵子序列为序列1的5'端第 7-300位核苷酸序列；所述人类巨噬细胞的立早启动子序列为序列1的5'端第301-438位 核苷酸序列。所述受四环素诱导表达系统调控UPA表达的效应载体的出发质粒为PTRE2质粒。 所述受四环素诱导表达系统调控uPA表达的效应载体的核苷酸序列为序列表中序列1。上述载体可以受四环素诱导表达系统中的rtTA诱导表达，上述载体转入动物中 可以构建得到受四环素诱导表达系统调控uPA表达的转基因动物模型，该转基因动物模型 作为动物模型材料与不同组织特异性表达rtTA的动物模型杂交形成也方便了受四环素或 其衍生物诱导在不同组织表达uPA的动物模型的构建。上述载体与表达rtTA的真核表达载体可以组成用于构建受四环素或者四环素衍 生物诱导uPA表达的转基因小鼠模型的组合载体。上述载体跟组织特异性表达rtTA的真核表达载体共同转入动物中可以由四环素 或者四环素衍生物诱导组织特异性表达uPA。在本发明的一个实施例中，所述表达rtTA的真核表达载体为肝组织特异性表达 rtTA的真核表达载体。所述肝组织特异性表达rtTA的真核表达载体，其核苷酸序列包括依次串连的小 鼠血清白蛋白增强子序列、小鼠血清白蛋白启动子序列和rtTA基因序列；所述小鼠血清白 蛋白增强子的核苷酸序列为自GENBANK号(Accession. Version)为AC140220. 4的5'端第 104540-106528位核苷酸序列；所述小鼠血清白蛋白启动子的核苷酸序列为自GENBANK号 (Accession. Version)为 AC140220. 4 的 5'端第 115631-115832 位核苷酸序列；所述 rtTA 基因的核苷酸序列为自GENBANK号(Accession. Version)为U89930. 1的5'端第774-1781 位核苷酸序列。所述肝组织特异性表达rtTA的真核表达载体的出发质粒为pTet-on质粒。所述肝组织特异性表达rtTA的真核表达载体的核苷酸序列为序列表中序列2。上述的载体及组合载体在构建受四环素或者四环素衍生物诱导uPA表达的转基 因小鼠模型中的应用也属于本发明保护的范围。所述应用中，所述构建受四环素或者四环素衍生物诱导uPA表达的转基因小鼠模 型，包括下述步骤1)将权利要求1-3中任意一项所述的载体导入小鼠筛选获得转基因小鼠；2)将权利要求4-8中任意一项所述的表达rtTA的真核表达载体导入小鼠筛选获得转基因小鼠；3)将步骤1)和步骤2)获得的小鼠杂交，筛选转入获得权利要求1-3中任意一项 所述的载体和所述表达rtTA的载体的转基因小鼠，即获得受四环素或者四环素衍生物诱 导uPA表达的转基因小鼠模型；所述四环素衍生物可为强力霉素。本发明通过构建受四环素诱导表达系统调控表达uPA的效应载体，构建了四环素 诱导表达系统调控表达uPA的转基因小鼠模型，这种转基因小鼠可以与组织特异性表达 rtTA的转基因动物杂交得到组织特异性表达uPA的转基因小鼠，从而方便不同组织特异性 表达uPA的动物模型的构建，为构建组织特异性可调控表达uPA转基因动物模型，用于特定 组织中uPA功能研究奠定了坚实基础。
图1 为 pTRE2_uPAcDNA 质粒 BamH I /Sal I 双酶切鉴定图 2 为 pTRE2-uPAcDNA-700 质粒 Hind III /Sma I I 双酶切鉴定图3为TRE2-uPA_711转基因载体元件及转基因动物鉴定引物设计模式4为uPA体外表达的mRNA水平鉴定图5为uPA体外表达的mRNA水平及蛋白生物学活性鉴定图6为tetO-uPA转基因首建小鼠PCR鉴定图7为肝组织特异性表达rtTA的AlbumiiKrtTA转基因首建鼠鉴定引物设计示意 8为肝组织特异性表达rtTA的Albumin:rtTA转基因首建鼠PCR鉴定结果图9为234号肝组织特异性表达rtTA的转基因阳性鼠不同组织rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 检测图10为232号肝组织特异性表达rtTA的转基因阴性鼠不同组织rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 检测图11为222号肝组织特异性表达rtTA的转基因阳性鼠不同组织rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 检测图12为223号肝组织特异性表达rtTA的转基因阴性鼠不同组织rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 检测图13为234号肝组织特异性表达rtTA的转基因阳性鼠不同组织rtTA和GAPDH 蛋白Western blot检测图14为222号肝组织特异性表达rtTA的转基因阳性鼠不同组织rtTA和GAPDH 蛋白Western blot检测图15为232号和223号肝组织特异性表达rtTA的转基因阴性鼠不同组织rtTA 和 GAPDH 蛋白 Western blot 检测图16为可诱导肝组织特异性表达uPA转基因小鼠肝组织表达uPA免疫组化检测图17为可诱导肝组织特异性表达uPA转基因小鼠肝细胞病理学检测图18为特异性诱导肝组织表达uPA后转基因小鼠血清ALT水平检测
