抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽及其制备方法和用途，本发明的多肽包括多肽序列“SPHSG”为：YGRKKRRQRRR-GYLSKVRGISEVL；或与该多肽序列同源性相似、功能相同的另一种多肽序列“MRSP”为：YGRKKRRQRRR-DVKGYLSKVRGISEVL。本发明为该多肽在涂层球囊和涂层支架中的应用提供实验依据。与传统的涂层药物相比，作为Mfn2自身的小片断，该多肽不具有化学药物的毒副作用和免疫原性，实用性也优于雷帕霉素，因此具有很广泛的应用前景和较大的临床应用价值。
【专利说明】抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种作用于血管平滑肌细胞的多肽及其衍生物，具体是指一种抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]动脉粥样硬化疾病已成为危害人类健康的第一杀手，且其发病率逐年快速上升，发病年龄日益年轻化。对于严重冠状动脉粥样硬化病变通常需要进行经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI),目前PCI已成为我国动脉粥样硬化疾病十分重要的治疗方法，2010年我国植入冠脉内支架数量已达30余万例，血管内支架已成为最常用的血管内植入物。在上世纪80年代末至90年代初期，经皮冠状动脉内血管成形术(Percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)是治疗冠心病的重要手段。然而，PTCA术后冠脉发生再狭窄的发生率高达30~50%，且约有20%的患者在6个月内需要再次行血运重建术。1986年金属裸支架(bare metal stent, BMS)问世,使支架术后再狭窄发生率显著降低。但由于BMS采用的支架平台为不锈钢(316L)，其组织相容性相对较差，大量研究显示BMS再狭窄率高达20~30%。2003年药物洗脱支架(drug elutingstents, DES)的问世，降低了 PCI术后心血管事件的发生率。第一代DES西罗莫斯洗脱(sirolimus-eluting)支架 Cypher 和紫杉醇洗脱(paclitaxel-eluting)支架获得了良好的早期疗效，支架术后再 狭窄率降至10%左右。但由于第一代DES选用的药物细胞毒性较高，支架涂层不可吸收且组织生物相容性差，延缓支架的内皮化，具有引发晚期支架内血栓(late angiographic stent thrombosis, LAST)形成的风险。因此，第二代 DES 支架平台多采用生物相容性较高的钴铬合金和药物涂层材料，并采用新的抗细胞增殖药物，如西罗莫斯衍生物佐他莫司、依维莫司、他克莫司、吡美莫司等。目前已用于临床的第二代DES主要有Endeavor支架(佐他莫司)和Xience V支架(依维莫司)。其中,Xience V支架米用的涂层药物为较低毒性的依维莫司，应用具有更好的生物相容性及药物控释功能的涂层(偏氟乙烯-六氟丙烯共聚物等)，涂层载药的25%于支架植入后的第一天释放，在I个月内释放75%，到达4个月时药物几乎完全释放，极少引起宿主反应，内皮细胞能快速的迁移并完全覆盖支架表面，可缩短抗血小板治疗时间半年以内，显著降低心脑血管事件发生率至6.8%。后续的SPIRIT 1-1V以及FUTURE1-1II等大型临床研究显示，其有效性和安全性均优于西罗莫司洗脱支架。然而，第二代DES的支架晚期血栓事件年发生率为0.4~0.6%，有一定的再狭窄发生率，依然存在很多不足。另外，药物涂层支架抑制血管平滑肌细胞增生、抑制内皮细胞愈合，导致在狭窄时间上的延迟和晚期血栓形成，易产生支架贴壁不全或产生血管瘤等，且不适合用于所有患者，包括对支架涂层药物过敏的患者，以及涂层药物局部应用的安全有效剂量和时间窗、药物代谢衰减后血管平滑肌增殖是否存在反跳现象等技术问题还有待研究。如何进一步提高抗血管再狭窄的效果成为亟待解决的问题，而要解决这些问题，重点在于优选可降解支架涂层材料和新的抗细胞增生药物，以提高第二代药物涂层支架的组织相容性和血液相容性。