具有改进的细胞免疫诱导能力的口服疫苗的制作方法
【专利说明】具有改进的细胞免疫诱导能力的口服疫苗发明领域
[0001]本发明涉及一种用于预防或治疗病原体感染性疾病的口服制剂。本发明还涉及用于诱导针对靶抗原的细胞免疫的口服制剂。
[0002]发明背景
[0003]据推测，世界上不低于50 %的成年人感染人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus, HPV)，并且在乳头状瘤病毒中，已证实特别是HPV 16，18，31和45这四种类型会导致不低于80%的宫颈癌(非专利文献1)。
[0004]在世界各地，宫颈癌是在女性中次于乳腺癌高度频繁出现的癌症，并且根据世界卫生组织，全世界每年产生不小于500，000名宫颈癌患者，且推测每年不低于300，000人死于宫颈癌。特别是在发展中国家和欠发达国家，它是女性死亡的主要原因(非专利文献2)。根据IARC统计，据报道，在发展中国家，特别是相比于发达国家而言慢性感染的人数极高的发展中国家中最有效根除HPV感染的长期方法是HPV预防性疫苗的施用。
[0005]涉及宫颈癌的疫苗发展的方法主要集中在两个方面:预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗旨在通过由HPV L1/L2抗原蛋白产生的强中和抗体保护宿主免于HPV感染。另一方面，当已证实HPV感染时，靶向HPV E6/E7的治疗性疫苗旨在诱导特异性细胞免疫以防止疾病的进展，或引起已形成的损伤和恶性肿瘤的消退。
[0006]由于HPV的E6/E7蛋白是涉及感染HPV的细胞的癌化等的癌症特异性抗原，已经研究了利用E6/E7蛋白作为宫颈癌免疫治疗靶标的治疗性疫苗。实际上，报道已经记录了将通过微生物系统合成的HPV E6/E7蛋白施用于注射了肿瘤细胞的大鼠抑制或延迟了肿瘤形成(非专利文献3，4和5)。
[0007]考虑到这样的事实，即感染HPV的人主要集中在较不发达的国家，强烈地需要发展经济且稳定地生产针对HPV的疫苗的方法，以预防和治疗由乳头状瘤病毒所造成的宫颈癌。
[0008]本发明人开发了用于宫颈癌的治疗性疫苗，其含有作为活性成分的经杀死的乳酸菌，所述乳酸菌在表面上表达HPV E7蛋白。这种治疗性疫苗口服施用，以使E7蛋白经由肠被吸收到患者中并在子宫颈中诱导针对E7蛋白的特异性细胞免疫，从而防止感染HPV的患者(例如，具有宫颈癌癌前损伤CIN3的患者)免于转变成宫颈癌。该疫苗在临床测试中显示了出众的安全性和有效性(非专利文献6)。
[0009]目前，在一个正在进行的探查性临床测试中，制备经杀死的在表面上表达HPV E7蛋白(其是口服治疗性疫苗的活性成分)的乳酸菌的生产成本比较昂贵。如果即使通过从在探查性临床测试中的剂量(4个250mg胶囊，每天一次)降低剂量可以显示等同于目前的有效性的功效，那么制备的成本变低，治疗药物的实用化变高，并且可以减少患者的经济负担。
[0010]与此相反，口服摄入的细颗粒经肠进入机体的吸收受细颗粒的肠系膜Μ细胞通透性调节。已知的是，具有超过ΙΟμπι大小的颗粒显示明显较低的Μ细胞吞噬作用(非专利文献7)。
[0011][文件列表]
[0012][非专利文献]
[0013]非专利文献1: Lowy, D.R.et al., Proc.Nat.Acad.Sc1., 91:2436, 1994
[0014]非专利文献2:Pisani, P.et al., Int.J.Cancer, 55:891, 1993
[0015]非专利文献3:Gao, L.et al.，J.Gen.V1l.，75:157, 1994
[0016]非专利文献4:Meneguzzi, G.et al., Virology, 81:62, 1991
[0017]非专利文献5: Sophie H.et al., Anticancer Res, Jul 2004;24:2265-2276
[0018]非专利文献6:Kei Kawana, Medical Tribune, November, 3, 2011 (VOL.44 N0.44)p.46
[0019]非专利文献7:Tabata Y, Ikada Y.Adv Polym Sci 94:107-141, 1990
[0020]发明概述
[0021]本发明要解决的问题
[0022]鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种用于减少口服治疗性疫苗的有效剂量的配制剂技术，所述口服治疗性疫苗含有作为活性成分的经杀死的在表面上表达靶抗原的乳酸菌。
[0023]解决问题的方式