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。下述实施例中所用的实验材料如下所示Huh7细胞系购自武汉博士德生物工程有限公司，胎牛血清(FCS)购自Gibco公司， H印es、双抗，谷氨酰胺等均购自Clontech公司。DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR纯化 试剂盒购自Promega公司；RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司；脂质体转染试剂盒、Trizol 试齐Ll为 Invitrogen 产品。E. coli DH5 α competent cells 禾口 DNA standard Marker 购自 北京博迈德发展有限公司；QIAprep Spin Miniprep Kit 和 Gel Extraction Mini Kit 购 自 Qiagen &司；T4 DNA polymerase^ Pyrobest DNA Polymerase^ T4 DNA Ligase> Takara RNA LA PCR Kit (AMV) Verl. 1、DNA Marker 购自 Takara 公司。蛋白酶抑制剂 Aprotinin、 Pepstatin A、Leup印tin、PMSF均购自Amresco公司；限制性内切酶购自NEB公司和Takara 公司；引物由上海生工合成，兔抗鼠uPA单克隆抗体购自American diagnostica Inc，苏木 素、伊红购自Sigma公司。凝血酶(Thrombin, Τ)和纤维蛋白原(Fibrinogen, F)购自国家 生物制品检定所。ALT采用Fuji DRI-CHEM 7000生化分析仪检测(FUJIFILM Corporation, Tokyo, Japan)。Te-on 诱导表达系统(Cat. No. 631108)购自 Clontech 公司；Anti-GAPDH polyclonal antibody (Cat. No. G9545)购自 Sigma 公司；DAB 显色液、HRP 标记山羊抗兔 IgG 购自中杉金桥公司；野生型C57BL/6J小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。四环素诱导 性真核表达载体pTet-on和PTRE2 (名称或者为pTRE2)质粒购自Clontech公司。转基因 动物载体DNA显微注射由上海模式生物有限公司完成。实施例1、转基因载体pTRE2-uPA_711载体构建及鉴定一、转基因载体pTRE2-uPA_711载体构建按常规分子克隆方法提取野生型C57BL/6J小鼠肾组织总RNA，反转录PCR扩增小 鼠 uPAcDNA 编码区序列 1302bp。引物为 uPAcDNA-F、uPAcDNA-R。uPAcDNA-F :cgggatccatg aaagtctggctggcgagcctg(弓丨入 BamH I )；uPAcDNA-R :cggtcgaccatcagaaggccagacctttctcttc (弓丨入 Sal I )。反转录条件为PCR条件94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸1分20 秒，2-4步30个循环；720C 10分钟，4°C 5分钟。 克隆至PTRE2载体得到重组载体，将该重组载体进行酶切和测序验证，将验证正确 的重组载体命名为TRE2-uPAcDNA。TRE2-uPAcDNA的BamH I /Sal I双酶切鉴定如图1所示。 泳道1为Marker2000 (Takara)，泳道2为BamH I /Sal I双酶切结果，可见插入的uPAcDNA 序列。按常规分子克隆方法提取野生型C57BL/6J小鼠基因组DNA并以此为模板PCR扩 增uPA最后一个外显子编码区后711bp序列，为自GENBANK号(Accession. Version)为 NM_008873 第 1363-2074 位核苷酸序列。引物为 uPA3' -F2, uPA3' -R2。uPA3' -F2 cggtcgacgccctcaggtagctgagggaag(弓丨入 Sal I )uPA3' -R2 cggtcgacgtgaaaccgacatttagtgctagtc(弓 I入 Sal I )
