30s ;72°C，3min，25 个循环；72°C lOmin。
[0029] 最终获得基因全长cDNA序列为2652bp，命名为PtARF3. I基因，序列如序列表中序 列1所示，其所编译表达蛋白序列如序列表中序列2所示。
[0030] 实施例2PtARF3. 1基因植物表达载体构建
[0031] 利用通路克隆技术构建PtARF3. 1基因的过量表达载体，使用特异PCR引物（实施 例1的PtARF3. IORF引物），以84K cDNA为模板，进行PCR扩增，将PtARF3. 1基因 ORF构 建到入门载体。入门载体为H)N0R222.1，序列如序列表中序列6所示。反应体系为Fresh PCR product 80ng ;PDN0R222. Ivector 0· 4 μ I ;BP Clonase II enzyme mix 0· 6 μ 1 ;无菌 ddH20补足至5μ1。反应程序为：25°C反应5h。
[0032] 从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带PtARF3. 1基因的入门 载体通过mlu I限制性内切酶线性化后，与植物表达载体PMDC32,序列如序列表中序列7 所不，进行 LR 反应。反应体系为：Linearized entry clone 50ng ；purified destination vector 75ng;LR Clonase II enzyme mix 0·6μ I ;TE buffer (pH 8.0)补足 5μ I。反应条 件：25°C反应5h。经LR反应后，PtARF3. 1基因导入植物表达载体PMDC32中，在PtARF3. I 基因的5'端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PtARF3. 1基因在杨树体内高效表达；在 PtARF3. 1基因的3'端组装有强终止子N0S，可有效终止PtARF3. 1基因的转录，如图1所示 为得到的植物表达载体PMDC32-PtARF3. 1的结构。
[0033] 在载体质粒上组装潮霉素磷酸转移酶HPT，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮 霉素进行转基因杨树的筛选。在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PtARF3. 1 基因表达框架和筛选标记基因 HPT整合至杨树受体染色体中。通过PCR检测及测序验证， 确认过量表达载体构建成功，命名为PMDC32-PtARF3. 1 (序列3)。该基因位于启动子P35S 之后，在启动子P35S的驱动下，PtARF3. 1基因可在杨树体内高效表达。
[0034] 实施例3PtARF3. 1基因的遗传转化
[0035] 通过电击法将所构建的PMDC32-PtARF3. 1过量表达载体转入农杆菌GV3101中， 通过农杆菌介导将PtARF3. 1基因转入杨树，转化步骤如下：用于遗传转化的杂交杨克隆 84K组培苗在培养温度为23-25°C、光照为16/8h (白天/黑夜）、光照强度为50 μ M m-2s-l 的条件下培养。含有PMDC32-PtARF3. 1表达载体的农杆菌在0D600 = 0. 6~0. 8时侵染 84K叶盘。感染后的叶盘在不定芽诱导培养基（SM，Murashige-Skoog(MS)基本培养基添 加 0· 5mg/l 6-benzyl aminopurine(6-BA)和 0·05mg/l naphthaleneacetic acid (NAA)) 上，在温度为22±2°C的黑暗条件下共培养3天。共培养后的叶盘转移至含有3mg/L hygromycin B 和 200mg/L Timentin 的 SIM 上，在培养温度为 23_25°C、光照为 16/8h (白天 /黑夜）、光照强度为50 μΜ m-2s-l的条件下诱导和筛选抗性不定芽。经过约30天的诱导 培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/L hygromycin B和200mg/LTimentin的生根培养基中 (RM，1/2MS基本培养基添加0. 05mg/L IBA和0. 02mg/L NAA)，直至诱导出不定根。提取已 生根植株叶片DNA，PCR验证。
[0036] 实施例4PtARF3. 1基因通过增强生长素信号促进不定根形成
[0037] 采用生长素处理PtARF3. 1的转基因株系叶片的方式检测PtARF3. 1异位表达促进 不定根的形成。取野生型（84k)和转PtARF3. 1基因的杨树叶片，去除叶柄，留取约1/3大小 的叶片插入培养基中，分别在三种培养基中（〇mg/L IAA，lmg/L IAA，lmg/L IAA+lOuM NPA) 做生根实验。2周后，观察生根情况。
[0038] 实验结果如图2-1至图7所示，图2-1和图2-2为过量表达PtARF3. 1的野生型 与转基因杨树根部比较，其中，图2-1为野生型，图2-2为转基因杨树；图3为过量表达 PtARF3. 1的转基因杨树的定量PCR检测，图中柱形图显示PtARF3. 1基因分别在野生型 (84k)和转基因杨树（lineB、lineD、IineF)中的表达量。
[0039] 图4-1至图4-4为过量表达PtARF3. 1的野生型与转基因杨树生根早晚比较，图 中，图4-1和图4-2为野生型，图4-3和图4-4为转基因杨树，为不定根发生第5天根系比 较；图5是过量表达PtARF3. 1的转基因杨树与未转基因杨树，不定根发生第5天生根率 (roated cuttings，％ )比较图，图中柱形图显示不定根诱导第5天野生型（84k)与转基 因杨树（lineB、lineD、IineF)的生根率；野生型与转基因植株不同克隆至少统计20株苗， 试验重复3次。图6是采用生长素处理PtARF3. 1的转基因株系叶片的方式检测PtARF3. 1 异位表达促进不定根的形成是依赖生长素途径的。图7是比较野生型和PtARF3. 1的转基因 株系，分别在〇mg/L IAA，lmg/L IAA，lmg/L IAA+ΙΟμΜ NPA处理过程中的生根率统计（ARs frequency, % ) 〇
[0040] 从结果可以看出，过量表达PtARF3. 1的转基因杨树与野生型比较生根明显提早， 且不定根数量显著增多，说明杨树生长素响应因子基因 PtARF3. 1是控制杨树不定根发生 发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。
【主权项】
1. 一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3. 1，其特征在于：其核苷酸 序列如序列表中的序列1所示。2. -种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3. 1的表达蛋白，其特征在 于：其氨基酸序列如序列表中序列2所示。3. -种含有调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3. 1的载体 PMDC32-PtARF3. 1，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中的序列3所示。4. 根据权利要求3所述的含有调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3. 1 的载体PMDC32-PtARF3. 1，其特征在于：所述载体在PtARF3. 1基因的5'端组装组成型强表 达启动子P35S ;3'端组装有强终止子NOS。5. -种由权利要求3或4所述的载体组装的HPT基因，其特征在于：所述的载体上组 装有LB序列和RB序列。6. 根据权利要求5所述的载体组装的HPT基因在作为转基因杨树的筛选标记上的应 用。7. 权利要求1所述的调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3. 1在调控杨 树生长发育过程中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种调控杨树不定根发育的生长素响应因子基因PtARF3.1及其应用，属于生物基因工程技术领域。PtARF3.1的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；PtARF3.1的表达蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；PtARF3.1的载体PMDC32-PtARF3.1的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。本发明通过将PtARF3.1基因转入杨树，过量表达PtARF3.1的转基因杨树与野生型比较生根明显提早，且不定根数量显著增多，说明杨树生长素响应因子基因PtARF3.1是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。
【IPC分类】C07K14/415, C12Q1/68, A01H5/00, C12N15/84, C12N15/29
【公开号】CN104975029
【申请号】CN201510392059
【发明人】卢孟柱, 刘颖丽, 赵树堂, 周艺华
【申请人】中国林业科学研究院林业研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月6日