具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株及其建立方法
【专利摘要】本发明将E1B-19K基因和BS-BV基因分别插入到pBudCE4.1载体的EF-1α启动子和CMV启动子下游，构建同时、独立组成型表达E1B-19K和BS-BirA-VP4的载体pBud-E1B-BS-BV。将p27Kip1片段连入生物素诱导表达系统BS-Biotin-On的响应载体中，构建响应于生物素的p27Kip1诱导表达载体pc-Hy-4BSOB-minp27。将上述两载体共转染HEK293细胞，通过有限稀释法进行单克隆化，获得具有改良性状的HEK293细胞株18-HEP。
【专利说明】具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株及其建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞工程【技术领域】，涉及一种经多基因代谢工程改造的HEK293细胞株。具体地说，它是一种通过组成型过表达腺病毒抗凋亡基因E1B-19K和诱导表达人细胞周期控制基因p27Kip1，具有改善了体外培养和重组蛋白生产特性的HEK293细胞株及其建立方法。
【背景技术】
[0002]哺乳动物细胞可进行复杂的翻译后修饰、保持重组蛋白的生物学活性，是目前生物制药产业最广泛采用的表达系统。但是，哺乳动物细胞表达系统的缺点也很明显，主要表现在:细胞生长速率较慢、最终细胞密度较低、蛋白表达水平较低以及细胞凋亡的普遍存在等，在一定程度上影响了它的广泛应用。
[0003]近年来，随着对细胞代谢途径和调控机理的深入研究，越来越多的细胞工程研究者开始利用代谢工程的方法对细胞自身的遗传特性进行有目的的修饰，对细胞的性状进行改良，使其适应能力更强，具备在体外培养条件下的自身调节能力，从而适应生物制药产业大规模培养的要求。目前，动物细胞的代谢工程已应用于增强细胞抗凋亡能力、控制细胞增殖速率、改变细胞的能量代谢途径、改善重组蛋白的糖基化等方面。其中，针对细胞抗凋亡能力和增殖控制两方面性状的改良应用最为广泛、成效最为显著。
[0004]用于提高工程细胞抗凋亡特性的基因主要是bcl-2家族的成员(bcl-2和bcl-xL)及其病毒同源基因(BHRF-l、KSBcl-2和E1B-19K等)，已在杂交瘤、BHK、CHO和COS细胞等多种工程细胞系中显示了显著 的抗凋亡作用。其中，E1B-19K是来源于腺病毒的抗凋亡基因，其作用机制可能是通过与促凋亡蛋白Bax相互作用，以及结合Bak蛋白并抑制其加速凋亡进程的功能。在NSO、CHO和BHK细胞中过表达E1B-19K显示了有效降低细胞凋亡、延长培养时间的作用，在某些研究中还观察到了重组蛋白产率的提高。对于HEK293细胞的抗凋亡改造，目前只有一篇文献报道，采用人X-连锁的凋亡蛋白抑制因子(XIAP)、来自牛痘病毒的细胞因子响应修饰蛋白(CrmA)及二者的突变体分别转染HEK293细胞，在不同凋亡诱导条件下的考察结果表明，四者均使细胞活力显著提高，其保护效果对不同的诱导因素具有一定的特异性。
[0005]在生物反应器中细胞密度达到理想值时，借助分子生物学手段来控制细胞增殖，以提高重组蛋白产率和减少因细胞过度增殖所致的细胞凋亡是提高重组蛋白产量和质量的有效途径。周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)在细胞周期进展的调控中发挥极其重要的作用，通过抑制周期蛋白依赖性激酶(CDK)的活性而诱导生长阻滞。其中的p21Cipl和p27Kipl是目前关于细胞增殖控制的代谢工程中应用最多的两种CKI。共表达SEAP和p21Cipl的瞬时转染CHO细胞系表现出明显的生长阻滞和产量提高5倍，而稳定转染细胞未观察到产量增加。Fussenegger等通过与分化因子CAATT/增强子结合蛋白α (C/ΕΒΡα，起到诱导和稳定p21Cipl的作用)和抗凋亡蛋白bcl-xL共表达，成功构建了 p21Cipl上调的CHO细胞系，SEAP产量提高了 10-15倍，而p27Kipl与C/EBPa和Bcl-xL同时过表达使SEAP表达提高30倍。
[0006]细胞增殖控制基因的表达需要进行严格的调控，因此控制增殖技术的一个关键问题就是外源基因表达调控系统的选择。目前已较成熟的一些基因调控系统，如四环素、IPTG、蜕皮激素等响应的调控系统已应用在增殖控制中。但是，在制药工业中，使用具有生理活性的小分子诱导剂仍是不允许的，这就限制了增殖控制技术在中试规模的应用。本发明利用中国发明专利201110228457.4建立的一种基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶的生物素诱导表达系统进行细胞周期控制基因的诱导表达，该系统采用的诱导剂生物素是获批用于生物制药工业的细胞培养基的基本组分之一，绝对无毒，价格低廉，并且未观察到生物素的存在与否对细胞生长和产物表达具有明显影响。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种经多基因代谢工程改造的HEK293细胞株18-HEP。具体地说是一种通过组成型过表达E1B-19K和诱导表达p27Kipl而具有抗凋亡和增殖调控特性的HEK293细胞株。