PCR条件为94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分10 秒，2-4步30个循环；720C 10分钟，4°C 5分钟。将PCR产物鉴定正确后，用Sal I酶切PCR产物并连入用Sal I酶切的 TRE2-uPAcDNA中uPAcDNA的3'端，Hind III /Sma I双酶切判断插入方向，正向连接的克隆 酶切后可产生158bp，1027bp,966bp, 3594bp的4条片段，凝胶电泳大约可见3条带(图2)， 泳道1为Markerlkb (Takara)，泳道2为Hind III /Sma I双酶切结果。将正向连接的克隆命 名为pTRE2-uPA-711，选择该质粒进行转基因动物制备。pTRE2-uPA_711的结构示意图如图3 所示，如图3所示，pTRE2-uPA-711中包含依次串联细菌四环素耐药操纵子(序列表中序列 1的第7-300位)、人类巨噬细胞的立早启动子序列(序列表中序列1的第301-438位)、 uPA cDNA(序列表中序列1的第439-1774位)、uPA第11外显子后的序列(序列表中序列 1 的第 1775-2485 位)。二、细胞水平鉴定转基因载体uPA的表达及其生物学活性将pTRE2-uPA_711 与 Tet-on 共转染 Huh7 细胞系，Dox 诱导(lug/ml)，诱导 后48小时分别收集细胞及其培养上清，RT-PCR鉴定uPA的表达(诱导的细胞应扩增 出 316bp 的目的条带)，扩增引物为:RT-uPA-F :cttcgtctgtagaccaacaag，RT-uPA-R gtgcaagatgagctgctccac ；扩增结果如图4 :A和B。图4中A为不同条件下细胞中uPA RT-PCR 的检测结果，泳道1为Marker2000 (Takara)，泳道2为以Tet-on共转染但未诱导的实验组 细胞RNA为模板；泳道3为以Tet-on共转染且诱导的实验组细胞RNA为模板；泳道4为 以小鼠肾组织总RNA为模板PCR结果。图4中B为与图A对应的内参照GAPDH的RT-PCR 结果。内参照 GAPDH 的扩增引物为 GAPDH-F 5 ‘ -TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 ‘ ； GAPDH-R 5 ‘ -CCTCAGTGTAGCCCAAGATGC-3 ‘。该实验表明，pTRE2_uPA_711 与 Tet-on 共转染 Huh7 细 胞系，在Dox诱导后能检测到uPA RNA水平表达，即体外Dox诱导实现了 uPA mRNA表达。溶圈法鉴定uPA的生物学活性。简述如下诱导后48小时收集细胞培养上清。 IOml 琼脂糖凝胶中加入凝血酶(Thrombin，Τ)和纤维蛋白原(Fibrinogen，F)，混勻后 迅速倒板，凝固后打孔，加入收集的细胞培养上清，37°C湿盒中放置过夜。图5为溶圈法鉴 定结果，其中1为uPA标注品(0. 2IU)，2为正常细胞培养上清组，3为共转染质粒但未诱导 组，4共转染质粒加Dox诱导组。该实验表明，pTRE2-uPA-711与Tet-on共转染Huh7细胞 系，在Dox诱导后能检测到uPA蛋白表达，且具有生物学活性。实施例2、tetO-uPA转基因小鼠的制备及鉴定一、tetO-uPA转基因首建鼠的制备及PCR鉴定将pTRE2-uPA_711质粒用Pvu I酶切，琼脂糖凝胶回收5739bp线性化片段，进行 C57XCBA Fl小鼠受精卵(母本为CBA小鼠，父本为C57小鼠，均购自北京华阜生物科技股 份有限公司)细胞原核DNA显微注射，注射卵分别移植到假孕母鼠输卵管中，转基因小鼠出 生后第2周剪取约0. 5cm鼠尾，提取基因组DNA，在转基因载体上下游各设计一对引物进行 PCR鉴定，引物设计示意图及序列如图6所示，引物序列如下所述上游序列引物(阳性小鼠应扩增得到465bp的片段)2-up-F :gtttagtgaaccgtcagatcgcctg ；2-up-R :ctaggct aatagcat caggtctgo下游序列引物(阳性小鼠应扩增得到498bp的片段)
