专利名称：一种转录调控蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种迟缓爱德 华氏菌溶血素基因调控蛋白及其制备和应用。
技术背景迟缓爱德华氏菌为一种重要的水产养殖动物病原菌，能够感染多种养 殖淡、海水鱼类，如鲤鱼、罗非鱼、牙鲆、鳗鲡、鳍鱼、真鲷等。目前已 发现的迟缓爱德华氏菌致病因子主要有三类和六类分泌系统、溶血素以及粘附素等。其中Eth溶血素系统由EthA和EthB组成；EthA为溶血素因子， 能直接与宿主细胞作用而造成溶血现象；EthB为EthA的运输及激活因子， 因而EthA的分泌及功能活性依赖于EthB。由于Eth溶血素为一重要毒力 因子，与细菌致病力密切相关，因而其表达受到严格调控，破坏这种调控 可导致细菌致病力的降低。 发明内容本发明目的在于提供一种转录调控蛋白及其制备和应用。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 转录调控蛋白具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列。 转录调控蛋白的制备方法方法1)质粒pBTWFl的构建以迟缓爱德 华氏菌TX1为模板，用引物ERFA和ERRA进行PCR扩增，扩增产物与载 体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a后在含有安 卡青霉素、Xgal和异丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养 18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBTWFl;所述引物为ERFA5' -GGATCCGATTAGGATCGACTAGCCA -3,，和ERRA 5， - GATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3，；2 )质粒pBTWF2的构建将上述步骤1 )质粒pBTWFl用BamHI/EcoRV 酶切，回收0. 7kb片段；将质粒pBR322用BamHI/NruI酶切，回收3. 7kb片 段，将两段回收的酶切片段用T4 DNA连接酶于16-？ "C连接8-16小时， 连接液转化入大肠杆菌DH5oc后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 18-24小时，條选转化子，提取质粒，即为质粒pBTWF2，其为具有序列表 SEQ IDNo. 1中的碱基序列的转录调控蛋白。所述PCR条件为94"C 60s预 变性模板DNA，然后94。C40s， 58。C 60s， 72。C 60s， 5个循环后改为94"C 40s, 61"C 60s， 72')C 60s， 25个循环后再在72°C延伸反应10min。转录调控蛋白的应用通过反义RNA干扰具有所述序列表SEQ ID No. 1 中碱基序列的转录调控蛋白使其具有降低细菌毒力的作用。所述通过反义RNA干扰具有所述序列表SEQ ID No. 1中碱基序列的转录调控蛋白的方法为l)质粒pBTRl构建以质粒pTrcHis为模板，釆用 引物TRF和TRR1进行PCR扩增，扩增产物与质粒pBS - T连接，连接混合 液转化大肠杆菌后在含有安卡青霉素、Xgal和异丙基-p-D-硫代半乳糖苷 的LB固体培养基上培养18-24小时，篩选出转化子提取质粒，即为pBSERl; 将质粒pBSERl与质粒pBR322用EcoRI/BamHI双酶切，分别回收130bp和 4kb片段；将上述回收片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接混合液转化 大肠杆菌后在含安卡青霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提 取质粒，即为pBTRl;所述引物TRF1为5， _ GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG -3， ； TRR1为5' - GGATCCATGATATCATTATACGAGCCGGATG -3，；2)质粒pBTR2构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，釆用引物ERR3和 ERF1进行PCR扩增，扩增产物与质粒pBS - T连接，连接混合液转化大肠杆 菌后在含有安卡青霉素、Xgal和异丙基-P -D-硫代半乳糖苷的LB固体培养 基上培养18-24小时，筛选出转化子提取质粒，即为质粒pBSER2;将质粒 pBSER2与步骤1 )所的质粒pBTRl用EcoRV/BamHI酶切，分别回收0. 7kb和 3. 9kb片段；将上述回收片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接混合液转 化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB培 养基中培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pBTR2;其中引物ERR3为 5 ， _ GCAGATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC _3 ， ； ERF1 为 5 ' _ GGATCCAGTACTGATTAGGATCGACTAGCC -3';3 )质粒pJAl的构建以质粒pBR322为模板，釆用引物APF1和APR4 进行PCR,扩增产物用EcoRI酶切，回收lkb片段，将其与质粒pDN18的7. 