[0003]血管再狭窄是PCI引起去内皮化及机械性扩张引起血管损伤，触发血管平滑肌细胞的异常增殖和基质合成(内膜增生)。目前，临床上所应用的支架涂层药物虽然可以显著降低血管再狭窄的发生率，但总体的再狭窄发生率仍较高，治疗复杂病变，如分叉病变、慢性完全闭塞性病变的再狭窄率则更高。究其原因，可能与其主要通过抑制Ras下游的信号转导通路(如PI3K-AKT-mT0R)发挥抗细胞增殖作用有关。因此，有效的抑制局部血管平滑肌细胞增殖是防止支架术后再狭窄的关键措施。前期的研究中首次发现线粒体融合素基因2 (Mitofusin2，Mfn2，)是VSMCs胞浆中Ras蛋白的负向调控因子，通过抑制Ras-Raf-MAPK信号路径，使VSMC生长停滞于GO-Gl期而抑制其增殖；通过Ras-PI3K-Akt信号传导路径而促进细胞凋亡，nature cell biology 述评专家认为 HSG (hyperplasia suppressor gene增殖抑制基因)可为心脑血管增生性疾病提供新的防治方法。
[0004]Mfn2基因作为新近发现的一个基因，广泛分布于人体的心、脑、肾、肺、肝及血管壁等各种组织中。Mfn2基因的cDNA (complementary DNA互补DNA)全长为4161bp,其开放阅读框编码含有757个氨基酸的蛋白质，利用计算机软件分析蛋白质结构与功能得知，该基因存在多个结构位点:p21RAS特性结构(77-92氨基酸)、GTP结合位点(98-117氨基酸)、GTP结合功能区(117-264氨基酸)、PKA/PKG磷酸化位点(106、156、442氨基酸)，跨膜区(599-644氨基酸)。利用构建的携带大鼠全长Mfn2cDNA基因的重组腺病毒(Adv_Mfn2)，感染培养的大鼠血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs),可明显抑制ERKI/2的磷酸化水平，将细胞生长阻断在细胞周期的G0/G1期，对VSMCs增殖抑制率约为45%。进一步采用球囊损伤大鼠颈动脉造成再狭窄模型，将Adv-Mfn2注入损伤的血管壁，可明显抑制血管中膜和内膜VSMCs的增殖，抑制率分别为82%和97.2%，内膜和中膜的比值降低了 90%。由此可见，Mfn2是Ras基因的一个新的负向调控因子，亦是细胞增殖通路上一个新的调控点，因此又称之为增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene, HSG),它对于血管增殖性疾病的防治具有重要的意义。本研究组进一步的研究表明，Mfn2也能有效促进VSMCs的凋亡。Mfn2的表达在氧化应激诱导的VSMCs凋亡过中显著增加；高表达Mfn2可使培养的大鼠VSMCs的凋亡率达85% ;应用siRNA技术沉默Mfn2基因表达，则可有效减少氧化应激和高表达Mfn2所致的VSMCs凋亡。动物实验结果也表明，转染Adv_Mfn2至大鼠球囊损伤的血管壁，VSMC s的凋亡率可达18%。Western blot (蛋白质免疫印迹)检测结果显示，Mfn2可显著下调磷酸化Akt的表达，抑制Bcl-2的表达，促进Bax的表达，进而经由线粒体凋亡途径诱导VSMCs凋亡。此外，Mfn2可以抑制由氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的VSMCs增殖，并延缓大鼠动脉粥样硬化的进程。另有研究发现，过表达Mfn2可以通过PI3K-Akt (Akt protein kinase B蛋白激酶B)和线粒体凋亡途径诱导心肌细胞凋亡,抑制Mfn2的表达则可减少氧化应激诱导的心肌细胞凋亡。除此之外，高表达Mfn2还可以诱导多种肿瘤细胞，如A549 (肺癌细胞)、MCF-7 (乳腺癌细胞)、HT-29 (结肠癌细胞)、HeLa (宫颈癌细胞)、膀胱癌细胞等发生凋亡。上述这些研究都提示，Mfn2可望作为细胞增殖性疾病防治的新祀点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的就是要提供一种不仅具有抗VSMCs增殖的作用、还可以显著诱导血管平滑肌细胞的凋亡、并可以更有效的发挥抗血管成形术后的再狭窄的作用的抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽及其制备方法和用途。