2-down-F ggtagcttgaggagtagagacact ；2-down-R :gacaatggttgtaacagagtag。PCR 反应体系如下2· 5μ 1 10 XBuffer (含 MgCl2)，2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq, 0· 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(2-up-F 和 2-up-R,或者 2-down-F 和 2-down-R)，1· 5 μ 1 上述提 取的基因组 DNA，17. 8μ 1 ddH20。PCR 反应条件如下先 5°C 5min ；再 4°C 30S，54°C 30S， 72°C 30S，进行34个循环；最后720C 7min。PCR阳性小鼠即为tetO_uPA转基因首建小鼠。结果表明，显微注射出生73只小鼠于2-3周龄剪尾抽提基因组DNA，经PCR筛选 发现5只转基因阳性小鼠(3只$ 2只早)(部分PCR鉴定结果见图6)，耳号标记如下 yc-074 (早)，yc-075 (早)，yc-061 U )，yc-055 U )，yc-054 (古)。图 6 中 A 为上游序列 引物鉴定结果，B为下游序列引物鉴定结果。图6A和B中，泳道1为分子量MBI GenenRuler IOObp DNA Ladder marker，泳道2_6为不同首建鼠，泳道7为正常鼠，泳道8为空白对照，9 为阳性对照。二、肝组织特异性表达rtTA蛋白的转基因小鼠的构建及其鉴定1、肝组织特异性表达rtTA的载体pTet-on-albumin的构建l)pTet-on质粒的改构为了将小鼠血清白蛋白基因启动子及增强子序列插入pTet-on启动子位置，以代 替pTet-on载体中的CMV启动子，合成link以引入合适的酶切位点，依次为SpeI、Ec0R V、 Spe I ,Kpn I、Apa I ,Not I、EcoR I ；具体方法如下所述合成 link弓丨物，序列为 tet-on-linker F 5' -ctaggatatcactagtggtaccgggcccg cggccgcg-3‘ ,tet-on-linker R 5‘ -aattcgcggccgcgggcccggtaccactagtgatatc-3‘,将 tet-on-linker F 和 tet-on-linker R 在 PCR 仪中 95°C退火 IOmin,获得 PCR 产物。将上述获得的PCR产物同样用EcoR I和Spe I双酶切，回收纯化后，插入到 pTet-on的EcoR I和Spe I酶切位点之间，得到重组载体，将获得的重组载体用EcoR V / Sal I双酶切、EcoR V /BamH I双酶切鉴定，然后测序鉴定，结果表明linker已插入 pTet-on载体中；将鉴定表明正确的含有上述PCR获得的link序列的重组载体命名为 pTet-on-link。2)肝组织特异性表达rtTA的载体pTet-on-albumin质粒的构建将克隆并鉴定正确的增强子序列及启动子序列插入改构以后的pTet-on载体中， 构建pTet-on-albumin载体，具体方法如下所述按照分子克隆的方法提取C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限 公司)肝组织基因组DNA，以此为模板PCR扩增小鼠血清白蛋白增强子序列(自GENBANK 号(Accession. Version)为 AC140220. 4 的 5 ‘端第 104540-106528 位核苷酸序列)，上 游引物 F 5' -gccgagctcctgccggctagcttccttagcatg-3 ‘(引入 Sac I 位点)，下游弓|物 R 5 ‘ -gggttaaggatcccaagctggag-3 ‘(存在 BamH I 位点)，PCR 扩增获得 1993bp 的片 段，经测序表明该片段具有自GENBANK号(Accession. Version)为AC140220. 4的5'端 第104540-106528位核苷酸序列，即为小鼠血清白蛋白增强子序列；将PCR获得的片段用 Sac I和BamH I双酶切，克隆至pGEM_7ZF载体Sac I和BamH I酶切位点之间，得到重组载 体，将该重组载体进行酶切和测序验证，将验证正确的含有小鼠血清白蛋白增强子序列的 载体命名为 p7ZF-Up-promoter。
