一种肿瘤抑制多肽及用途
【专利摘要】本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高效抑制血管生成多肽及其制备方法及用途。本发明设计了具有细胞穿入性的高效的血管生成抑制剂Tumstatin-7-TAT,该抑制剂含有tumstatin活性片段氨基酸序列（185-191），在其羧基端连接具有细胞穿越性的反式激活蛋白TAT(trans-activator?protein)的第47位到第57位氨基酸残基组成的肽段。该融合肽对人脐静脉内皮细胞的迁移有很好的抑制作用，并对人肝癌细胞,乳腺癌细胞都有很好的抑制作用，可用于制备血管生成抑制剂，各种肿瘤相关疾病等药物。
【专利说明】一种肿瘤抑制多肽及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高效抑制血管生成多肽、其制备方法及用途。
【背景技术】
[0002]研究表明肿瘤组织的最大的一个特点为具有丰富的血管生成，即从宿主引发的新的毛细管内皮细胞的形成和转移是肿瘤生长和转移的必备条件。新生血管一方面给肿瘤提供了其恶性增长所需的营养，另一方面给肿瘤向远处转移提供了途径。如果在肿瘤形成过程中能抑制其血管内皮细胞的生成和迁移，就可以阻止肿瘤的生长和转移。因此抑制肿瘤血管生成是肿瘤治疗中日渐引起重视的一类药物，继血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)这两种已进入美国临床试验的药物之后，Tumstatin是近年来发现的一种能够抑制新生血管生成的蛋白药物。Tumstatin是胶原alpha3 (IV)的NCl结构域，由245个氨基酸组成，具有抑制肿瘤新生血管生成和抑制肿瘤的生长和转移作用，这两种抗肿瘤的特性与一种非RGD依赖性的ITGB3介导的机制密切相关。Tumstatin经由与内皮细胞膜上的整合素alpha v beta3结合而抑制FAK (focal adhesion kinase)的磷酸化而进一步抑制PI3-K/Akt/mT0R/4EBPl信号转导通路的活化，从而抑制内皮细胞蛋白质的合成，进而抑制内皮细胞的增殖，最终抑制肿瘤新生血管生长及肿瘤的生长和转移(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2003，100:4766-4771)。
[0003]最近，小鼠黑色素瘤模型的药理实验(J Biol Chem.2004，279 (3):2091-100)证明Tumstatin的NCl (IV) N端7个氨基酸185-191 (CNYYSNS)组成的肽也具有同样的抗肿瘤生长的特性，其在三维结构上共同的特征是YSNS序列呈beta-转角构象，这种构象是维持其生物活性的至关重要的条件。
[0004]组织穿入是向细胞递送药物的严重限制之一，如何有效地把药物内化至细胞内是药物传输中的一个重要课题。目前为止，发现了两种类型的细胞穿入肽(cell-penetringpeptide), 一类是疏水性的，一类是阳离子型的(Adv Drug Deliv Rev2005, 57，529-45)。Tat是其中一种可以把核酸和蛋白质引入细胞的阳离子型肽(Nat Med2007，12，327-78 ；Trends cell Bioll998 ;8，84_7)。并且在体内外的实验中，TAT与多肽结合后确实显示了其可将药物内化至细胞内的辅助作用，从而增强了目的药物的效果(Mol Ther.2009，17(9):1509-16.)。因此，TAT序列可以作为一种载体，将抗肿瘤多肽转运如细胞内部，最大程度的发挥抗肿瘤多肽的效果。故联合应用细胞穿入肽和抗肿瘤多肽的研究更有意义。
【发明内容】
[0005]本发明将抑制血管生成的tumstatin活性片段氨基酸序列(185-191)(Tumstatin-7),在其羧基端 连接具有细胞穿越性的反式激活蛋白TAT (trans-activatorprotein)的第47位到第57位氨基酸残基组成的肽段序列，构建了一种具有细胞内化作用的血管生成抑制剂Tumstatin-7-TAT。本发明多肽序列为SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。它具有不同的理化性质，等电点由融合前的5.52变为11.40，水溶性也大大增加，从而减少有机性增溶溶媒的使用，而避免在临床使用中引起的不良反应。