[0006]为实现上述目的，本发明所提供的抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽，该多肽包括多肽序列“GYLSKVRGISEVL” ；或与该多肽序列同源性相似、功能相同的另一种多肽序列“DVKGYLSKVRGISEVL”。为了让多肽具有穿过细胞膜进入细胞的功能，在多肽序列N端加入TAT穿膜肽，从而合成多肽序列“SPHSG”为:YGRKKRRQRRR-GYLSKVRGISEVL ;或与该多肽序列同源性相似、功能相同的另一种多肽序列“MRSP”为:YGRKKRRQRRR-DVKGYLSKVRGISEVL。
[0007]随着穿膜肽研究的进展，未来会存在众多穿模性更强的穿膜序列，如目前有在TAT穿膜肽基础上改进的PTD4穿膜肽，其序列为“YARAAARQARA”。在本发明多肽序列前面加入PTD4穿膜肽后有可能进一步增强其诱导细胞凋亡和抑制增殖的效果。[0008]本发明还提供了抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽的制备方法，它包括如下步骤:
[0009](I)多肽合成是从C末端合成到N末端的，选择连有第一个氨基酸的2氯三苯甲基树脂，用一个带有砂芯的反应柱，装入0.1mmol (毫摩尔)的树脂，先用DMF (二甲基甲酰胺)，DCM (三氯甲烷)冲洗，浸泡20分钟；
[0010](2)按照序列依次选用Fmoc (芴甲氧羰酰基)保护的氨基酸，按照氨基酸，HOBT羟基苯并三氮唑，DIC (日本DIC公司，中文名称为迪爱生投资有限公司)树脂摩尔比4: 6:
4: I的量，用DMF5毫升溶解，添入反应柱，反应I个小时；
[0011](3)反应完毕，用茚三酮检测液检测，如果是树脂无色呈阴性，即认为偶联完全，可以进行下一步，如果是树脂蓝色呈阳性，重复此步实验；
[0012](4)偶联完毕，用20%的哌啶溶液冲洗树脂依次，并浸泡10分钟，用以脱去FMOC
(芴甲氧羰酰基)保护基团，重复两次；
[0013](5)依据合成序列依次加入保护氨基酸，直至最后一个氨基酸偶联完毕，并用哌啶脱保护；
[0014](6)合成的后处理:把树脂从合成反应柱中取出，放入一底部有烧结玻璃滤片的玻璃容器中，分别依次用DMF (二甲基甲酰胺)，DCM (二氯甲烷)，MeOH (甲醇)，DCM和MeOH的体积是树脂体积的5-10倍，冲洗树脂；
[0015](7)树脂冲洗完毕，另取一带玻璃塞的试管，配置20毫升裂解试剂，配置方式如下:
[0016]①:加17.5毫升TFA (三氟乙酸)于试管中；(TFA有强腐蚀性和挥发性，应在通风厨中操作);
[0017]②:加新鲜的重蒸酚0.5克；
[0018]③:加thioanisole (苯硫基甲烧)I毫升；
[0019]④:加anisole (苯甲醚)0.4毫升;
[0020](8)轻微震荡混匀，加入放入树脂的玻璃容器中，反应2.5小时，待反应完毕，用真空抽滤的办法分离树脂和裂解试剂。把裂解试剂放入一球形烧瓶中，用旋转蒸发的办法减压蒸去液体物质，只留下固体；
[0021](9)另取100毫升的冷乙醚加入球形烧瓶中，此时有大量的白色沉淀物质，为粗多肽；离心分离乙醚和多肽，丢弃上清乙醚，多肽继续用冷乙醚洗涤，离心，得到多肽粗品，冻干机冻干；[0022](10)用 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)高压液相色谱)纯化处理。
[0023]本发明还提供一种上述的多肽在冠脉支架和球囊涂层中的应用，该多肽可以提供制备新型冠脉涂层球囊和涂层支架所需的一种新药物。