以小鼠C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)基因组DNA 为模板PCR扩增小鼠血清白蛋白启动子序列(自GENBANK号(Accession. Version)为 AC140220. 4 的 5'端第 115631-115832 位核苷酸序列)，上游引物 F 5，_cgggatccacagctcc agatggcaaacatac-3，(弓丨入 BamH I 位点),下游弓丨物 R 5，_tttgccagaggctagtggggttg_3，， 扩增产物用BamH I酶切，经PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化获得小鼠血清白蛋白启动 子。 将p7ZF-up-promoter用BamH I和Sma I双酶切，切胶回收作为载体，将纯化 后的小鼠血清白蛋白启动子连接入载体中，获得重组载体，将获得的重组载体用BamH I 酶切鉴定并测序，将酶切鉴定和测序表明正确的重组载体命名为p7ZF-Up-albUmin。将 p7ZF-up-albumin 用 Sac I 酶切，T4 DNA Polymerase 消平，Kpn I 酶切，切胶回收 2233bp 的片段，将回收的片段连接入EcoR V和Kpn I双酶切后的pTet-on-link载体中，获得重组 载体，将重组载体用BamH I酶切可见5022bp、1284bp、2689bp的条带出现，与预测结果相 符；对重组载体的增强子和启动子接头处进行测序，结果与预期相符。将该载体进行酶切和 测序鉴定，将鉴定表明正确的载体命名为pTet-on-albumin。pTet-on-albumin的序列中小 鼠血清白蛋白增强子、小鼠血清白蛋白启动子和rt TA基因(自GENBANK号(Accession. Version)为U89930. 1的5'端第774-1781位核苷酸序列)依次串连，该pTet-on-albumin 的序列见序列表中序列2。其中小鼠血清白蛋白增强子、小鼠血清白蛋白启动子和rt TA基 因分别是序列2中第115-2103位、第2109-2310位、第2370-3377位核苷酸序列。2、肝组织特异性表达rtTA的载体pTet-on-albumin的白蛋白启动子转录活性的 活体鉴定l)Albumin:rtTA转基因首建鼠制备及PCR鉴定pTet-on-albumin质粒用XhoI酶切，琼脂糖凝胶回收6034bp片段，进行C57 X CBA Fl小鼠受精卵(母本为CBA小鼠，父本为C57小鼠，均购自北京华阜生物科技股份有限公 司)细胞原核DNA显微注射，注射卵分别移植到假孕母鼠输卵管中，转基因小鼠出生后第2 周剪取约0. 5cm鼠尾，提取基因组DNA，在转基因载体上下游各设计一对引物进行PCR鉴定， 引物设计示意图及序列如图7所示，引物序列如下所述上游序列引物Ι-up-F GTGCAGCTTGGCTTGAACTCGTTC ；1-up-R :GAGTATGGTGCCTATCTAACATCTC。下游序列引物Ι-down-F GACGCGCTAGACGAFTTCGATCTG ；1-down-R :ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC。PCR 反应体系如下2· 5μ 1 10 X Buffer (含 MgCl2)，2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq, 0· 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(1-up-F 和 1-up-R,或者 l-down-F 和 1-down-R)，1· 5 μ 1 上述提 取的基因组 DNA，17. 8 μ 1 ddH20。PCR 反应条件如下先 5°C 5min ；再 4°C 30S，54°C 30S, 72V 30S,进行 34 个循环； 最后 72 0C 7min。PCR阳性小鼠即为Albumin:rtTA转基因首建小鼠。结果表明，显微注射出生49只小鼠于2-3周龄剪尾抽提基因组DNA，经PCR筛选发现9只转基因阳性小鼠(部分PCR鉴定结果见图8)，耳号标记如下yc-063(早)， yc-051(早)，yc-071(早)，yc-073(早)，yc-065 (早)，yc-068( $ )，yc-064( $ )， yc-056( $ ),yc-059( $ )。图8中A为上游序列引物鉴定结果，B为下游序列引物鉴定结 果。图8中A和B中，泳道1-9为不同首建鼠，泳道10为分子量marker，泳道11为正常鼠， 泳道12为阳性对照。2) Albumin :rtTA转基因Fl代鼠的获得与鉴定取步骤1)获得的9只首建鼠，培养至8周龄性成熟首建鼠，将其与8周龄的野生 型小鼠C57BL/6J交配，2周龄仔鼠进行耳号标记，其中4只首建鼠共产仔8窝，yc-063和 yc-065分别产3窝，yc-064和yc-056分别产1窝，3周龄时剪尾按分子克隆提取基因组 DNA, PCR检测阳性Fl代小鼠，PCR体系及反应条件同步骤1)。