[0006]本发明还公开了所述血管生成抑制剂的制备方法，包括:
[0007](I)依据本发明所述具有抑制血管生成作用的多肽序列，按常规方法设计得到相应的基因序列；
[0008](2)将上述人工合成的基因与原核载体进行重组，转化至大肠杆菌，乳糖诱导表达包含本发明所述具有抑制血管生成的多肽Tumstatin-7-TAT ;表达产物以胞内可溶表达形式存在；
[0009](3)收集破碎后的菌体上清，进行金属螯合亲和层析，肠激酶酶切，收集穿过液，冻干。
[0010]本发明所述的血管生成抑制剂还也可用多肽合成方法制备。
[0011]体内及体外活性药效试验显示，本发明的多肽具有抑制人脐静脉内皮细胞的迁移和抑制人肝癌细胞的功效，还具有抑制人乳腺癌细胞增殖作用及小鼠体内抗肿瘤功效。
[0012]本发明所述的血管生成抑制剂是在tumstatin活性片段氨基酸序列(185-191)的基础上构建获得的，与现有技术相比，本发明所述的产物在体内及体外都显示了比原有tumstatin活性片段氨 基酸序列(185-191)更强的抑制内皮细胞迁移及抑制肿瘤生长的效果，且具有更高的稳定性，说明本发明所设计并制备的的融合多肽合理可行，可作为肿瘤的治疗药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1 是 TrxA-Tumstatin-7-TAT 的 SDS-PAGE 图(1:蛋白质分子量 Markers ;2:未诱导的工程菌；3:诱导后的工程菌；4:亲和层析分离后的重组蛋白)
[0014]图2是Tumstatin-7-TAT体外抑制内皮细胞迁移效果
[0015]图3是Tumstatin-7-TAT体外抑制黑色素瘤细胞增殖效果
[0016]图4是Tumstatin-7-TAT体内抑制黑色素瘤效果
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018]Tumstatin-7-TAT基因的克隆及表达载体构建与表达纯化
[0019]依据本发明设计血管生成抑制剂Tumstatin-7-TAT的氨基酸序列转换成基因序列，同时在基因的上游引入肠激酶识别序列DDDDK，5’及3’端的加入的酶切位点为KpnI和Hindlll。将合成后的基因导入原核表达载体pET32a构建得到重组表达载体，并以氯化钙转化法转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，其表达的氨基酸序列如下=TrxA-HisTag-DDDDK-CNYYSNSGGY GRKKR RQRRR0将重组菌以5-10mmol/L乳糖诱导表达4小时，收获细胞并超声破碎，以N1-1MAC金属螯合亲和层析进行纯化，得到本发明多肽，以SDS-PAGE检测结果详见图1。
[0020]实施例2
[0021]体外抑制内皮细胞迁移实验
[0022]取对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以I X IO5/孔的密度接种于24孔板，以含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液来培养，待细胞生长面积达90%后，改无血清的RPMI1640培养液使细胞饥饿过夜，然后用200 μ L Tip头在孔中央对细胞做一个约1.0mm左右的划痕，然后用无血清的RPMI1640培养液冲洗掉悬浮的细胞，然后分别与100 μ mol/L的Tumstatin-7-TAT或Tumstatin-7孵育，用无血清的RPMI1640培养液作为阴性对照组，在培养0，24，36h后置I X 105的倒置显微镜下拍照记录。
[0023]结果表明，对人脐静脉内皮(HUVEC)细胞，本发明的血管生成抑制剂Tumstatin-7-TAT具有与Tumstatin-7几乎一样的抑制内皮细胞迁移的效果，详细如图2所示。以上实验结果表明本发明的血管生成抑制剂Tumstatin-7-TAT可以显著抑制人脐静脉内皮(HUVEC)细胞的迁移。