8kb EcoRI酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠 杆菌DH5cx后在含有Ap的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子提耳又质粒，即为pJAl;其中弓l物APF1为5， 一 TATGAATTCTTGAAGACGAAAGGG-3' 禾口 APR4为5' - TAAGAATTCAAATGAGTAAACTTGGTCTG -3';4)质粒pERI26的构建将步骤3)质粒pJAl用EcoRV酶切，回收8.8kb 片段；同时将步骤2)质粒pBTR2用Seal酶切，回收1.3kb片段，将两段 回收片段用T4DNA连接酶于室温连接2 - 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 oc后在含有Ap的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子提取质粒， 即为具有序列表SEQ ID No. 1中相反碱基序列的质粒pERI26。所述步骤l)中PCR条件为94DC60s预变性模板DNA，然后94°C 40s， 48('C 60s, 72°C 60s， 5个循环后改为94°C 40s， 57°C 60s, 72°C 60s, 25 个循环后再在72。C延伸反应10min。所述步骤2 )中PCR条件为94"C 60s 预变性模板DNA，然后94。C 40s, 51。C 60s, 72。C 60s, 5个循环后改为94"C 40s, 64。C 60s, 72。C 60s， 25个循环后再在72。C延伸反应1 Omin。所述步 骤3)中PCR条件为94"C 40s， 50°C 60s， 72"C 60s, 5个循环后改为94"C 40s, 55°C 60s, 72"C 60s， 25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。 本发明具有如下优点1. 本发明提供的新的、强力型溶血素基因转录调控蛋白EthR为一种GntR家族的调控蛋白，这是首次发现该类蛋白参与溶血素基因的调控。2. 反义RNA干扰原核生物基因表达的方法新颖有效。本发明利用反义 RNA成功干扰原核生物基因表达，其只干扰目的操纵子中基因的表达，不影 响周边操纵子中基因的表达，因而具特异性。3. 具潜在的病害防治应用性。本发明通过WM表达的RNA干扰而显著 降低细菌毒力，因而在迟缓爱德华氏菌的病害控制中有应用潜能，并且该 方法可扩展应用到其它病原微生物的防控。
具体实施方式
下面实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描 述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1. 质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组 DNA提取皆使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相应试剂盒。2. 质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Mai皿ial. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 );3. 所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"， 北京。4. 所有PCR反应的组分皆购于"天根生化科技(北京)有限公司"；PCR 反应体系中的组分如下在50ul反应体系中包含lul模版，2ul lOuM引 物，5ul lOxTaq Buffer, 4ul 2, 5mM dNTP Mix, lul 2U Taq，和37ul水。其中10xTaq Buffer的组成为200mM Tris-HCl， 200mMKCl， 15mMMgCl2。 其中dNTPMix的组成为2. 5mMdATP， 2. 5mMdGTP， 2. 5mM dTTP， 2. 5mM dCTP.i发t^的迟缓爱德华氏菌溶血素基因转录调控蛋白EthR具有序列表 SEQ ID No. 1中的etM碱基序列。 序列表1(a)序列特征:*长度693 bp *类型碱基序列*链型单链 參拓扑结构线性(b) 分子类型双链DNA(c) 假设否(d) 反义否(e) 最初来源迟缓爱德华氏菌TX1(f) 特异性名称EthR 转录调控蛋白的制备1) 质粒pBTWFl的构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，釆用引物ERFA (5， - GGATCCGATTAGGATCGACTAGCCA -3，,划线碱基为BamHI位点)和ERRA (5， - GATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3，，划线碱基为EcoRV位点)，进行PCR扩 增，PCR条件为:94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s， 58。