调控武夷菌素产生菌生长表型的蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种调控武夷菌素产生菌生长表型的蛋白及其编 码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 生物农药是农作物病虫害绿色防控和农产品安全的主要技术支撑。其中，抗生素 类杀菌剂是生物农药产业化发展最快的产品之一，具有高效、易分解、与环境相溶性好等优 点，被认为是减少或代替化学农药的主要技术，也是植物病虫害生物防治研究的热点。
[0003] 链霉菌是一类来源于±壤的革兰氏阳性细菌，它可W产生丰富的次级代谢产物， 可广泛应用于人、畜及农业抗生素、抗真菌剂等方面，对人类具有重要的应用价值。由于农 用抗生素具有无残留、易降解等优点，在农业生产中发挥越来越重要的作用。目前应用的绝 大多数抗生素都是链霉菌的次生代谢物，如阿维菌素、井冈霉素、春雷霉素等。链霉菌次级 代谢产物的合成是一个庞大而复杂的调控网络，受到生物合成基因簇的调控，且基因簇中 包含很多调控基因。因此，为了明确其代谢产物的合成途径，调控基因功能的研究成为了近 年来研究的热点。阿维菌素生物合成的正调节因子AveR，通过调节结构基因的转录表达来 影响阿维菌素的产生。匹马霉素作为多締大环内醋类抗真菌剂的典型代表，其产生菌那塔 链霉菌的调控基因pimM可W调控匹马霉素的产生，该结果为LuxR家族蛋白的调控基因研 究提供了理论依据。天蓝色链霉菌中调控因子CSRs的功能研究，也在天蓝色链霉菌的调控 网络研究中起到了重要的作用。综上所述，通过对链霉菌中调控因子的研究，可W明确其在 抗生素合成途径中的作用。运为今后基因工程育种，定向筛选培育新菌株，奠定了良好的工 作基础。
[0004]武夷菌素是由不吸水链霉菌武夷变种（Str巧tomyces址ygroscopicusvar.miyiensis)产生的一种高效广谱低毒新型农用抗生素，是由中国农业科学院植物保护研究 所研制一种具有自主知识产权的生物农药，具有高效、广谱、低毒的特点，在生态农业和绿 色食品生产中得到了广泛的应用。2000年荣获得国家五部委颁发的"国家重点新产品"认 证。自2001年W来，连续多年被列入蔬菜病虫害安全防治技术规范（国家标准），指定用于 防治茄果类、瓜类、绿叶类蔬菜白粉病、灰霉病、叶霉病等多种病害。2010年武夷菌素产品获 得国家有机产品认证（C0FCC-R-0903-0070)。目前，武夷菌素已经成为我国无公害蔬菜和有 机蔬菜生产中防治真菌病害的高效生物农药。
[0005]前期主要是通过传统方式（物理或化学诱变等）筛选武夷菌素高产菌株并取得一 定的成果，比如原生质体融合的方法提高效价，采用亚硝基脈诱变和低能碳离子注入的方 法诱变武夷菌素产生菌，采用60CO丫射线诱变武夷菌素产生菌L7,运些方法都是基于传统 育种的方法筛选高产菌株，但是由于传统育种具有非定向回复突变、费时费力的缺点，为了 进一步提高武夷菌素效价，可W通过分子生物学的方法对武夷菌素产生菌进行生物工程改 造，W期获得高产稳定的菌株。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种调控武夷菌素产生菌生长表型的蛋白及其编码基因与 应用。
[0007] 本发明所提供的蛋白，名称为WysR3,来源于不吸水链霉菌武夷变种 (Str巧tomyces址ygroscopicusvar.wu}densis)CK-15,具体可为如下（a)或化）：
[000引 （a)氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质；
[0009] 化）将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0010] 上述化）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述化）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0011] 其中，序列表中序列1由253个氨基酸残基组成。
[0012] 编码所述WysR3蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0013] 所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可W 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述核酸分子是编码所述WysR3蛋白的基因（命名为 wysR3基因）；所述wysR3基因具体可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
[001引1)序列表中序列2的第20-781位所示的DNA分子；
[0016] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述WysR3蛋白的DNA分 子；
[001引 4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%w上同源性且编码所述WysR3蛋白 的DNA分子。
[0019] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0020] 其中，序列2由782个核巧酸组成，第20-781位为0RF，编码序列表中序列1所示 的WysR3蛋白。
[0021] 含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0022] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0023] 在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述wysR3基因转录的启动子具 体为Psm启动子。