[0024]实施例3
[0025]体外抑制黑色素瘤细胞增殖实验[0026]取对数生长期的B16F10细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培养基配成细胞悬浮液，以每孔5000个细胞接种于96微孔板中，每孔体积100 μ I, 37°C，5%C02孵箱中培养 7-8h0 每孔加入不同浓度药物(0.4,0.8,1.6,3.2,6.3,12.7，25.4，50.8，101.5 μ mol/L) 100 μ 1，，以1640培养基处理组为阴性对照组10 μ g/ml紫衫醇为阳性对照组(每个药物浓度设5个复孔)100ul。37°C，5%C02条件下处理24h后，每孔加入20 μ 1，5g/L的MTT，继续培养4h，吸净培养基，每孔加入150 μ I DMSO溶解MTT甲瓒沉淀，振荡使其充分溶解后，测570nm波长处的吸光度(A)值，并以630nm处为参比波长。按以下公式可计算肿瘤细胞生长抑制率:肿瘤细胞的生长抑制率(％)=[(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值]。
[0027]结果表明，对B16F10细胞，本发明的血管生成抑制剂Tumstatin_7_TAT的肿瘤细胞生长的抑制率在6.25~400 μ mol/L的浓度范围内皆比Tumstatin-7高，比如在浓度为25 μ mol/L时，Tumstatin-7-TAT的抑制率为34.04%，而Tumstatin-7的肿瘤细胞的生长抑制率为0.25%(p〈0.001)，详细如图3所示。以上实验结果表明本发明的血管生成抑制剂Tumstatin-7-TAT可以显著抑制B16F10肿瘤细胞的生长。
[0028]实施例4
[0029]小鼠B16F10黑色素瘤模型抑瘤实验
[0030]制备5X 106/mlB16F10细胞悬液鼠模型，以0.1ml接种于小鼠右侧腋下而建立鼠源黑色素瘤移植瘤，等皮下移植瘤体积生长至100mm3左右时，将小鼠随机分成4组Gl阴性对照组)G2紫杉醇组)(G3Tumstatin-7_TAT组)G4Tumstatin_7组)每组8只。Gl每天皮下注射生理盐水0.1ml; G2皮下注射紫杉醇10mg/kg, 2天I次；G3皮下注射Tumstatin-7-TAT,给药量为10mg/kg，l，3，5，7，9d时注射；G4组为皮下注射Tumstatin-7，给药量为10mg/kg，l，3，5，7，9d时注射。用游标卡尺每隔一天测量移植瘤直径，肿瘤体积(TUMOR VOLUME, TV)的计算公式为:TV=1/2*A*B2其中A，B分别表示长宽；以给定时间内的肿瘤抑制率来表示治疗效果；肿瘤抑制率的公式为(1-T/C) X 100%。T和C分别表示治疗组和对照组的肿瘤体积。结果表明，在第13天是,Tumstatin-7-TAT的肿瘤抑制率为52.10%,而Tumstatin-7的抑制率为30.77%(p〈0.05)，详细如图4所示。以上实验结果表明本发明的血管生成抑制剂Tumstatin-7-TAT可以显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。
[0031]
【权利要求】
1.一种肿瘤抑制多肽，其具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽的制备方法，包括:设计得到权利要求1多肽的对应核苷酸序列，构建羧基端含有如权利要求1的氨基酸序列所对应基因的载体，进行基因工程表达和分离纯化。
3.权利要求1的多肽用于制备抑制人脐静脉内皮细胞的迁移或抑制黑色素瘤细胞增殖的药物的用途。
4.权利要求1的多肽用于制备治疗人新生血管生成有关的肿瘤疾病的药物的用途。
【文档编号】C07K7/08GK103897038SQ201410147068
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】劳兴珍, 张冉, 李斌, 郑珩, 林雅芝 申请人:中国药科大学