C 60s, 72。C 60s， 5个循环后改为94°C 40s， 61°C 60s， 72°C 60s, 25个循环后再在72"C 延伸反应10min。将扩增产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与载体 pBS-T于室温连接2小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a后在含有100 ug/nil Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG的LB固体培养基上培养18小 时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBTWFl。所述迟缓爱德华氏 菌TX1为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为 CGMCC No. 2 330的菌株。2) 质粒pBTWF2的构建将上述步骤1 )质粒pBTWFl用BamHI/EcoRV酶 切，回收0.7kb片段；将质粒pBR322 (购于"纽英伦生物技术有限公司"，北 京)用BamHI/NruI酶切，回收3. 7kb片段。将两段回收的酶切片段用T4 DNA 连接酶于16"C连接8小时，连接液转化入大肠杆菌DH5oc后在含有100ug/ml Ap的LB固体培养基上培养18小时，挑取一个转化子菌落，提取质粒，即 为质粒pBTWF2，其为具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的转录调控蛋 白。通过反义RNA干扰具有所述序列表SEQ ID No. 1中碱基序列的转录调控 蛋白使其具有降低细菌毒力的作用。所述转录调控蛋白的表达干扰方法l)质粒pBTRl的构建以质粒pTrcHis(购自于美国Invitrogen公司) 为模板，用下歹'J弓I物PCR: TRF1 (5， - GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG -3'， 戈'J线碱基为EcoRI位点)，TRR1 (5' - GGATCCATGAWCATTATACGAGCCGGATG-3', 划线碱基为BamHI/EcoRV位点)，PCR条件为94°C 60s预变性模板 DNA，然后94"C 40s， 48°C 60s， 72nC 60s, 5个循环后改为94。C 40s， 57°C 60s, 72°C 60s， 25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。 PCR产物用天根DNA 产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于"天根生化科技有限 公司"，北京)于室温连接2小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a后在含有100 ug/ml安卡青霉素(Ap)、 40ug/ml Xgal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-乳糖苷)和24 ug/ml异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基 上培养18-24小时，筛选出白色转化子，即为质粒pBSERl。将质粒pBSERl 与质粒pBR322 (购自"纽英伦生物技术有限公司"，北京)用EcoRI/BamHI 双酶切后分别回收130bp和4kb片段；将两酶切片段用T4DNA连接酶于室 温连接2小时，连接液用转化入大肠杆菌DH5oc后在含有Ap (50ug/mi)的 LB固体培养基上培养18小时,挑取1个转化子，提取质粒，将其命名为 pBTRl。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉， 1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水。2)质粒pBTR2的构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用下列引物PCR 反义etM基因:ERR3 (5, — GCAGATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3，，划线碱 基为EcoRV位点)，ERF1 (5， - GGATCCAGTACTGATTAGGATCGACTAGCC -3，， 划线碱基为BaraHI和Seal位点)，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然 后94°C 40s， 51。C 60s， 72°C 60s, 5个循环后改为94。C 40s， 64。C 60s, 72°C 60s， 25个循环后再在72"C延伸反应lOmin。 PCR产物用天根DNA产物纯化 试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2小时，连接混合液转化 大肠杆菌DH5cc后在含有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG 的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，即为质粒pBSER2。 