[0024]本发明人考虑，一旦可以通过破坏经杀死的在表面上表达靶抗原的乳酸菌来降低其粒度，从而改进肠系膜Μ细胞通透性，机体内的吸收效率增加，伴随着该抗原特异性细胞免疫诱导效力增加，并可减少通过口服施用的治疗性疫苗的有效量。正如预期的，当将经杀死的乳酸菌粉碎为较小的粒度时，肠系膜Μ细胞通透性增加得更多，并且透过肠系膜Μ细胞的靶抗原的量增加，这使用体外Μ细胞模型证实。通过将具有174.2 μπι粒度的经杀死的乳酸菌(其是药物物质)破裂成30μπι或2.68μπι粒度，改善了通过口服施用导致的抗原特异性细胞免疫诱导能力。然而，预料不到地，当将经杀死的乳酸菌微粒化到低于2.68 μπι的大小时，在体外模型中改善了肠系膜Μ细胞的通透性，但抗原特异性细胞免疫诱导能力反而降低了。基于这些发现，进行了进一步研究，其导致本发明的完成。
[0025]因此，本发明涉及以下内容:
[0026][1]用于预防或治疗病原体感染性疾病的口服制剂，所述口服制剂包含经杀死的在表面上表达所述病原体的抗原的乳酸菌或其微粒化形式，其具有2.68-30 μπι的平均粒度。
[0027][2], [1]的口服制剂，其中所述病原体是胞内感染性病原体。
[0028][3], [2]的口服制剂，其中所述胞内感染性病原体是病毒。
[0029][4], [3]的口服制剂，其中所述病毒是人乳头状瘤病毒。
[0030][5], [1]的口服制剂，其中所述病原体抗原是病原体的内部抗原。
[0031][6], [5]的口服制剂，其中所述病原体抗原是Ε7。
[0032][7], [1]的口服制剂，用于通过诱导针对病原体抗原的细胞免疫来预防或治疗病原体感染性疾病。
[0033][8],用于诱导针对靶抗原的细胞免疫的口服制剂，所述口服制剂包含经杀死的在表面上表达所述靶抗原的乳酸菌或其微粒化形式，其具有2.68-30 μπι的平均粒度。
[0034][9], [8]的口服制剂，其中所述靶抗原是病原体抗原。
[0035][10].[9]的口服制剂，其中所述病原体是胞内感染性病原体。
[0036][11].[10]的口服制剂，其中所述胞内感染性病原体是病毒。
[0037][12].[11]的口服制剂，其中所述病毒是人乳头状瘤病毒。
[0038][13].[9]的口服制剂，其中所述病原体抗原是病原体的内部抗原。
[0039][14].[9]的口服制剂，其中所述病原体抗原是E7。
[0040][15].经杀死的在表面上表达靶抗原的乳酸菌或其微粒化形式，其具有2.68-30 μπι的平均粒度，用于通过口服施用来预防或治疗病原体感染性疾病。
[0041][16].[15]的经杀死的乳酸菌或其微粒化形式，其中所述病原体是胞内感染性病原体。
[0042][17].[16]的经杀死的乳酸菌或其微粒化形式，其中所述胞内感染性病原体是病毒。
[0043][18].[17]的经杀死的乳酸菌或其微粒化形式，其中所述病毒是人乳头状瘤病毒。
[0044][19].[15]的经杀死的乳酸菌或其微粒化形式，其中所述病原体抗原是病原体的内部抗原。
[0045][20].[19]的经杀死的乳酸菌或其微粒化形式，其中所述病原体抗原是Ε7。
[0046][21].[15]的经杀死的乳酸菌或其微粒化形式，其中通过诱导针对病原体抗原的细胞免疫来预防或治疗所述病原体感染性疾病。
[0047][22]用于预防或治疗病原体感染性疾病的方法，其包括将有效量的经杀死的在表面上表达病原体的抗原的乳酸菌或其微粒化形式口服施用于患者，所述经杀死的乳酸菌或其微粒化形式具有2.68-30 μπι的平均粒度。
[0048][23].[22]的方法，其中所述病原体是胞内感染性病原体。
[0049][24].[23]的方法，其中所述胞内感染性病原体是病毒。
[0050][25].[24]的方法，其中所述病毒是人乳头状瘤病毒。
[0051][26].[22]的方法，其中所述病原体抗原是病原体的内部抗原。
[0052][27].[26]的方法，其中所述病原体抗原是Ε7。
[0053][28].[22]的方法，用于通过诱导针对病原体抗原的细胞免疫来预防或治疗病原体感染性疾病。
[0054]发明效果
[0055]根据本发明，对口服施用的靶抗原的细胞免疫诱导能力可以通过设定经杀死的在表面上表达靶抗原的乳酸菌或其微粒化形式的平均粒度以落入2.68-30 μπι的范围内来改善，因此，可以减少含有作为有效成分的经杀死的乳酸菌的口服疫苗的有效量。
[0056]附图简述
[0057]图1显示了经杀死的乳酸菌在非微粒化制剂(平均粒度174.2 μ m)和微粒化制剂(粒度0.12 μ m)中的粒度分布。
[0058]图2显示了经杀死的乳酸菌在微粒化制