基中振荡培养（28°C、220r/ min)20h。将种子液W10% (体积比）接种于100血发酵培养基中，振荡培养（28°C、220r/min) 64h，过滤收集发酵液。发酵液于eOOOr/min离屯、lOmin，取上清液再经过0. 22μm的微 孔过滤器，获得无菌发酵滤液，4°C保存备用。
[0181](二）管碟法检测发酵液抑菌活性
[0182] 将各菌株发酵液过滤后，用管碟法测发酵液抑菌活性。W可被武夷菌素抑制生长 的深红酵母AS2. 282烟lodotorula rubra)作为指示菌，从而检测各菌株发酵液的抑菌活 性。具体操作如下：
[0183] (1)将深红酵母AS2. 282接种于PDA斜面培养基，28°C恒溫培养5天，待斜面上均 匀地长满一层菌后用50mL无菌水洗下菌苔，制成菌悬液备用；
[0184] (2)将所得菌悬液W2% (体积比）接种量接种于冷却至约40°C的PDA培养基中， 混匀后将此含深红酵母AS2. 282的PDA培养基按每皿12. 5血吸入直径为9cm的无菌培养 皿中，待培养基凝固后在培养基表面对称放置4个牛津杯；
[0185] (3)将待测的经过滤的各菌株发酵液300μL加入到牛津杯，28°C培养24h后观察 并用游标卡尺测定抑菌圈直径。
[0186] 实验重复6次，结果取平均值。
[0187] 结果显示，各菌株发酵液抑菌圈与原始菌株CK-15的抑菌圈大小均没有明显差异 (图6中A和B)，利用DPS数理统计分析软件进行完全随机试验设计的标准方差分析，并且 进行Duncan'S多重比较分析各菌株发酵液抑菌圈与原始菌株的抑菌圈直径没有显著性差 异（表1为wysR3过表达菌株与原始菌株的抑菌圈直径比较结果），运和HPLC分析结果是 一致的。说明在wysR3基因对武夷菌素总产量没有影响。
[0188] 表1 wysR3过表达菌株与原始菌株CK-15发酵液对深红酵母的抑菌作用
[0189]
[0190] 注：数据后字母表示0. 01水平差异显著。
[0191]二、实验 2
[0192] (一）wysR3过表达菌株、Δ wysR3缺失突变株W及互补菌株的发酵培养
[0193] W实施例2获得的wysR3过表达菌株、实施例3获得的Δ wysR3缺失突变株、实施 例4获得的互补菌株、转入P沈TC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，W及作为出发菌株的不 吸水链霉菌武夷变种（Str巧tomyces址ygroscopicus var. wu}densis)CK-15为实验材料。
[0194] 取各菌株新鲜成熟的斜面抱子接种于50mL种子培养基中振荡培养（28°C、220r/ min)4她。将种子液W2% (体积比）接种于100血发酵培养基中，振荡培养（28°C、220r/ min) 72h，过滤收集发酵液。发酵液于eOOOr/min离屯、lOmin，取上清液再经过0. 22μm的微 孔过滤器，获得无菌发酵滤液，4°C保存备用。
[0195](二）管碟法检测发酵液抑菌活性
[0196] 将各菌株发酵液过滤后，用管碟法测发酵液抑菌活性。W可被武夷菌素抑制生长 的深红酵母AS2. 282巧hodotorula rubra)作为指示菌，从而检测各菌株发酵液的抑菌活 性。具体操作参见步骤一（实验1)。
[0197] 结果显示：各菌株发酵液抑菌圈与原始菌株CK-15的抑菌圈大小均没有明显差异 (图6中C)，利用DPS数理统计分析软件进行完全随机试验设计的标准方差分析，并且进 行Duncan'S多重比较分析各菌株发酵液抑菌圈与原始菌株的抑菌圈直径没有显著性差异 (表2为wysR3过表达菌株、Δ wysR3缺失突变株、互补菌株W及原始菌株的抑菌圈直径比 较结果），运和HPLC分析结果是一致的。说明在wysR3基因对武夷菌素总产量没有影响。
[0198] 表2 wysR3过表达菌株、AwysR3缺失突变株、互补菌株W及原始菌株CK-15发 酵液对深红酵母的抑菌作用
[0199]
[0200] 注：数据后字母表示0. 01水平差异显著。
[020。实施例8、wysR3过表达菌株及Δ wysR3缺失突变株发酵产物的可溶性糖测定
[0202] -、wysR3过表达菌株及Δ wysR3缺失突变株的发酵培养
[0203] W实施例2获得的wysR3过表达菌株、实施例3获得的Δ wysR3缺失突变株、转 入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，W及作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种 (Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)CK-15 为实验材料。
[0204] 取各菌株新鲜成熟的斜面抱子接种于50mL种子培养基中振荡培养（28°C、220r/ min)20h。将种子液W10% (体积比）接种于100血发酵培养基中，振荡培养（28°C、220r/ min) 64h，过滤收集发酵液。发酵液于eOOOr/min离屯、lOmin，取上清液再经过0. 22μm的微 孔过滤器，获得无菌发酵滤液，4°C保存备用。
[0205] 二、发酵产物的可溶性糖鉴定
[0206] 1、葡萄糖标准曲线的制定
[0207] 取6只25血容量瓶编号，取1.Omg/血葡萄糖标准溶液，加入不同试剂（表扣。摇 匀后沸水浴中加热lOmin显色，冷水冷却后定容至25mL颠倒混匀，用UV-75B型分光光度计 在520nm波长测吸光度，W0号管为对照调零，测定出1~5号管的吸光值。W测定的吸光 值为纵坐标，W葡萄糖含量（mg)为横坐标绘制葡萄糖标准曲线。
[020引表3葡萄糖标准溶液的系列值
[0209]