[0008]本发明的另一个目的是提供用于上述HEK293细胞株多基因代谢工程改造的E1B-19K基因和p27Kipl基因的序列，其具有序列表中SEQ N0.1和SEQ N0.2所述的序列。
[0009]本发明的再一目的是提供一种上述多基因代谢工程改造的HEK293细胞株的建立方法。
[0010]为实现上述目的，本发明的发明思路为:
[0011]将重叠PCR获得的E1B-19K基因和生物素诱导表达系统BS-BiOtin-On的调控蛋白BS-BV基因分别插入到pBudCE4.1载体的EF-1 α启动子和CMV启动子下游，构建同时、独立组成型表达Ε1Β-19Κ和BS-BirA-VP4的载体pBud-EIB-BS-BV。
[0012]将克隆自商业化载 体PCMV-SP0RT6-P27载体的p27Kipl片段，连入生物素诱导表达系统BS-Biotin-On的响应载体中，构建响应于生物素的p27Kipl诱导表达载体pc-Hy-4BS0B-minp27。
[0013]将上述两载体共转染HEK293细胞，通过有限稀释法进行单克隆化，考察细胞株的抗凋亡特性和细胞增殖特性，获得具有改良性状的HEK293细胞株18-HEP。此后进一步利用该细胞株进行rhTNFR的生产，考察对于重组蛋白表达方面的改善。
[0014]依据上述思路，本发明采用如下技术方案:
[0015]一种具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，所述细胞株是在HEK293细胞中组成型过表达腺病毒抗凋亡基因E1B-19K，所述腺病毒抗凋亡基因E1B-19K的序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，该细胞株18-HEP已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年5月31日，保藏编号为CGMCC N0.6176，其分类命名为HEK293细胞。
[0016]如上所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，所述细胞株还在HEK293细胞株中诱导表达人细胞周期控制基因p27Kip1，使该细胞在诱导表达条件下发生增殖阻滞，细胞生长显著变慢，所述人细胞周期控制基因p27Kipl的序列如序列表中SEQ ID N0.2所
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[0017]如上所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，所述诱导表达基因p27Kip1，是采用基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶、响应于生物素的诱导表达系统。
[0018]如上所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的建立方法，其步骤如下:
[0019]a.E1B-19K和BS-BV组成型共表达载体的构建:
[0020]利用序列如SEQ ID N0.3-16所示的引物，通过重叠PCR获得E1B-19K基因，其序列如SEQ ID N0.1所示；经Not I/Mlu I酶切后，连入同样经Not I/Mlu I酶切的pBudCE4.1载体的EF-1 α启动子下游；用Afl I I/Not I从pc-BS-BV载体上酶切获得BS-BV基因，补平，连入经Afl II/EcoR I酶切并补平的pBud-ElB载体CMV启动子下游，得到同时组成型独立表达E1B-19K基因和BS-BV基因的载体，命名为pBud-EIB-BS-BV ；
[0021]b.响应于生物素的p27Kipl诱导表达载体的构建:
[0022]利用SEQ ID N0.17及SEQ ID N0.18所示引物从商业化载体pCMV_SP0RT6_p27上扩增得到p27KiplcDNA片段，Nhe I/BamH I酶切，连入同样酶切的pc-Hy-4BS0B_minCMV载体，得到响应于生物素的p27Kipl诱导表达载体pc-Hy-4BS0B-minp27 ；
[0023]c.细胞转染及筛选:
[0024]将上述两载体p Bud-EIB-BS-BV 和 pc-Hy-4BS0B_minp27 共转染 HEK293 细胞，经200 μ g/mL Zeocin和400 μ g/mL G418筛选两周，得到阳性混合克隆细胞。将上述混合克隆通过有限稀释法进行单克隆化，按3cells/孔接种于96孔细胞培养板中，置于37°C，5%C02培养，约两周后，将单克隆孔消化传代，扩大培养，用于后续实验。