[0024] 更为具体的，所述重组表达载体为在pSETC载体的多克隆位点（如BamHI和Spe I)之间插入所述wysR3基因后得到的重组质粒。
[00巧]所述表达盒由能够启动所述wysR3基因表达的启动子，所述wysR3基因，W及转录 终止序列组成。
[0026] 在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述wysR3基因的重组链 霉菌；所述链霉菌具体为不吸水链霉菌武夷变种（Str巧tomyces址ygroscopicusvar. wuyiensis)CK-15。
[0027] 所述WysR3蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在调控 武夷菌素产生菌的菌株生长表型中的应用也属于本发明的保护范围。
[0028] 其中，所述菌株生长表型主要体现为菌株生长速率。
[0029] 所述调控武夷菌素产生菌的菌株生长表型具体体现为：所述WysR3蛋白的含量越 高，则所述武夷菌素产生菌的生长速率越慢；所述WysR3蛋白的含量越低，则所述武夷菌素 产生菌的生长速率越快。
[0030] 本发明的另一个目的是提供一种获得转基因菌株的方法。
[0031] 本发明所提供的获得转基因菌株的方法，为如下（A)或度）：
[0032] (A)获得具有如下性状中至少一种的转基因菌株的方法，包括如下步骤：向受体 菌株中导入氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质的编码基因，得到转基因菌株；所 述转基因菌株与所述受体菌株相比具有如下（al)和/或（a2)所示性状：
[0033] (al)生长速率减慢；
[0034] (a2)在不影响武夷菌素总产量的前提下，延长武夷菌素产生周期；
[0035] 度）获得具有如下性状中至少一种的转基因菌株的方法，包括如下步骤：在受体 菌株中对氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基 因菌株；所述转基因菌株与所述受体菌株相比具有如下化1)和/或化2)所示性状：
[0036] 化1)生长速率加快；
[0037] 化2)在不影响武夷菌素总产量的前提下，缩短武夷菌素产生周期；
[0038] 在所述（A)和所述度）的方法中，所述受体菌株均为武夷菌素产生菌。
[0039] 在所述（A)中，所述WysR3蛋白在所述转基因菌株中的表达量高于所述受体菌株； 在所述度）中，所述WysR3蛋白在所述转基因菌株中的表达量低于所述受体菌株。
[0040] 在所述方法度）中，所述转基因菌株与所述受体菌株相比具有"在不影响武夷菌 素总产量的前提下，缩短武夷菌素产生周期"的性状，具体体现为：与所述受体菌株相比，所 述转基因菌株的武夷菌素总产量基本持平（无统计学差异），但是由于所述转基因菌株的 生长速率与所述受体菌株相比加快了，相比所述受体菌株而言，所述转基因菌株产生相同 总产量的武夷菌素所用时间（即武夷菌素产生周期）缩短了。
[0041] 在所述方法（A)中，所述转基因菌株与所述受体菌株相比具有"在不影响武夷菌 素总产量的前提下，延长武夷菌素产生周期"的性状，具体体现为：与所述受体菌株相比，所 述转基因菌株的武夷菌素总产量基本持平（无统计学差异），但是由于所述转基因菌株的 生长速率与所述受体菌株相比减慢了，相比所述受体菌株而言，所述转基因菌株产生相同 总产量的武夷菌素所用时间（即武夷菌素产生周期）延长了。
[004引在所述方法中，所述编码基因（即wysR3基因）是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
[004引 1)序列表中序列2的第20-781位所示的DNA分子；
[0044] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0045] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述WysR3蛋白的DNA分 子；
[0046] 4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%W上同源性且编码所述WysR3蛋白 的DNA分子。
[0047] 上述严格条件可为用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0048] 在所述方法（A)中，所述wysR3基因具体可通过W上所述重组表达载体导入所述 受体菌株中，得到所述转基因菌株。
[0049] 在所述方法度）中，所述"在受体菌株中对氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋 白质的编码基因进行抑制表达"，可为任何可降低所述受体菌株中所述编码基因的表达的 方法。
[0050] 在本发明中，所述"在受体菌株中对氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质 的编码基因进行抑制表达"，具体是通过将如下式（I)所示的DNA片段转入所述受体菌株中 实现的：
[00川 SEQ上游同源臂-X-沈Q下游同源臂 讯
[00閲所述SEQ上游同源臂是序列表中序列3的第1-590位核巧酸；
[00閲所述SEQ下游同源臂是序列表中序列3的第1353-1777位核巧酸；
[0054] 所述X是抗生素编码基因序列（具体如序列表中序列4的所示的庆大霉素编码基 因序列）。
[0055] 在本发明中，所述式（I)所示的DNA片段的核巧酸序列为序列表中的序列5。
[005引序列5由1882个核巧酸组成。其中，第1-590位为所述沈Q上游同源臂，第597-1451 位为庆大霉素编码基因