调控调节性T细胞和Th17细胞相互转化的药物筛选方法

专利名称：调控调节性T细胞和Th17细胞相互转化的药物筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种调控调节性T细胞和Thl7细胞相互转化的药物筛选方法， 可高效、可靠的对新化合物、天然药物活性进行快速初步筛选和评价，属细胞生 物学、免疫学、分子生物学和药理学技术领域。
技术背景自身免疫性疾病是一种免疫细胞介导的危害人类健康的疾病，常伴有多器官 的损伤，多系统的累及，重者威及生命。激素等免疫抑制剂作为目前治疗的一线 药物，常常因为严重的副作用导致病情加重，甚至治疗终止。而随着环境污染和 生活工作压力的改变，自身免疫性疾病的发病率在逐年增加。寻找安全有效的治 疗自身免疫病的药物已经成为世界范围深入研究的课题。自身免疫性疾病常伴有免疫耐受的破坏。免疫耐受对于维持体内免疫平衡和 防止自身免疫性疾病很重要。胸腺首先会清除自身反应性T细胞，如果胸腺不能 完全去除自身反应性T细胞，此时健康个体并没有发生自身免疫病，因为存在有 外周免疫耐受。调节性T细胞(Treg)具有免疫抑制作用，在外周免疫耐受中起 关键作用，可防止自身免疫性疾病的发生。越来越多的研究支持自身免疫性疾病 如红斑狼疮、类风湿关节炎等都伴有Treg细胞数量的减低，而筛选具有促进T 细胞向Treg细胞转化的药物对治疗自身免疫性疾病将会起重要作用。叉状头/翅 膀状螺方定转录因子(Forkhead/winged helix transcription factor (Foxp3))， 是Treg细胞发育过程中的核心转录因子，调控幼稚性T细胞向Treg细胞转化。 Fo邓3基因敲处的小鼠可发生严重的自身免疫性疾病，说明Fo邓3在维持免疫耐受 和防止自身免疫性疾病的发生中起重要作用。目前为止公认的具有上调Foxp3的 药物寥寥无几，而天然药物至今未有发现。而本发明关键目的之一就是构建体外 细胞模型筛选具有上调Foxp3表达的天然药物。分泌IL-17的CD4+T细胞(Thl7)是新近发现的一新T细胞亚群，其主要通 过分泌白细胞介素一17A (IL-17A)，白细胞介素一17F (IL-17F)，肿瘤坏死因 子一a (TNF-a)和白细胞介素一6 (IL-6)等细胞因子剌激血管内皮细胞分泌 粘附分子，介导炎细胞对组织的浸润和组织的损伤；同时Thl7细胞也可以分泌 细胞毒物质直接损伤组织。越来越多的研究表明Thl7细胞在一些自身免疫疾病如风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病和多发性硬化的发病中起关键作用。因此寻找同时能够抑制Thl7细胞亚群的药物就有可能缓减自身免疫性疾病。研究表 明Thl7和Treg细胞在不同的免疫微环境中可以相互转化。目前为止，具有调控 这两种细胞亚群相互转化的药物只有一个一维甲酸(RA)，而该药治疗剂量和至 毒剂量接近，在过去的临床应用中暴露出严重的副作用，如损伤肝功、致高血 脂、致畸、影响骨骼发育等等。因此筛选安全有效的药物已经迫不及待。而目前 为止，国内外未见有调控Treg和Thl7细胞相互转化的药物筛选方法。 发明内容本发明的目的是提供一种调控调节性T细胞和Thl7细胞相互转化的药物筛 选方法，在初步筛选到促进叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3) mRNA的药物后， 进一步筛选能够调控调节性T细胞和Thl7细胞相互转化的安全有效的药物。