[0025]一种用于建立如上所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的表达载体pBud-ElB-BS-BV，其序列如序列表中SEQ ID N0.19所示。
[0026]一种用于建立如上所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的表达载体pc-Hy-4BS0B_minp27,其序列如序列表中SEQ ID N0.20所不。
[0027]一组用于建立如上所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的重叠PCR引物，所述引物的序列分别如SEQ ID N0.3-16所示。
[0028]如上所述的一组重叠PCR引物，其中，序列如SEQ ID N0.3和N0.4所示的引物、如SEQ ID N0.5和N0.6所示的引物、如SEQ ID N0.7和N0.8所示的引物、如SEQ ID N0.9和N0.10所示的引物、如SEQ ID N0.11和N0.12所示的引物、如SEQ ID N0.13和N0.14所示的引物、如SEQ ID N0.15和N0.16所示的引物，分别构成引物对。
[0029]如上所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株在重组蛋白生产方面的应用。
[0030]本发明的优点是:
[0031](I)本发明提供的HEK293细胞株在凋亡诱导培养条件下的细胞凋亡显著降低，同时可进行可调控的细胞增殖阻滞，通过降低凋亡和增殖控制的双重作用达到改善细胞体外培养性状和增加重组蛋白产量的目的。
[0032](2)在无血清悬浮培养中以该细胞株为表达系统生产重组蛋白rhTNFR，与空载体转染的对照细胞相比，使重组蛋白产率提高I倍左右，最终蛋白累积浓度提高约1.1倍。该细胞株具有改良的体外培养和重组蛋白生产特性，在生物制药产业大规模培养中具有应用前景。
[0033]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为本发明构建得到的E1B-19K与BS-BV组成型共表达载体示意图。
[0035]图2为响应于生物素的p27Kipl诱导表达载体示意图。
[0036]图3为重叠PCR获得E1B-19K基因的步骤示意图。
[0037]图4为18-HEP及对照细胞在有无诱导剂条件下的细胞生长情况；a为对照细胞生长情况统计图，b为18-HEP生长情况统计图。
[0038]图5为18-HEP及对照细胞在有无诱导剂条件下的Gl期细胞比例情况。
[0039]图6为18-HEP及对照细胞在废弃培养基中培养不同时间的细胞凋亡情况。
[0040]图7为有无诱导剂条件下CT-TF和18-TF细胞的重组蛋白rhTNFR-Fc表达情况；a为rhTNFR-Fc比产率统计图，b为rhTNFR-Fc总产量统计图。
【具体实施方式】
[0041]本发明提供了一种具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株18-HEP，该细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年5月31日，保藏编号为CGMCC N0.6176。
[0042]实施例1抗凋亡基因E1B-19K和调控蛋白基因BS-BV组成型共表达载体的构建
[0043](I)重叠 PCR 获 得 E1B-19K 基因
[0044]本发明采用的腺病毒基因E1B-19K通过重叠PCR得到，使用的引物序列如SEQ IDN0.3-16所示。具体步骤请参见图3，其中，第一步PCR(图3中第一行，其中的各数字，即为该步PCR中所用引物在本发明序列表中的编号)体系由各对引物、Pyrobest聚合酶及相应缓冲液和dNTPs组成；除最后一步PCR扩增外，其余步骤均无需进行PCR产物的纯化回收，也无需加入引物，只需直接将两个PCR体系以1:1混合，再补加适量Pyrobest聚合酶和dNTPs即可；最后一步的PCR体系由经过纯化的上一步PCR产物、引物SEQ 3/SEQ 16、Pyrobest聚合酶及相应缓冲液和dNTPs组成，扩增后得到5’和3’末端分别含Not I和Mlu I酶切位点的E1B-19K全长序列，其序列如SEQ ID N0.1所示。
[0045]各步PCR 反应条件均为:94°C，5min — (94°C，30s, 58°C，lmin, 72°C，lmin)重复 30个循环一72°C，lOmin。
[0046](2) E1B-19K和BS-BV组成型共表达载体的构建
[0047]将通过上述操作获得的E1B-19K片段通过Not I/Mlu I酶切位点连入同样经Not I/Mlu I酶切的pBudCE4.1载体(Invitrogen, USA)的EF-1 α启动子下游,得到的载体称为pBud-ElB。利用Afl I I/Not I酶切从pc-BS_BV载体上获得生物素诱导表达系统的调控蛋白BS-BV基因，补平，连入经Afl II/EcoR I酶切并补平的上述pBud_ElB载体的CMV启动子下游，得到同时组成型独立表达E1B-19K基因和BS-BV基因的载体，命名为pBud-ElB-BS-BV，其结构如图1所示。
