一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及调控不定根发育的生长素基因及其应用，尤其涉及一种调控杨树不定 根发育的生长素响应因子基因 PtARF3. 1及其应用，属于生物基因工程技术领域，杨树不定 根生长素响应因子基因。
【背景技术】
[0002] 随着近年来遗传学、基因组学和分子生物学技术的发展，杨树成为了一种研宄木 材形成、多年生植物季节变化规律、生长发育、开花、性别决定以及生物互作的模式植物。杨 树本身是一种在全球广泛分布的经济树种，具有早期速生、适应性强、分布广、品种多、易杂 交、易改良遗传性、易繁殖等特点，因而广泛用于集约栽培。杨树栽培多通过无性繁殖，硬枝 扦插最为普遍，但是目前许多优良杨树无性系尤其是白杨派树种扦插生根非常困难。因此 加强木本植物扦插生根机理研宄，利用分子生物学和基因工程技术，提高杨树扦插生根能 力具有重要理论意义和应用价值。
[0003] 不定根是植物非根组织上发育的根，一般在下胚轴、茎和叶上发生，其生长发育受 外在环境和内源激素的协同作用。生长素对植物不定根发育过程起到至关重要的作用，通 过生物合成、代谢、极性运输、信号转导等多个途径调控不定根起始、发生、生长等生物学过 程。在生理水平上，可以调节或影响植物不同的生理反应，如根的发生、向性运动和顶端优 势等；在细胞水平上，它可以促进细胞的延伸、分裂和分化等。因此，分离生长素调控不定 根发育相关的关键基因，鉴定其生物学功能，通过遗传改良促进难生根植物生根，是林木分 子育种重要研宄内容，不仅对林木根系发育生物学研宄有重要理论意义，而且在林木良种 无性系繁殖生产中具有潜在的应用价值。生长素与受体蛋白结合后，通过泛素化途径降解 Aux/IAA转录抑制因子，激活生长素响应因子（Auxin response factor, ARF)蛋白，进而调 控生长素响应基因的表达。因此ARF转录因子在是生长素信号转导系统的关键基因，能够 特异地与生长素响应基因启动子区域的生长素响应元件（AuxREs)TGTCTC结合，激活或抑 制基因的表达，调控生长素诱导的生物学过程。近年来，人们在多种草本植物中研宄发现不 同ARF基因通过调控不同的基因表达影响根系的生长发育，说明ARF基因对植物根系发育 具有重要的作用。
[0004] 目前，在木本植物中生长素响应因子调控不定根发育的机制鲜有报道，另外，木本 植物因为在进化过程中存在与草本植物不同的基因组复制事件，部分基因家族发生了扩张 或丢失，部分基因功能发生了分化。如ARF基因家族，在拟南芥中有23个成员，在杨树中 有39个成员，其基因家族进行了扩张，部分同源基因的表达模式发生分化，因此，利用木本 植物为研宄对象，结合分子生物学和基因工程技术，解析ARFs调控杨树不定根发育分子机 制，对于了解木本植物根系发育的分子基础，以及通过分子育种改良难生根林木，加快林木 繁育具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的不足，本发明的主要目的是提供一种调控杨树不定根系的 生长素响应因子基因 PtARF3. 1，以及杨树生长素响应因子基因 PtARF3. 1的载体，本发明的 另一目的是提供一种调控杨树不定根系的生长素响应因子基因 PtARF3. 1的应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0007] -种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因 PtARF3. 1，其核苷酸序列如序列 表中的序列1所示。
[0008] 一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因 PtARF3. 1的表达蛋白，其氨基 酸序列如序列表中序列2所示。
[0009] 一种含有调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因 PtARF3. 1的载体 PMDC32-PtARF3. 1，其核苷酸序列如序列表中的序列3,所述载体在PtARF3. 1基因的5'端组 装组成型强表达启动子P35S ;在PtARF3. 1基因的3'端组装有强终止子NOS。
[0010] 一种由上述载体组装的HPT基因可作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转 基因杨树的筛选。所述的载体上组装有LB序列和RB序列，LB序列和RB序列能促使组装 于其间的PtARF3. 1基因整合至杨树受体细胞染色体中。
