人宫颈癌转移相关的新长链非编码rna序列、分离方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一个长链非编码RNA基因序列、该序 列分离方法、该基因 RNA干扰靶序列、RNA干扰用短发夹片段及其用途。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第三常见的恶性肿瘤，在发展中 国家仅次于乳腺癌，是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一。近年来，由于环境污染、社会 工作压力加大以及生活中的不良卫生习惯等因素，宫颈癌发病率有明显上升的趋势，且患 者年轻化趋势越来越明显，其中85%新发病例在发展中国家，因此对宫颈癌研宄具有良好 的社会价值。
[0003] 肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，大多数癌症患者并非死于原发性癌而是 死于转移性癌。目前宫颈癌的早期诊断使得宫颈癌的治疗效果及预后情况有了很大的改 善，但是肿瘤的转移依旧是宫颈癌术后治疗的一个高危因素，据文献报道宫颈癌患者5年 生存率为80% -98%，若并发淋巴结转移5年生存率则骤降至50%以下。目前广泛性子宫 切除及盆腔淋巴结清扫术为治疗早期宫颈癌的标准术式，但部分宫颈癌患者早期并无淋巴 结转移，而且盆腔淋巴结清扫手术可导致多种并发症。因此运用宫颈癌浸润和转移有关的 分子生物学指标，可更全面的预判淋巴结转移的可能性，从而辅助早期诊断与选择手术治 疗方案、提尚患者预后。
[0004] 肿瘤的发生就其本质上来说是由基因决定的，在使用放疗和化疗这种杀伤性治疗 方法的同时，人们从未放弃过对肿瘤基因治疗的探索。RNA干扰（RNA interference，RNAi) 技术是目前基因治疗策略中非常重要的一个手段，短RNA序列与其互补的RNA靶点结合后 会导致该RNA序列的降解，从而抑制其生物学功能。目前在生物体内实现RNA干扰的两 种方式为利用载体表达短的发夹状RNA(short hairpin，shRNA)与注入化学合成小干扰 RNA(small interfering，siRNA)，但两者前提均是找到有效的干扰位点，从而才能实施有 效的基因干预。自2004年美国FDA首次批准用于黄斑病的RNA干扰药物Cand5进入临床 实验以来已有大量的RNA干扰药物被批准用于临床实验，其数量还在持续增加。RNA干扰 技术的高特异性与高效性均使基因治疗手段进入了一个新的时代，其发明者也因此于2006 年获得诺贝尔生理及医学奖。综上所述，筛选肿瘤相关的关键基因，找到其有效的干扰靶点 开发出RNA干扰药物将是基因治疗研宄领域中一个重要的发展方向。
[0005] 长链非编码RNA(Long noncoding RNA，IncRNA)是指长度大于200个碱基且不 编码蛋白的RNA，种类繁多，结构各异，以RNA转录本的形式行使其生物学功能，参与细胞 分化、细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程，几乎影响所有生理和病理过程。最近的研宄表明 IncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，已经发现IncRNA与肺癌、非霍奇金淋巴瘤、皮 肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病直接关联。大量的研宄表明IncRNA在生 物进化上极不保守，组织及发育时期的表达特异性明显高于蛋白编码基因，以肿瘤相关的 IncRNA作为靶点进行基因干预治疗其可能带来的副作用将会小于蛋白编码基因靶点，肿瘤 相关IncRNA的发现可能会对肿瘤的诊断及基因治疗产生重大的影响。
[0006] 长链非编码RNA与RNA干扰技术均是肿瘤基因治疗研宄方面的热点，找到宫颈癌 异常表达的长链非编码RNA有助于更好的进行宫颈癌的早期诊断与辅助治疗，并可通过抑 制其表达进行基因治疗，具有重要的实用价值。
【发明内容】
[0007] 为开发宫颈癌相关的长链非编码RNA及其RNAi在宫颈癌诊疗方面的应用，本发明 的目的是提供一条新的宫颈癌相关的长链非编码RNA及其相关的特异性RNAi序列，该序 列可以用于宫颈癌相关的诊断和治疗。
[0008] 在申请文件中，长链非编码RNA，简写为IncRNA，其序列初步命名为lncRNA-C3,附 图说明、实施例中可能存在LncRNA、lncRNA-C3,二者含义相同，代表同一基因。
[0009] 为实现本发明的上述目的，本发明采用如下的技术方案：
[0010] 一条人宫颈癌转移相关的新长链非编码RNA序列，其所述的核酸序列如如序列表 中 SEQ ID No. 1 所示；
[0011] 上述长链非编码RNA序列，其分离、检测方法至少包括以下步骤：
[0012] 1)制备抽提人宫颈癌细胞RNA ;
[0013] 2)以RNA为材料合成3' RACE用cDNA模板，使用以下引物进行PCR获得3' RACE 产物；
[0014] C3的3' RACE引物3C3核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2 ;