[0048]实施例2响应于生物素的细胞周期控制基因P27Kipl诱导表达载体的构建
[0049]从商业化载体pCMV-SP0RT6_p27 (Open Biostystems, USA)上扩增 p27KiplcDNA 片段，所用引物为SEQ ID N0.17:
[0050]5’ -GACGCTAGCATGTCAAACGTGCGAGTGTCTAACG-3’ ；
[0051]及SEQ ID N0.18:[0052]5’ -GCTCTTAAGTTACGTTTGACGTCTTCTGAGG-3’。
[0053]PCR 反应条件为:94°C，5min — (94°C，30s, 58°C，lmin, 72°C，lmin)重复 30 个循环—72°C，10min。Nhe I/BamH I酶切上述片段，连入同样经Nhe I/BamH I酶切的生物素诱导表达系统响应载体pc-Hy-4BS0B-minCMV的响应启动子下游，得到响应于生物素的p27Kipl诱导表达载体pc-Hy-4BS0B-minp27,其结构如图2所示。
[0054]实施例3 HEK293细胞的代谢工程改造
[0055]将载体pBud-EIB-BS-BV 和 pc-Hy-4BS0B_minp27 共转染 HEK293 细胞，经 200 μ g/mL Zeocin和400 μ g/mL G418筛选两周，得到阳性混合克隆细胞。该混合克隆细胞通过有限稀释法进行单克隆化，按3cells/孔接种于96孔细胞培养板中，置于37°C，5%C02培养，约两周后，将单克隆孔消化传代，扩大培养，用于后续实验。
[0056]实施例4单克隆细胞株18-HEP体外培养性状的考察
[0057](I)有无诱导剂存在下细胞生长情况的考察
[0058]单克隆化得到的单克隆细胞株18-HEP与空载体转染的对照细胞，以2X104cells/mL接种于24孔 培养板，2天后每种细胞的一半更换为含200 μ mo I/L生物素的培养基，此后每天取样计数活细胞密度和细胞活力，统计结果如图4所示。结果可见，在诱导剂存在时，18-HEP细胞出现了明显的生长变慢的现象，培养过程中的细胞活力显著高于对照组，细胞生长衰退期延迟2天出现。在培养第6天取样，检测各组样品的细胞周期分布情况，统计结果请参见图5。结果显示，在诱导剂存在下，18-HEP细胞Gl期比例显著升高，由47.88%提高至66.92%。以上结果表明，18-HEP细胞在诱导剂存在时，可令细胞阻滞在Gl期而使细胞增殖速度显著降低。
[0059](2)废弃培养基的制备
[0060]将野生型HEK293细胞用含5%NBS (无生物素)的DF (无生物素)培养基重悬，以5X104cells/mL的密度接种于25cm2的细胞培养瓶中，8mL/瓶，始终不换液，培养7天后细胞长至汇合，将培养上清吸至离心管中，5000rpm离心5min以除去悬浮的细胞及细胞碎片，将上清收集至一个容器中，用7.5%NaHC03调节pH至7.2左右，置4°C保存备用。
[0061](3)细胞凋亡情况的考察
[0062]对照细胞和18-HEP细胞分别以5X 104cellS/mL的密度接种于24孔细胞培养板，待细胞贴壁后更换为上述废弃培养基，继续培养24h、72h和96h分别取样检测细胞凋亡情况，统计结果如图6所示。结果显示,与对照相比，18-HEP细胞在诱导不同时间细胞凋亡均显著减少，使凋亡细胞比例降低47-54%，表明18-HEP细胞具有比对照细胞增强的抗凋亡能力。
[0063]实施例5 18-HEP细胞株重组蛋白表达效果的考察
[0064]Nhe I/Not I酶切pc-TNFR-Fc-FRT载体获得rhTNFR-Fc片段，连入同样酶切的pcDNA3.1(+)载体，得到rhTNFR-Fc的组成型表达载体pc_TNFR_Fc。
[0065]pc-TNFR-Fc载体分别转染对照细胞和18-HEP细胞，经筛选得到的混合克隆分别称为CT-TF和18-TF，上述混合克隆细胞分别接种于IOOmL摇瓶，接种密度为2 X IO5ceIls/mL,接种体积35mL，每种4瓶。4天后向每种细胞中的2瓶添加200 μ mo I/L生物素，继续培养。于不同时间点取样，检测细胞生长情况、上清中的代谢指标和TNFR-Fc蛋白含量。非诱导条件下的18-TF细胞的rhTNFR-Fc比产率与对照细胞CT-TF无显著差异，而诱导增殖阻滞状态下的18-TF比产率升高I倍；非诱导条件下培养的18-TF在培养8天后的rhTNFR-Fc累积产量比CT-TF对照高56.8%，诱导条件下的rhTNFR-Fc累积产量进一步提高，比非诱导条件下的18-TF细胞高36.4%，比对照细胞CT-TF高1.1倍，统计结果如图7所示。结果表明，与对照细胞相比，18-H EP细胞重组蛋白生产效率显著提高。
【权利要求】