[0024]本发明的优点在于:与目前主要的支架涂层药物依维莫司相比，MRSP和SPHSG可以直接抑制Ras，其抑制点更高，因此效果也更明显，因而可用于研制多肽涂层球囊与涂层支架，从而成为防治血管再狭窄等血管增殖性疾病的新靶点。另外，MRSP和SPHSG不仅具有抗VSMCs增殖的作用，还可以显著诱导血管平滑肌细胞的凋亡，可以更有效的发挥抗血管成形术后的再狭窄的作用。而且由于MRSP和SPHSG是人体Mfn2自身的小分子蛋白片段，没有一般化学药物的毒副作用，却具有化学药物不可比拟的生物相容性和血液相容性，能有效抗血管成形术后的再狭窄，提高支架植入术后的长期疗效和安全性，是抗细胞增生药物洗脱支架较为理想的新型低细胞毒涂层药物。
[0025]本发明多肽在冠脉支架涂层中的应用与传统的涂层药物相比，作为Mfn2自身的小片断，该多肽不具有化学药物的毒副作用和免疫原性，实用性和安全性也优于雷帕霉素或紫杉醇等传统涂层支架，因此具有很广泛的应用前景和较大的临床应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是本发明采用流式细胞仪检测细胞凋亡率的流式图。
[0027]图2是本发明采用流式细胞仪检测细胞凋亡率的柱状图。
[0028]图3是本发明的Caspase3酶活性检测结果图。
[0029]图4是本发明的TUNEL (原位末端转移酶标记技术)比色法检测细胞凋亡的镜下图。
[0030]图5是本发明的TUNEL (原位末端转移酶标记技术)比色法检测细胞凋亡率的柱状图。
[0031]图6是本发明的Western Blot方法检测磷酸化Akt (p-AKT)的表达水平。
[0032]图7是本发明的Western Blot方法检测磷酸化Akt (p-AKT)的表达水平的各组相对灰度比值。
[0033]图8是本发明的细胞计数法检测各组对细胞增殖的抑制作用的曲线图。(CBS作为阳性对照，检测MRSP和SPHSG对细胞增殖的抑制作用)
[0034]图9是本发明的细胞计数法检测各组对细胞增殖的抑制作用的曲线图。(Rapamycin作为阳性对照，检测MRSP和SPHSG对细胞增殖的抑制作用)
[0035]图10是本发明的CCK-8法检测各组对细胞增殖的抑制作用的曲线图。(CBS作为阳性对照，检测MRSP和SPHSG对细胞增殖的抑制作用)
[0036]图11是本发明的CCK-8法检测各组对细胞增殖的抑制作用的曲线图。(Rapamycin作为阳性对照，检测MRSP和SPHSG对细胞增殖的抑制作用)
[0037]序列表1为“ SPHSG”序列。
[0038]序列表1I为“MRSP”序列。
【具体实施方式】[0039]以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0040]本发明抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽，该多肽包括多肽序列“SPHSG”为:YGRKKRRQRRR-GYLSKVRGISEVL ;或与该多肽序列同源性相似、功能相同的另一种多肽序列“MRSP”为:YGRKKRRQRRR-DVKGYLSKVRGISEVL。制备本发明的多肽的方法步骤如下:
[0041]1、多肽合成是从C末端合成到N末端的，选择连有第一个氨基酸的2氯三苯甲基树脂，用一个带有砂芯的反应柱，装入0.1mmol的树脂，先用DMF，DCM冲洗，浸泡20分钟。
[0042]2、依次选用(按照序列)Fmoc保护的氨基酸，按照氨基酸，HOBT, DIC树脂摩尔比4:6:4:1的量，用DMF5毫升溶解，添入反应柱，反应I个小时。
[0043]3、反应完毕，用茚三酮检测液检测，如果是阴性(树脂无色)，即认为偶联完全，可以进行下一步，要是阳性(树脂蓝色)，重复此步实验。
[0044]4、偶联完毕，用20%的哌啶(DMF)溶液冲洗树脂依次，并浸泡10分钟，用以脱去FMOC保护基团，重复两次。
[0045]5、依次加入保护氨基酸(依据合成序列)。直至最后一个氨基酸偶联完毕，并用哌淀脱保护。
[0046]6、合成的后处理:把树脂从合成反应柱中取出，放入一底部有烧结玻璃滤片的玻璃容器中，分别依次用DMF (二甲基甲酰胺)，DCM (二氯甲烷)，MeOH (甲醇)，DCM和MeOH的体积是树脂体积的5-10倍，冲洗树脂。