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种调控调节性T细胞和Thl7 细胞相互转化的药物筛选方法，其特征在于，具体步骤为第一步将叉状头/翅膀状螺旋转录因子绿色荧光蛋白(Foxp3-GFP)表达质 粒转染入人肾上皮细胞(293T)细胞中，通过荧光显微镜观测转染入质粒是否表 达，加入不同的待筛选药物，20-30小时后通过实时定量聚合酶联反应(实时定 量PCR)检测叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3) mRNA的表达，筛选出具有上调 叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)效果的药物；第二步培养小鼠幼稚性T淋巴细胞，加入第一步筛选得到的药物，60-80 小时后通过实时定量PCR检测叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Fo邓3) mRNA的表 达，筛选上调该基因表达的药物，并进一步通过流式细胞仪检査004+0025卞0邓3+ 在CD4+T细胞中的百分率，验证该药物在蛋白水平上的作用；第三步培养小鼠幼稚性T淋巴细胞，加入转化生长因子-e和白细胞介素一6诱导向Thl7细胞转化，同时加入通过第二步筛选得到的药物，60-80小时后 通过实时定量聚合酶联反应(实时定量PCR)检测Thl7细胞核转录因子孤核受体 Yt (R0RYt) mRNA的表达，筛选出下调该基因表达的药物，并进一步通过流式 细胞仪检査CD4+IL-17+在CD4+T细胞中的百分率，验证该药物在蛋白水平上的作 用。进一步地，第一步中所述的待筛选药物为芍药苷，维甲酸，黄芪甲苷，雷 公藤甲素，蒿甲醚，天花粉蛋白，青藤碱，隐丹参酮和丹皮酚。本发明首先以Foxp3为初始靶标，通过初筛和复筛在淋巴细胞和人肾上皮细 胞两种细胞中找到能上调外源性Foxp3和内源性Foxp3mRNA的药物；然后在上面的 基础上进一步縮小筛选范围，寻找能够抑制T细胞向Thl7细胞转化的药物。综合 两步就可以筛选到可靠的具有调控Treg和Thl7细胞相互转化的药物。基于T细胞亚群的最新研究进展，本发明层层深入，结合分子生物学、免疫 学和细胞工程技术，建立简便、可靠、有效的模型，从大量天然产物种快捷地筛 选能够促进T细胞向Treg细胞转化，抑制向Thl7细胞转化的创新药物，为治疗自 身免疫性疾病寻找新的药物。本发明具有以下优点(1)药物用量少只需幽级的药物；(2)时间短7 天左右可完成一轮完整筛选；(3)体外筛选该方法主要在体外进行药物筛选， 回避了动物和人体实验的伦理学要求；(4)可靠性高通过实时定量PCR和流式 细胞仪从mRNA水平和蛋白水平检测，经历初筛和复筛反复验证，结论可靠；(5) 高通量通过96孔板培养细胞，采用实时定量PCR和流式细胞仪保证了可进行高 通量的筛选；(6)应用前景广筛选到的药物可以广泛应用与自身免疫性疾病或 Treg和Thl7细胞失衡的炎症性疾病。


图l为本发明中9种样品的实时定量聚合酶联反应检测图； 图2为芍药苷、维甲酸和青藤碱的实时定量聚合酶联反应检测图； 图3为芍药苷、维甲酸和青藤碱的流式细胞仪检测图； 图4为芍药苷、维甲酸的实时定量聚合酶联反应检测图； 图5为芍药苷、维甲酸的流式细胞仪检测图。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本发明。实施例一种调控Treg和Thl7细胞相互转化的药物筛选方法，具体步骤为 第一步将Foxp3-GFP表达质粒转染入293T细胞中，通过荧光显微镜观测 转染入质粒是否表达，然后加入中国药品生物制品检定所提供的9种样品(5uM 芍药苷，300nM维甲酸，20uM黄芪甲苷，lnM雷公藤甲素，luM蒿甲醚，5uM 天花粉蛋白，5uM青藤碱，5wM隐丹参酮，5uM丹皮酚)，24小时后通过实时 定量PCR检测Foxp3 mRNA的表达，如图1所示，筛选出具有上调Foxp3 mRNA 的药物(芍药苷、维甲酸、青藤碱)；第二步培养小鼠幼稚性T淋巴细胞，加入第一步筛选得到的药物芍药苷、 