1.一种具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，其特征在于，所述细胞株是在HEK293细胞中组成型过表达腺病毒抗凋亡基因E1B-19K，所述腺病毒抗凋亡基因E1B-19K的序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，该细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年5月31日，保藏编号为CGMCC N0.6176。
2.如权利要求1所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，其特征在于，所述细胞株还在HEK293细胞株中诱导表达人细胞周期控制基因p27Kip1，使该细胞在诱导表达条件下发生增殖阻滞，细胞生长显著变慢，所述人细胞周期控制基因P27Kipl的序列如序列表中 SEQ ID N0.2 所示。
3.如权利要求2所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，其特征在于，所述诱导表达基因p27Kip1，是采用基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶、响应于生物素的诱导表达系统。
4.权利要求1-3中任意一项所述具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的建立方法，其特征在于，所述方法步骤如下: a.E1B-19K和BS-BV组成型共表达载体的构建: 利用序列如SEQ ID N0.3-16所示的引物，通过重叠PCR获得E1B-19K基因，其序列如SEQ ID N0.1所示j5Not I/Mlu I酶切后，连入同样经Not I/Mlu I酶切的pBudCE4.1载体的EF-1a启动子下游；用Afl I I/Not I从pc-BS-BV载体上酶切获得BS-BV基因，补平，连入经Afl II/EcoR I酶切并补平的pBud-ElB载体CMV启动子下游，得到同时组成型独立表达E1B-19K基因和BS-BV基因的载体，命名为pBud-EIB-BS-BV ； b.响应于生物素的p27Kipl诱导表达载体的构建:` 利用SEQ ID N0.17及SEQ ID N0.18所示引物从商业化载体pCMV_SP0RT6_p27上扩增得到p27KiplcDNA片段，Nhe I/BamH I酶切，连入同样酶切的pc-Hy-4BS0B_minCMV载体，得到响应于生物素的p27Kipl诱导表达载体pc-Hy-4BS0B-minp27 ； c.细胞转染及筛选: 将上述两载体pBud-EIB-BS-BV和pc-Hy-4BS0B_minp27共转染HEK293细胞，经200 μ g/mL Zeocin和400μ g/mL G418筛选两周，得到阳性混合克隆细胞。将上述混合克隆通过有限稀释法进行单克隆化，按3cells/孔接种于96孔细胞培养板中，置于37°C，5%C02培养，约两周后，将单克隆孔消化传代，扩大培养，用于后续实验。
5.一种用于建立权利要求1-3中任意一项所述具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的表达载体pBud-ElB-BS-BV，其特征在于，其序列如序列表中SEQ ID N0.19所示。
6.一种用于建立权利要求1-3中任意一项所述具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的表达载体pc-Hy-4BS0B-minp27,其特征在于,其序列如序列表中SEQ ID N0.20所示。
7.—组用于建立权利要求1-3中任意一项所述具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的重叠PCR引物，其特征在于，所述引物的序列分别如SEQ ID N0.3-16所示。
8.如权利要求7所述的一组重叠PCR引物，其特征在于，序列如SEQID N0.3和N0.4所示的引物、如SEQ ID N0.5和N0.6所示的引物、如SEQ ID N0.7和N0.8所示的引物、如SEQ ID N0.9和N0.10所示的引物、如SEQ ID N0.11和N0.12所示的引物、如SEQ ID N0.13和N0.14所示的引物、如SEQ ID N0.15和N0.16所示的引物，分别构成引物对。
9.权利要求1-3中任意一项所述的具有 抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株在重组蛋白生产方面的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103451154SQ201210182003
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年6月4日 优先权日:2012年6月4日
【发明者】叶玲玲, 陈昭烈, 李世崇, 刘红, 王启伟, 杨振西 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所