将质粒pBSER2和步骤1 )的质粒pBTRl用EcoRV/B認HI酶切，分别回收0. 7kb 和3. 9kb片段；将两段片段用T4DM连接酶于室温连接2小时，连接液转 化入大肠杆菌DH5 a后在含有50ug/ml Ap的LB固体培养基上培养18小时， 挑取l个转化子，提取质粒，将其命名为pBTR2。所述迟缓爱德华氏菌TX1 为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No. 2330的菌株。3) 质粒pJAl的构建以质粒pBR322 (购自"纽英伦生物技术有限公司"，北京)为模板，用下列引物PCR: APF1 (5， - TATGAATTCTTGAAGACGAAAGGG -3，，划线碱基为EcoRI位点),APR4 (5， — TAAGAATTCAAATGAGTAAACTTGGTCTG -3'，划线碱基;EcoRI位点)，PCR条件为94。C 60s预变性模板DM，然后94°C40s， 50。C 60s， 72。C 60s, 5个循环后改为94。C 40s， 55。C 60s， 72。C 60s,25个循环后再在72"C延伸反应1Gmin。 PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后用EcoRI酶切，回收lkb片段；将质粒pDN18(参见Marx, C. J. & Lidstrom. M. E. (2001). Development of improved versatile broad-host range vectors for use in methylotrophsand other Gram-negative bacteria. M/crab/b/osfy 147, 2065-2075 )用EcoRI酶切，回收7. 8kb片段；将两段酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a后在含有50ug/ml Ap的LB固体培养基上培养18小时，挑取l个转化子，提取质粒，将其命名为pJAl。4) 质粒pERI26的构建将步骤3 )质粒pJAl用EcoRV酶切，回收8. 8kb 片段；同时将步骤2)质粒pBTR2用Seal酶切，回收l. 3kb片段。将两段8回收片段用T4DNA连接酶于室温连接2小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 oc后在含有50iig/ml Ap的LB固体培养基上培养18小时，挑取1个转化子， 提取质粒，即为pERI26，具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的转录调 控蛋白的反义序列。检测降低细菌毒力1 )菌株TXERI26的构建将上述质粒pERI26转化入大肠杆菌S17入兀 (购于西班牙"Biomedal"公司)后在含有50ug/ml Ap的LB固体培养基 上培养18小时，挑取1个转化子，命名为S17入兀/pERI26。将TX1和 S17X7i/pERI26在LB液体培养基中过夜培养，然后将二者以体积比为1: 3 比例混合，且二者总体积lnil;将混合液以5000g, 4°C下离心10min收集 菌体；将菌体悬浮于lml LB液体培养基中，取0. lml培养液置于固体LB 培养基上于30"C保温6小时，而后将细菌悬浮于lml液体LB，取0. lml在含 有50ug/ml Ap和15 ug/ml四环素(Tc )的LB固体培养基上培养24小时， 挑取l个转化子，命名为TXERI26。菌株TXJA1的构建将表达干扰方法步骤3)所得质粒pJAl转化入大 肠杆菌S17入兀(购于西班牙"Biomedal"公司)后在含有50ug/ml Ap的LB 固体培养基上培养18小时，挑取1个转化子，命名为S17Aji/pJAl。将TX1 和S17X7i/pJAl在LB液体培养基中过夜培养，然后将二者以体积比为l: 3 比例混合，且二者总体积lml;将混合液以5000g， 4°C下离心lOmin收集 菌体；将菌体悬浮于lml LB液体培养基中，取0. lmi培养液置于固体LB 培养基上于30"C保温6小时，而后将细菌悬浮于lml液体LB，取0. lml在含 有50ug/ml Ap和15 ug/ml四环素(Tc )的LB固体培养基上培养24小时， 挑取1个转化子，命名为TXJAl。2 )表达检测将TXERI26和TXJAl于LB培养基中28°C摇动培养至OD, 0.8，用SV Total RNA提取试剂盒(购于美国"Promega"公司)提取总 RNA。用荧光定量PCR试剂盒(购于Takara)和ABI 7300实时荧光定量PCR 仪(A卯lied Biosystems)进行PCR反应，检测有序列表SEQ ID No. 1中的 碱基序列在TXERI26和TXJAl中的表达水平。结果表明有序列表SEQ ID No. 1 中的碱基序列在TXERI26中的表达量比在TXJAl中降低了 3倍，说明具有 所述序列表SEQ ID No. 1中碱基序列的转录调控蛋白的表达被成功干扰。同时检测TXERI26和TXJAl的毒力 将TXERI26和TXJAl于LB培养基中28"C摇动培养至OD副0. 5，离心(5000g, 4°C, lOmin)收集菌体；将菌体悬浮于PBS中至终浓度为2x107 cf u/ml ，分 别命名为TXERI26悬浮液和TXJAl悬浮液。