[0011] 所述的杨树生长素响应因子基因 PtARF3. 1在调控杨树生长发育过程中的应用。
[0012] 本发明的优点：本发明以84k银腺杨为材料，克隆了 PtARF3. 1基因。同时，构建 过量表达载体PMDC32-PtARF3. 1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下， PtARF3. 1可在杨树体内高效表达，从而调控杨树不定根的发育。其中，PtARF3. 1基因是调 控杨树不定根发育的关键基因。
[0013] 与现有技术相比，本发明通过将PtARF3. 1基因转入杨树，过量表达PtARF3. 1的转 基因杨树与野生型比较，明显提早生根，且不定根数量明显增多，说明PtARF3. 1基因是调 控杨树不定根发育的关键调节因子，在林木基因工程领域和无性系林业领域有重要应用价 值。
【附图说明】
[0014] 图1是植物表达载体PMDC32-PtARF3. 1的结构示意图。
[0015] 图2-1和图2-2是过量表达PtARF3. 1的转基因杨树与未转基因杨树根系比较图； 图2-1为未转基因杨树，图2-2为转基因杨树。
[0016] 图3是过量表达PtARF3. 1的转基因杨树的转录水平定量检测图，图中柱形图显示 PtARF3. 1基因分别在野生型（84k)和转基因杨树（lineB、lineD、IineF)中的表达量。
[0017] 图4-1至图4-4是过量表达PtARF3. 1的转基因杨树与未转基因杨树，不定根发生 第5天根系比较图；图4-1和图4-2为未转基因杨树，图4-3和图4-4为转基因杨树。
[0018] 图5是过量表达PtARF3. 1的转基因杨树与未转基因杨树，不定根发生第5天生根 率比较图；图中柱形图显示不定根诱导第5天野生型（84k)与转基因杨树（lineB、lineD、 IineF)的生根率。
[0019] 图6是采用生长素处理PtARF3. 1的转基因株系叶片的方式检测PtARF3. 1异位表 达促进不定根的形成是依赖生长素途径的。
[0020] 图7是比较野生型和PtARF3. 1的转基因株系，分别在Omg/L IAA，lmg/L IAA，Img/ L ΙΑΑ+10 μ M NPA处理过程中的生根率统计。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明的 操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。
[0022] 实施例1克隆PtARF3. 1基因
[0023] 以 84K(P. alba X P. glandulosa)银腺杨为材料，使用 RNeasy Plant Mini 试剂盒 和 RNase-free DNase I 试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany)提取组培苗84K 的总 RNA。每个样 品取大约 2. Oyg RNA通过使用 Superscript III first-strand synthesis system(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)合成cDNA第一链。参考已发表毛果杨基因组序列，使用 Primerf软件设计引物（扩增子包含起始密码子及终止密码子），进行基因全长扩增（引物 中引入GATEWAY接头）。
[0024] 其中，PtARF3. IORF正向引物为（如序列表中序列4):
[0025] GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAATGATAGATCTTAACACAAC,
[0026] PtARF3. IORF反向引物为（如序列表中序列5):
[0027] GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTACTAAAAGCACACGATGCCAC ；
[0028] 高保真PCR反应体系如下！TaKaRa高保真扩增酶PrimeSTAR 12. 5 μ 1，正向引物 (10μΜ)1 μL，反向引物（10μΜ)1 μL，模板（84Κ杨 cDNA)l μ 1，无菌 CldH2O补足至 25μ1。反 应程序：预变性 98°C，5min ;98°C，30s ;56°C，30s ;72°C，3min，10 个循环；98°C，30s ;60°C，