[0210] 2、发酵液中总糖的测定方法
[0211] 参考文献"韩德权，章佳佳.DNS法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的研究[J].食 品工业科技，2008, 29 (2) : 285-290."，具体步骤如下：
[0212] (1)发酵液中总糖的水解
[0213] 取发酵过滤液0. 置于容量瓶中，加入6mol/L的盐酸溶液21^，在沸水浴 中加热15min水解，冷水冷却后加入6mol/L的氨氧化钢溶液1. 8mL，并定容至50mL，得总糖 水解液。
[0214] 似发酵液中总糖的测定
[0215] 取总糖水解液2mL于25mL容量瓶中，加入DNS试剂1. 5血沸水浴中加热5min，冷 水冷却后定容至25mL摇匀，W空白作对照在520nm波长测吸光值。W葡萄糖吸光值标准曲 线为对照，计算发酵液中总糖含量。
[0引引3、结果
[0217] 根据测定数据得到葡萄糖标准曲线（图7)，回归方程Y=0. 631X-0. 028,方程中 Y为吸光值，X为葡萄糖含量，相关系数R2= 0. 998,说明W葡萄糖为标准品在0. 2~Img/ mL范围内可用于糖含量的测定。
[021引各菌株发酵液的测定结果显示，原始菌株CK-15的发酵液与各菌株发酵液中糖含 量没有明显变化。表4为wysR3过表达菌株和原始菌株CK-15发酵液中糖含量的测定结果。 W上结果说明wysR3基因与发酵液中糖含量没有直接关系，不影响糖含量的变化。
[0219] 表4发酵液中总糖含量
[0220]
【主权项】
1. 蛋白质，是如下（a)或（b): (a) 氣基酸序列为序列表中序列1的蛋白质； (b) 将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列1衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3. 根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所 述蛋白质的基因；所述基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子： 1) 序列表中序列2的第20-781位所示的DNA分子； 2) 序列表中序列2所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子； 4) 与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白 质的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重 组克隆载体。6. 权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5或 6所述的重组载体、表达盒或重组菌在调控武夷菌素产生菌的菌株生长表型中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述菌株生长表型体现为菌株生长速率。8. -种获得转基因菌株的方法，为如下（A)或（B): (A) 获得具有如下性状中至少一种的转基因菌株的方法，包括如下步骤：向受体菌株 中导入氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质的编码基因，得到转基因菌株；所述转 基因菌株与所述受体菌株相比具有如下（al)和/或（a2)所示性状： (al)生长速率减慢； (a2)在不影响武夷菌素总产量的前提下，延长武夷菌素产生周期； (B) 获得具有如下性状中至少一种的转基因菌株的方法，包括如下步骤：在受体菌株 中对氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因菌 株；所述转基因菌株与所述受体菌株相比具有如下（bl)和/或（b2)所示性状： (bl)生长速率加快； (b2)在不影响武夷菌素总产量的前提下，缩短武夷菌素产生周期； 在所述（A)和所述（B)的方法中，所述受体菌株均为武夷菌素产生菌。9. 根据权利要求6或7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述武夷 菌素产生菌为不吸水链霉菌武夷变种（Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)。10. 利用权利要求8或9所述方法获得的转基因菌株。
【专利摘要】本发明公开了一种调控武夷菌素产生菌生长表型的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质；(b)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列1衍生的蛋白质。抑制所述蛋白质的表达，可以加快武夷菌素产生菌的生长速率，同时不会影响武夷菌素的总产量，获得相同武夷菌素总产量的时间大大缩短。在保证武夷菌素产量的前提下，不但节约了时间、还节约了培养基以及仪器设备的消耗成本。本发明对于培育武夷菌素高产新菌株具有重要的理论和实际意义。本发明在生物农药领域具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N15/31, C12N15/76, C12R1/465, C07K14/36, C12N1/21
【公开号】CN105367637
【申请号】CN201510994377
【发明人】葛蓓孛, 张克诚, 刘艳, 刘彦彦, 刘炳花
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月25日