将48条牙鲆(平均16g)随机分 为A和B两组，每组24条。A组每条鱼腹腔注射0. lml上述TXJAl悬浮液， B组每条鱼腹腔注射0. lml上述TXERI26悬浮液，在14天内观察每组鱼的 死亡数。结果表明A组的总死亡率为95.8%, B组的总死亡率为29.2%， 比A组降低了 66.6%,说明具有所述序列表SEQ ID No. 1中碱基序列的转录调控蛋白表达干扰显著(P< 0.001)降低了细菌的毒力。其中PBS组成 成分为0.8g NaCl， 0. 02g KC1， 0. 358g Na2HP04. 12H20， 0. 024g NaH2P04。 实施例3与实施例1转录调控蛋白的制备不同之处在于1) 质粒pBTWFl的构建PCR扩增产物与载体pBS-T于室温连接4小时， 连接混合液转化大肠杆菌DH5cc后在含有Ap、 Xgal和IPTG的LB固体培养 基上培养24小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBTWFl。2) 质粒pBTWF2的构建将两段回收的酶切片段用T4 DNA连接酶于16°C 连接16小时，连接液转化入大肠杆菌DH5oc后在含有Ap的LB固体培养基 上培养24小时。实施例4与实施例1转录调控蛋白的制备不同之处在于1) 质粒pBTWFl的构建PCR扩增产物与载体pBS-T于室温连接3小时， 连接混合液转化大肠杆菌DH5oc后在含有Ap、 Xgal和IPTG的LB固体培养 基上培养20小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBTWFl。2) 质粒pBTWF2的构建将两段回收的酶切片段用T4 DNA连接酶于16°C 连接14小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有Ap的LB固体培养基 上培养20小时。实施例5与实施例2转录调控蛋白表达干扰的不同之处在与1) 质粒pBTRl的构建PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与 PCR克隆载体pBS-T于室温连接3小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 a后 在含有Ap、Xgal和IPTG的LB固体培养基上培养20小时；将用EcoRI/BamHI 双酶切的两酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接3小时，连接液用转化入 大肠杆菌DH5 a后在含有Ap的LB固体培养基上培养20小时。2) 质粒pBTR2的构建PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与 PCR克隆载体pBS-T于室温连接3小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a后 在含有Ap、Xgal和IPTG的LB固体培养基上培养20小时；将用EcoRV/BamHI 酶切的两段片段用T4DNA连接酶于室温连接3小时，连接液转化入大肠杆 菌DH5 oc后在含有Ap的LB固体培养基上培养20小时。3) 质粒pJAl的构建将两段酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接3小 时，连接液转化入大肠杆菌DH5a后在含有50ug/ml Ap的LB固体培养基上 培养2Q小时。4) 质粒pERI26的构建将两段回收片段用T4DNA连接酶于室温连接3 小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a后在含有Ap的LB固体培养基上培养 20小时。实施例6与实施例2转录调控蛋白表达干扰的不同之处在与1) 质粒pBTRl的构建PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与 PCR克隆载体pBS-T于室温连接3小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 a后 在含有Ap、Xgal和IPTG的LB固体培养基上培养20小时；将用EcoRI/BamHI 双酶切的两酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接3小时，连接液用转化入 大肠杆菌DH5 a后在含有Ap的LB固体培养基上培养20小时。2) 质粒pBTR2的构建PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与 PCR克隆载体pBS-T于室温连接3小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a后 在含有Ap、Xgal和IPTG的LB固体培养基上培养20小时；将用EcoRV/BaraHI 酶切的两段片段用T4DNA连接酶于室温连接3小时，连接液转化入大肠杆 菌DH5 a后在含有Ap的LB固体培养基上培养20小时。3) 质粒pJAl的构建将两段酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接3小 时，连接液转化入大肠杆菌DH5a后在含有50ug/ml Ap的LB固体培养基上 培养20小时。