[0047]7、树脂冲洗完毕，另取一带玻璃塞的试管，配置20毫升裂解试剂，配置方式如下:`[0048](I)加17.5毫升TFA (三氟乙酸)于试管中；(TFA有强腐蚀性和挥发性，应在通风厨中操作);
[0049](2)加新鲜的重蒸酚0.5克；
[0050](3)加 thioanisolel 毫升；
[0051](4)加 anisole0.4 毫升。
[0052]8、轻微震荡混匀，加入放入树脂的玻璃容器中，反应2.5小时。待反应完毕，用真空抽滤的办法分离树脂和裂解试剂。把裂解试剂放入一球形烧瓶中，用旋转蒸发的办法减压蒸去液体物质，只留下固体。
[0053]9、另取100毫升的冷乙醚加入球形烧瓶中，此时有大量的白色沉淀物质，为粗多肽。离心分离乙醚和多肽，丢弃上清乙醚，多肽继续用冷乙醚洗涤，离心，得到多肽粗品，冻干机冻干。
[0054]10、用HPLC纯化处理。
[0055]对上述制备的多肽的医学实验结果如下:
[0056]实验例一:流式细胞术检测平滑肌细胞的凋亡
[0057]1、取第4-9代的大鼠VSMCs，准确计数后按5X IO5个细胞/孔接种于六孔板中，加A 2ml DMEM (dulbecco's modified eagle medium细胞培养基)高糖培养基,每组可设3个复孔，于37°C、5%C02的细胞培养箱中继续培养24小时。
[0058]2、同步化，吸弃各个实验孔内的培养基,无菌PBS (phosphate buffer solution磷酸盐缓冲液)洗2次，注意操作要轻柔，尽量避免将细胞吹起，然后用移液枪分别向各个实验孔内加入2ml无血清DMEM培养基。按25 μ mo I/L的浓度分别向各实验组加入SPHSG、MRSP和NC (无效对照)，空白组只加无血清的培养基，混合均匀后置于细胞培养箱中继续培养 24h。
[0059]3、作用细胞24h、48h、72h收集细胞，由于有部分已经凋亡的细胞漂浮于细胞培养基中，因此培养基也应一并被收集。
[0060]4、将收集的细胞悬浮液置于15ml无菌离心管中，注意应浆细胞收集完全，以免影响细胞凋亡率的检测，然后1000rpm，6min，4°C离心，弃上清。用已经1ml预冷的PBS缓冲液洗一次，再次离心，弃上清。1mllXBinding Buffer重悬细胞(Binding Buffer结合缓冲液)，吹打轻柔使细胞均匀分布，离心1000rpm,6min,4°C,弃上清。1OOu 11 XBindingBuffer重悬细胞。
[0061]5、加 5 ul Annexin V PE (Annexin V Phycoerythrin 藻红蛋白标记的膜联蛋白V)到细胞悬液中，室温，静置10-15min，待反应完全后避光加入5 U17-AAD(7-Aminoactinomycin D氨基放线菌素D),轻柔混匀,4°C冰箱避光放置。
[0062]6、4h内用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。
[0063]7、结果显示:如图1和图2所示，SPHSG和MRSP作用平滑肌细胞后48h和72h，与空白对照组Control及无效对照组NC相比，有显著的促进平滑肌细胞凋亡的效应(P<0.05),且时间越长，凋亡效果越明显；作用细胞48h后，Control组和NC组的细胞凋亡率分别为(7.7±0.7) %和(8.9±1.5) %，两组间无明显统计学差异(P > 0.05)，MRSP组凋亡率为(20.9±0.8) %，SPHSG组凋亡率为(28.0±1.9) %，较MRSP组明显增加(P < 0.05);作用细胞72h后，Control组和NC组的细胞凋亡率分别为(12.0±0.5) %和(13.45±0.4) %，两组间无明显统计学差异(P > 0.05)，MRSP组凋亡率为(33.0±1.5) %，SPHSG组凋亡率为(48.7 ± 6.3 ) %，较MRSP组明显增加(P < 0.05 )，两组间有统计学差异。
[0064]实验例二:Caspase3酶活性检测