维甲酸、青藤碱，72小时后通过实时定量PCR检测Foxp3 mRNA的表达，如图2 所示，筛选出上调该基因表达的药物芍药苷、维甲酸，并进一步通过流式细胞仪 检査CD4+CD25+Foxp3+在CD4+T细胞中的百分率，如图3所示，验证该药物在蛋白 水平上的作用；第二步培养小鼠幼稚性T淋巴细胞，加入细胞因子(5ng/ml TGF-p+20ng/ml IL-6)诱导向Thl7细胞转化，同时加入通过以上两步筛选的药物芍药苷、维甲 酸，72小时后通过实时定量PCR检测Thl7细胞核转录因子R0R y t mRNA的表达， 如图4所示，筛选出下调该基因表达的药物芍药苷，并进一步通过流式细胞仪检 查CD4+IL-17+在CD4+T中的百分率，如图5所示，验证该药物在蛋白水平上的作 用。综合二步筛选，我们找到一个具有调控Treg和Thl7细胞相互转化的天然药 物单体芍药苷。对筛选到的单体，我们进行了体内的验证，通过对自发性狼疮鼠(服L/lpr) 9周的治疗，我们发现该单体能明显缓减狼疮鼠肾脏的病理损伤和减低24小时 尿蛋白。通过对佐剂性关节炎小鼠1周的治疗，该单体能明显抑制关节炎的发生。
权利要求
1. 一种调控调节性T细胞和Th17细胞相互转化的药物筛选方法，其特征在于，具体步骤为第一步将叉状头/翅膀状螺旋转录因子绿色荧光蛋白表达质粒转染入人肾上皮细胞中，通过荧光显微镜观测转染入的质粒是否表达，加入不同的待筛选药物，20-30小时后通过实时定量聚合酶联反应检测叉状头/翅膀状螺旋转录因子mRNA的表达，筛选出具有上调叉状头/翅膀状螺旋转录因子表达的药物；第二步培养小鼠幼稚性T淋巴细胞，加入第一步筛选得到的药物，60-80小时后实时定量聚合酶联反应检测叉状头/翅膀状螺旋转录因子mRNA的表达，筛选出上调该基因表达的药物，并进一步通过流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+在CD4+T细胞中的百分率，验证该药物在蛋白水平上的作用；第三步培养小鼠幼稚性T淋巴细胞，加入转化生长因子-β和白细胞介素—6诱导向Th17细胞转化，同时加入通过第二步筛选得到的药物，60-80小时后通过实时定量聚合酶联反应检测Th17细胞核转录因子孤核受体γtmRNA的表达，筛选出下调该基因表达的药物，并进一步通过流式细胞仪检测CD4+IL-17+在CD4+T细胞中的百分率，验证该药物在蛋白水平上的作用。
2. 如权利要求1所述的一种调控调节性T细胞和Thl7细胞相互转化的药物筛 选方法，其特征在于，第一步中所述的待筛选药物为芍药苷，维甲酸，黄芪 甲苷，雷公藤甲素，蒿甲醚，天花粉蛋白，青藤碱，隐丹参酮和丹皮酚。
全文摘要
本发明提供了一种调控调节性T细胞和Th17细胞相互转化的药物筛选方法，步骤为将Foxp3-GFP表达质粒转染入293T细胞中，加入待筛选药物，检测Foxp3 mRNA的表达，筛选出具有上调Foxp3 mRNA的药物；培养小鼠幼稚性T淋巴细胞，加入药物，检测Foxp3 mRNA的表达，筛选出上调该基因表达的药物，并进一步验证该药能上调CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺在CD4⁺T细胞中的百分率；培养小鼠幼稚性T淋巴细胞，加入细胞因子诱导向Th17细胞转化，加入药物，检测Th17细胞核转录因子RORγt mRNA的表达，筛选出下调该基因表达的药物，并进一步验证该药能下调CD4⁺IL-17⁺在CD4⁺T中的百分率。本发明采用体外筛选方式、药物用量少、时间短、可靠性高、应用前景广。
文档编号G01N15/10GK101392294SQ20081020214
公开日2009年3月25日 申请日期2008年11月3日 优先权日2008年11月3日
发明者明 李, 骥 杨 申请人:复旦大学附属中山医院