4) 质粒pERI26的构建将两段回收片段用T4DNA连接酶于室温连接3 小时，连接液转化入大肠杆菌DH5oc后在含有Ap的LB固体培养基上培养 20小时。序列表SEQUENCE LISTING 〈110〉中闺科学院海洋研究所〈]20> —种转录调控蛋山及ji制备和应用<130〉<160> 1<170〉 Patentln version 3.1〈210〉 1〈211〉 693<212〉 隨<213> 迟缓爰德华氏菌TXl 《220〉<221〉 CthR〈222〉 "). . (693) <22:b<顿)>3tgC"tca3C3ac33g(:cgccC3gCgCf!3CCtctcctatcttCttgCtg3g60ngcggstcxtt3tC3gtCCggC3gC3ttC,tgCCggggg33120('t (:ga;i"ggtgg(;gt"cag(:cg"ic(，gctgtacgtgaggcggt,33333t.g180('l,gg('ctigctwcgcgtCCgCgC3ttggt3CgCgCgtC3tgCCg3gC240agcag('tgg3atUtctcg3tca,gctgctgacctggtggCtg3CCCg3g8ga3ttt.t300gaa"化g卞(，a服g3t('.actt(.'ctgptgctgCgC33tgCg('tggagc.cacagg('ctgcctg360('1 g;-icggrg('('ggd(-'gat333gCCgtt3H:33tfjyc(-'tgatgcatgaa42031.gcg-cgagctC38t3gCC3"ttgatcgcgaacgctgg3tt-CgggtCg3tgtacaattc480t(—'tglC83gg'CC3gCgC t33CCCgttCCtg3cctcgttctcC33CUgt t c540f:iHct(.'gg卞ctaccaaagcta(:ttccgttcggtaaccggU]atgaagtcgtC33gCtgg3g600Cg3tCgU、.g3tgCC3l.CCtCgCCggCg3CgCCC3gggggCctatgtggcc660tgctggg卞8t3g3Cgg3gCCt 3369权利要求
1.一种转录调控蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。
2. —种按权利要求l所述的转录调控蛋白的制备方法方法，其特征在 于l)质粒pBTWFl的构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物ERFA和 ERRA进行PCR扩增，扩增产物与载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接 混合液转化大肠杆菌DH5a后在含有安卡青霉素、Xgal和异丙基-P-D-硫 代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即 为质粒pBTWFl;所述引物为ERFA5， - GGATCCGATTAGGATCGACTAGCCA -3，， 和ERRA 5， - GATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3，；2 )质粒pBTWF2的构建将上述步骤1 )质粒pBTWFl用BamHI/EcoRV 酶切，回收0. 7kb片段；将质粒pBR322用BamHI/NruI酶切，回收3.7kb片 段，将两段回收的酶切片段用T4 DNA连接酶于16- "C连接8-16小时， 连接液转化入大肠杆菌DH5oc后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 18-24小时，筛选转化子，提取质粒，即为质粒pBTWF2，其为具有序列表 SEQ ID No. 1中的碱基序列的转录调控蛋白。
3. 按权利要求2所述的转录调控蛋白的制备方法方法，其特征在于 所述PCR条件为94"C60s预变性模板DNA，然后94。C 40s, 58"C 60s， 72°C 60s, 5个循环后改为94"C 40s, 61UC 60s, 72。C 60s, 25个循环后再在72"C 延伸反应lOmin。
4. 一种按权利要求l所述的转录调控蛋白的应用，其特征在于通过反 义RNA干扰具有所述序列表SEQ ID No. 1中碱基序列的转录调控蛋白使其 具有降低细菌毒力的作用。
5. 按权利要求4所述的转录调控蛋白的应用，其特征在于所述通过反 义RNA干扰具有所述序列表SEQ ID No. 1中碱基序列的转录调控蛋白的方 法为l)质粒pBTRl构建以质粒pTrcHis为模板，采用引物TRF和TRRl 进行PCR扩增，扩增产物与质粒pBS-T连接，连接混合液转化大肠杆菌后 在含有安卡青霉素、Xgal和异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上 培养18-24小时，筛选出转化子提取质粒，即为pBSERl;将质粒pBSERl与 质粒pBR322用EcoRI/BamHI双酶切，分别回收130bp和4kb片段；将上述 回收片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含 安卡青霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pBTRl; 