3、转基因小鼠Fl代rtTA转录水平鉴定取不同首建小鼠所生Fl代转基因阳性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代转基 因阳性小鼠234和222)及阴性小鼠(yc-063及yc-065所生F 1代转基因阴性小鼠232 和223)，断颈处死后剪取脑、胸腺、心、肺、肾、肠、脾、肝等不同组织少许(不超过30mg)，于 1.5ml EP 管中剪碎，总 RNA 提取使用 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Cat. No. 74106)，提取的总 RNA经Nanodrop 1000分光光度仪测定浓度及纯度，各种组织总RNA取400ng，使用Takara RNA LA PCR Kit (AMV) Verl. 1 进行反转录反应，体系为2 μ 1 MgCl2 (25謹ol/L)，1 μ 1 10XRNA PCR Buffer, 1 μ 1 dNTP Mixture, 0. 25 μ 1 RNase Inhibitor, 0. 5 μ 1 AMV Reverse Transcriptase,0.5 μ 1 Random 9mers,0.5 μ 1 Oligo dT-Adaptor Primer,400ng RNA, 用 RNase Free dH20 补足至 10 μ 1 体系，反应条件为30°C 10min，42°C 30min，99°C 5min, 5°C 5min，在 RT 反应结束后加入以下 PCR 体系3μ 1 MgCl2 (25讓ol/L)，4 μ 110XLA PCR Buffer 11,31. 75 μ 1 dH20,0. 25 μ 1 Takara LA Taq，0. 5 μ 1 引物(10 μ mol/L，分别用引 物对rtTA-F和rtTA-R，或者GAPDH-F和GAPDH-R进行扩增)反应条件如下94°C 2min， (94°C 30S，56°C 30S，72°C 30S) X32，72°C IOmin, RT-PCR 产物用 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 总RNA提取过程中勻浆操作使用TlO basic ULTRA-TURRAX勻浆机5档勻浆40S即可(购 自IKA公司)。引物序列如下rtTA-F :5:GACGCGCTAGACGATTTCGATCTG_3—rtTA-R :5、-ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC-3、GAPDH-F :5~_ACC ACC ATG GAG AAG GCT GC-3、GAPDH-R : 5 :CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3、Albumin:rtTA转基因Fl代阳性小鼠rtTA mRNA表达鉴定结果如图9-图12所 示，结果表明234号阳性小鼠rtTA mRNA在肝组织特异性表达，222号阳性小鼠除在肝组织 表达外，在肺和肾也有少量表达，232号和223号阴性小鼠各种组织均不表达。图9-图12 中左图均为转基因鼠不同组织rtTA RT-PCR检测，右图均为转基因鼠不同组织GAPDH mRNA RT-PCR检测。图9-图12中左图的PC表示瞬时转染pTet-on质粒48h后Huh7细胞提取总 RNA RT-PCR 结果。4、Albumin:rtTA转基因阳性鼠Fl代rtTA蛋白表达鉴定Fl代转基因阳性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代转基因阳性鼠234和222)及 阴性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代转基因阴性鼠232和223)不同组织总蛋白的提取，使用以下配方的组织蛋白裂解液10mM IM Tris-HCl, 1% (V/V)Triton X-100,1% (V/V) 去氧胆酸钠，0.1% (V/V) 10% (g/ml)SDS,0. 4% (V/V)NP-40，150mM NaCl,5mM EDTA，0.2mM 原钒酸钠，蒸馏水定容。提取前分别在组织蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂Aprotinin、 P印statin A、Leup印tin、PMSF，使其终浓度分另Ij为 2 μ g/ml，0. 