[0065]1、取第4-9代的大鼠VSMCs，准确计数后按1 X 1O6个细胞/孔接种于60mm细胞培养皿中，加入3ml DMEM高糖培养基，每组可设3个复孔，于37°C、5%C02的细胞培养箱中继续培养24小时。
[0066]2、同步化，吸弃各个实验孔内的培养基，无菌PBS洗2次，注意操作要轻柔，尽量避免将细胞吹起，然后用移液枪分别向各个实验孔内加入3ml无血清DMEM培养基。按25 u mo l/L的浓度分别向各实验组加入SPHSG、MRSP和NC，空白组只加无血清的培养基，混合均匀后置于细胞培养箱中继续培养8h。
[0067]3、在细胞未进入晚期凋亡的时候收集细胞，将细胞收集完全。
[0068]4、将收集的细胞悬浮液置于15ml无菌离心管中，离心450g，10min，4°C，弃上清，用2ml冷PBS缓冲液洗一次，再次离心，弃上清。
[0069]5、向细胞沉淀中加入1Oul细胞裂解液，将细胞反复吹打均匀后，反复冻融3次，使细胞完全裂解，然后将已经裂解的细胞悬液置于冰上，孵育15min。
[0070]6、离心细胞悬液，15000g，20min，4°C，收集细胞提取物，即细胞上清。在96孔板中配制反应体系，如下表:
[0071]
【权利要求】
1.一种抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽，其特征在于:该多肽包括多肽序列“SPHSG”为:YGRKKRRQRRR-GYLSKVRGISEVL ;或与该多肽序列同源性相似、功能相同的另一种多肽序列 “MRSP” 为:YGRKKRRQRRR-DVKGYLSKVRGISEVL。
2.如权利要求1所述的抑制细胞增殖并诱导其凋亡的多肽的制备方法，它包括如下步骤: (1)多肽合成是从C末端合成到N末端的,选择连有第一个氨基酸的2氯三苯甲基树月旨，用一个带有砂芯的反应柱，装入0.1mmol的树脂，先用二甲基甲酰胺、三氯甲烷冲洗，浸泡20分钟； (2)按照序列依次选用芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，按照氨基酸，羟基苯并三氮唑，DIC树脂摩尔比4: 6: 4: I的量，用二甲基甲酰胺5毫升溶解，添入反应柱，反应I个小时； (3)反应完毕，用茚三酮检测液检测，如果是树脂无色呈阴性，即认为偶联完全，可以进行下一步，如果是树脂蓝色呈阳性，重复此步实验； (4)偶联完毕，用20%的哌啶溶液冲洗树脂依次，并浸泡10分钟，用以脱去芴甲氧羰酰基保护基团，重复两次； (5)依据合成序列依次加入保护氨基酸，直至最后一个氨基酸偶联完毕，并用哌啶脱保护； (6)合成的后处理:把树脂从合成反应柱中取出，放入一底部有烧结玻璃滤片的玻璃容器中，分别依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积是树脂体积的5-10倍，冲洗树脂； (7)树脂冲洗完毕，另取一带玻璃塞的试管，配置20毫升裂解试剂，配置方式如下: ①:加17.5毫升三氟乙酸于试管中； ②:加新鲜的重蒸酚0.5克； ③:加苯硫基甲烧I毫升； ④:加苯甲醚0.4毫升； (8)轻微震荡混匀，加入放入树脂的玻璃容器中，反应2.5小时，待反应完毕，用真空抽滤的办法分离树脂和裂解试剂；把裂解试剂放入一球形烧瓶中，用旋转蒸发的办法减压蒸去液体物质，只留下固体； (9)另取100毫升的冷乙醚加入球形烧瓶中，此时有大量的白色沉淀物质，为粗多肽；离心分离乙醚和多肽，丢弃上清乙醚，多肽继续用冷乙醚洗涤，离心，得到多肽粗品，冻干机冻干; (10)用高压液相色谱纯化处理。
3.如权利要求1所述的多肽在冠脉支架和球囊涂层中的应用。
【文档编号】C07K19/00GK103613669SQ201310571421
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】郭小梅, 糜涛, 钱翠平, 白静, 刘纯, 刘晓雯, 彭稳中, 陈光慧 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院