所述引物TRF1为5， - GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG-3' ; TRR1 为5， - GGATCCATGATATCATTATACGAGCCGGATG -3，；2)质粒pBTR2构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，釆用引物ERR3和 ERF1进行PCR扩增，扩增产物与质粒pBS-T连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含有安卡青霉素、Xgal和异丙基-P -D-硫代半乳糖苷的LB固体培养 基上培养18-24小时，筛选出转化子提取质粒，即为质粒pBSER2;将质粒 pBSER2与步骤1 )所的质粒pBTRl用EcoRV/BamHI酶切,分别回收0. 7kb和 3. 9kb片段；将上述回收片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接混合液转 化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷的LB培 养基中培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pBTR2;其中引物ERR3为 5 ， - GCAGATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC - 3 ， ； ERF1 为 5 ， _ GGATCCAGTACTGATTAGGATCGACTAGCC -3，；3)质粒pJAl的构建以质粒pBR322为模板，釆用引物APF1和APR4 进行PCR，扩增产物用EcoRI酶切，回收lkb片段，将其与质粒pDN18的7. 8kb EcoRI酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2 - 4小时，连接液转化入大肠 杆菌DH5a后在含有Ap的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子提取质粒，即为pJAl;其中引物APF1为5， 一 TATGAATTCTTGAAGACGAAAGGG _3， 和APR4为5， _ TAAGAA丁TCAAATGAGTAAACTTGGTCTG -3，；4)质粒pERI26的构建将步骤3)质粒pJAl用EcoRV酶切，回收8. 8kb 片段；同时将步骤2)质粒pBTR2用Seal酶切，回收l. 3kb片段，将两段 回收片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌M5 a后在含有Ap的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子提取质粒， 即为具有序列表SEQ ID No. 1中相反碱基序列的质粒pERI26。
6. 按权利要求5所述的转录调控蛋白的制备方法，其特征在于所述步 骤l)中PCR条件为94"C 60s预变性模板DNA,然后94"C 40s, 48°C 60s, 72('C 60s, 5个循环后改为94DC 40s, 57"C 60s, 72"C 60s, 25个循环后再 在72nC延伸反应lOmin。
7. 按权利要求5所述的转录调控蛋白的制备方法，其特征在于所述 歩骤2)中PCR条件为94°C60s预变性模板DNA，然后94°C 40s， 51。C 60s, 72"C 60s, 5个循环后改为94°C 40s, 64°C 60s, 72flC 60s， 25个循环后再 在72°C延伸反应lOmin。
8. 按权利要求5所述的转录调控蛋白的制备方法，其特征在于所述 步骤3)中PCR条件为94°C 40s, 50°C 60s， 72"C 60s, 5个循环后改为 94"C 40s, 55。C 60s, 72°C 60s, 25个循环后再在72"C延伸反应lOmin。
全文摘要
本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体地说是一种迟缓爱德华氏菌溶血素基因调控蛋白及其制备和应用。具体为具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。其以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物ERFA和ERRA进行PCR扩增，扩增产物与载体pBS-T于室温连接转化所得质粒pBTWF1酶切，回收0.7kb片段；将质粒pBR 322酶切，回收3.7kb片段，将两段回收的酶切片段用T4 DNA连接酶于后转化得具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的转录调控蛋白的表达质粒。通过反义RNA干扰具有所述序列表SEQ IDNo.1中碱基序列的转录调控蛋白使其具有降低细菌毒力的作用。本发明提供的新的、强力型溶血素基因调控因子转录调控蛋白EthR为一种GntR家族的调控蛋白，这是首次发现该类蛋白参与溶血素基因的调控。
文档编号C12N1/21GK101323639SQ20081013816
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月4日 优先权日2008年7月4日
发明者黎 孙, 敏 张, 芳 王 申请人:中国科学院海洋研究所