7 μ g/ml，0. 5 μ g/ml，ImM。组织蛋白提取的具体方法为取不超过30mg各种组织，加入上述组织蛋白裂解液 及4种蛋白酶抑制剂，TlO basic ULTRA-TURRAX分散机5档勻浆40S后，冰浴30min，每5min 振勻1次，13000rpm 4°C离心15min，上清即为总蛋白溶液。总蛋白定量使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司，P0006)，各取50 μ g 总蛋白溶液，加入5 X SDS上样缓冲液及1/20体积β -巯基乙醇，煮沸lOmin，IOOOOrpm离心 5min，上清用于rtTA蛋白的Western检测，其余置于-80°C保存。rtTA蛋白检测一抗使用 TetR monoclonal antibody (Clontech，Cat. No. 631108)，稀释度 1 1000，GAPDH 蛋白一抗 使用 Anti-GAPDH polyclonal antibody (Sigma, Cat. No. G9545)，二抗分别使用 HRP 标记山 羊抗小鼠IgG及HRP标记山羊抗兔IgG(中杉金桥公司，Lot. No. 80259)，稀释度1 5000， 显影液使用 SuperSignal WestDura Trial Kit (Thermo SCIENTIFIC, Code #37071，Lot #KE132546)。Albumin:rtTA转基因Fl代阳性鼠rtTA蛋白表达鉴定结果如图13-图15所示， 结果表明，234号和222号阳性鼠rtTA蛋白在肝组织特异性表达，而232号和223号阴性 鼠则在各组织均不表达。图13-14中左图分别为转基因阳性鼠234和222不同组织rtTA Western blot检测结果，右图均为左图中相应组织GAPDH蛋白Western blot检测结果。图 15为转基因阴性鼠232 (左图)和223 (右图)不同组织rtTA Western blot检测结果，图 13-15中PC均表示瞬时转染pTet-on质粒48h后Huh7细胞提取总蛋白Western blot结^ ο取已鉴定rtTA蛋白在肝组织特异性表达的同窝Fl代转基因阳性鼠雌雄自交，所 生F2代转基因阳性小鼠用于保种繁育。用于与步骤一获得的转基因小鼠杂交。三、可诱导肝细胞特异性表达UPA转基因小鼠的制备及鉴定取步骤1获得的5只首建鼠，培养至8周龄性成熟首建鼠，将其与8周龄的野生型 小鼠C57BL/6J交配，2周龄仔鼠进行耳号标记，剪尾按分子克隆提取基因组DNA，PCR检测 uPA转基因阳性Fl代小鼠，PCR体系及反应条件同步骤一。将8周龄uPA转基因阳性Fl代 小鼠与步骤二构建的8周龄rtTA蛋白在肝组织特异性表达的Albumin-rtTA转基因小鼠杂 交，所生2周龄仔鼠进行耳号标记，剪尾按分子克隆提取基因组DNA，PCR检测双转基因阳性 小鼠，tetO-uPA PCR体系及反应条件同步骤一，Albumin-rtTA PCR检测引物如下所述Ι-up-F GTGCAGCTTGGCTTGAACTCGTTC ；1-up-R GAGTATGGTGCCTATCTAACATCTC。PCR 反应体系如下2·5μ1 10 X Buffer (含 MgCl2)，2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq，0. 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(l-up-F 和 1-up-R)，1. 5 μ 1 上述提取的基因组 DNA, 17. 8 μ IddH2O0PCR 反应条件如下先 5°C 5min ；再 4°C 30S，54°C 30S，72°C 30S，进行 34 个循环； 最后 72 0C 7min。tetO-uPA和Albumin-rtTA PCR均为阳性的小鼠即双转基因阳性小鼠
11(albumin-rtTA :TetO_uPA)。该实验原理为AlbUmin-rtTA转基因小鼠在肝组织特异性表达rtTA蛋白，该小鼠 与tetO-uPA转基因鼠杂交所生子代鼠在肝组织也会特异性表达rtTA蛋白，加入Dox诱导 时，rtTA表现为活性形式，与tetO-uPA中操纵基因序列TetO结合，发挥转录活性，实现肝 组织uPA特异性表达。3、双转基因小鼠肝组织uPA表达鉴定鉴定阳性的双转基因小鼠(albumin-rtTA TetO-uPA)饲喂含Dox(0. 5mg/ml)的饮 水诱导uPA的表达，诱导十周后收集血清进行ALT水平鉴定；处死小鼠并取各组织脏器进 行uPA特异性表达的检测。以未添加Dox的饮水为对照。实验结果可见uPA在肝组织特异 性表达(图16)，利用兔抗小鼠uPA单克隆抗体免疫组化检测肝组织坏死灶有uPA特异性 表达；组织病理学检测诱导小鼠肝组织中肝细胞胞浆疏松，肝组织灶状坏死，枯否细胞增多 (图17)。检测血清中ALT水平增高，进一步暗示肝组织受到一定损伤(图18)。图18中A 代表双转基因阴性小鼠组，B代表单转基因阴性小鼠组，C代表双转基因阳性小鼠组。
权利要求
一种载体，其核苷酸序列包括依次串连的细菌四环素耐药操纵子序列、人类巨噬细胞的立早启动子序列、小鼠尿激酶原激活剂表达框和小鼠尿激酶原激活剂表达框最后一个外显子后的序列；所述小鼠尿激酶原激活剂表达框的核苷酸序列为自GENBANK号为NM_008873.3的5′端第104 1405位核苷酸序列；所述小鼠尿激酶原激活剂表达框最后一个外显子后的序列的核苷酸序列为白GENBANK号为NM_008873.3的5′端第1363 2074位核苷酸序列，所述细菌四环素耐药操纵子序列为序列1的5′端第7 300位核苷酸序列；所述人类巨噬细胞的立早启动子序列为序列1的5′端第301 438位核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于构建所述载体的出发质粒为PTRE2质粒。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体的核苷酸序列为序列表中序列1。
4.用于构建受四环素或者四环素衍生物诱导uPA表达的转基因小鼠模型的组合载体， 由权利要求1-3中任意一项所述的载体和组织特异性表达rtTA的真核表达载体组成。
5.根据权利要求4所述的组合载体，其特征在于组织特异性表达rtTA的真核表达 载体为肝组织特异性表达rtTA的真核表达载体；所述肝组织特异性表达rtTA的真核表 达载体，其核苷酸序列包括依次串连的小鼠血清白蛋白增强子序列、小鼠血清白蛋白启动 子序列和rtTA基因序列；所述小鼠血清白蛋白增强子的核苷酸序列为自GENBANK号为 AC140220. 4的5'端第104540-106528位核苷酸序列；所述小鼠血清白蛋白启动子的核苷 酸序列为自GENBANK号为AC140220. 4的5'端第115631-115832位核苷酸序列；所述rtTA 基因的核苷酸序列为自GENBANK号为U89930. 1的5'端第774-1781位核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的组合载体，其特征在于所述肝组织特异性表达rtTA的真核 表达载体的出发质粒为pTet-on质粒。
7.根据权利要求6所述的组合载体，其特征在于所述肝组织特异性表达rtTA的真核 表达载体的核苷酸序列为序列表中序列2。
8.权利要求1-3中任意一项所述的载体在构建受四环素诱导表达系统调控表达uPA的 转基因动物中的应用，所述动物优选为小鼠。
9.权利要求1-3中任意一项所述的载体或权利要求4-9中任意一项所述的一组载体在 构建受四环素或者四环素衍生物诱导uPA表达的转基因动物模型中的应用，所述动物优选 为小鼠。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述构建受四环素或者四环素衍生物诱 导uPA表达的转基因小鼠模型，包括下述步骤1)将权利要求1-3中任意一项所述的载体导入小鼠筛选获得转基因小鼠；2)将权利要求4-8中任意一项所述的表达rtTA的真核表达载体导入小鼠筛选获得转 基因小鼠；3)将步骤1)和步骤2)获得的小鼠杂交，筛选转入获得权利要求1-3中任意一项所述 的载体和所述表达rtTA的载体的转基因小鼠，即获得受四环素或者四环素衍生物诱导uPA 表达的转基因小鼠模型；所述四环素衍生物为强力霉素。
全文摘要
本发明公开了一株受四环素诱导表达系统调控uPA表达的效应载体，其核苷酸序列包括依次串连的细菌四环素耐药操纵子和人类巨噬细胞的立早启动子序列、小鼠尿激酶原激活剂表达框和小鼠尿激酶原激活剂表达框最后一个外显子后的序列。本发明通过上述载体创建受四环素或其衍生物诱导表达系统调控uPA表达的转基因小鼠模型，为进一步构建组织特异性可调控表达uPA转基因动物模型，用于特定组织中uPA功能研究奠定了坚实基础。
文档编号C12N15/63GK101948860SQ20101025735
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者于虹, 周小军, 周育森, 孙世惠, 肖文珺, 胡婧雅, 郭彦 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所