[0015] C3的3' RACE巢式PCR引物：3C3N核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3
[0016] 3)以RNA为材料合成5' RACE用cDNA模板，使用以下引物进行PCR获得5' RACE 产物；
[0017] C3的5' RACE引物5C3核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4 ;
[0018] C3的5' RACE巢式PCR引物5C3N核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5 ;4)通过 5' RACE及3' RACE序列拼接，得到全长序列。
[0019] 本发明的第二个目的在于，为方便研宄和保存新的长链非编码RNA方法，提供了 该长链非编码RNA序列对应的DNA编码序列，该DNA核酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所 不O
[0020] 本发明的第三个目的在于针对该IncRNA序列，发现并确定了可用于RNAi的靶片 段，所述的靶片段核酸序列如序列表中SEQ ID :No. 7、8、9、10所示。
[0021] 本发明的中的长链非编码RNA、RNAi靶序列均具有宫颈癌辅助诊断、宫颈癌基因 治疗的用途。
[0022] 构建IncRNA的质粒表达载体，并转染人宫颈癌细胞SiHa，结果表明lncRNA_C3在 宫颈癌细胞中的过表达能明显增加宫颈癌细胞的恶性程度，提高其转移能力。
[0023] 针对IncRNA基因设计RNAi靶序列，合成SiRNA进行有效干扰位点的筛选，获得有 效位点后设计了用于RNAi的短发夹片段，构建相应的shRNA质粒表达载体，并转染人宫颈 癌细胞SiHa，结果表明在宫颈癌细胞中表达相应的shRNA能降解细胞内源性lncRNA-C3并 抑制宫颈癌细胞的转移，减少其恶性程度。通过上述工作本发明可提供IncRNA相关的高效 干扰位点，可用于shRNA表达载体构建与siRNA的合成，以及相关基因治疗制剂。
[0024] 综上研宄，本发明证明了该IncRNA基因具有评估宫颈癌转移能力的作用，并可以 作为肿瘤转移相关的标志物，用于宫颈癌的辅助诊断；RNAi靶序列及用于RNAi的短发夹片 段具有基因治疗的作用，可以用作宫颈癌的基因治疗。
[0025] 本发明的第四个目的在于设计了可用于RNAi用的短发夹片段，其核酸序列如序 列表中SEQ ID :Νο· 11、12所示。
[0026] 本发明的第五个目的是提供所述宫颈癌转移相关的新IncRNA、shRNA、siRNA重组 质粒、含有重组质粒的重组子。
[0027] 本发明所述的长链非编码RNA基因克隆自宫颈癌细胞，但不仅限于宫颈癌，未来 更多研宄将提供在其他恶性肿瘤中应用。
[0028] 本发明还提供一种在分离样本中检测、扩增IncRNA序列的方法及相关引物，可以 用于相关诊断试剂的研发。
[0029] 本发明的有益效果是：本发明首次发现并克隆了一个新的长链非编码RNA基因 序列，并通过实验证明该基因在宫颈癌中的特异性表达与宫颈癌的恶性程度及转移能力有 关，该基因具有宫颈癌辅助诊断、宫颈癌基因治疗的用途。发明也提供了该基因的RNAi靶 序列、用于RNAi干扰的短发夹片段，二者具有抑制该基因表达的能力，具有宫颈癌的辅助 诊断和基因治疗的用途。
【附图说明】
[0030] 图IA-B为生物信息学初步筛选宫颈癌相关新基因。图IA :cDNA文库差异片段生 物信息学初步筛选比对结果，子集A为所有宫颈癌相关的cDNA文库，子集B为除宫颈癌以 外的所有癌与非癌的cDNA文库；图IB :电子克隆进一步筛选结果的PCR验证，在Genbank 数据库中进行比对，排除已知的重复基因及基因组污染序列，获得9条EST序列进行PCR扩 增，结果显示3、8泳道得到有效扩增，条带单一，本发明以3号泳道EST序列为最初基础。M 为分子标量，大小依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
[0031] 图2A-E为全长lncRNA-C3的扩增与初步的生物信息学分析。图2A:新基因 lncRNA-C3的3' RACE扩增结果；图2B :新基因 lncRNA-C3的5' RACE扩增结果；图2C: lncRNA-C3基因的Northern blot杂交结果；图2D :lncRNA-C3序列在人染色体位置示意 图;图2E :lncRNA-C3编码潜能的生物信息学分析图。M为分子标量，大小依次为：2000、 1000、750、500、250、100bp ;firstPCR 为第一轮 RACE 结果；Nest PCR 为巢式 PCR 结果。 3'RACE和5'RACE扩增结果（图2A、B)拼接后成功获得IncRNA基因的全长序列，全长 923bp，位于人类基因组11号染色体pll. 2区域，由两个外显子构成（图2C)。通过生物信 息学分析发现该基因 ORF区所编码的氨基酸序列在蛋白质数据库中不存在同源序列且无 法形成有效结构域，判定该基因为长链非编码RNA(图2D) ,Northern blot杂交结果确认了 该基因大小符合预期且确实存在（图2E)。
[0032] 图3A-B IncRNA真核表达载体的构建。图3A :pcDNA3. I (+) lncRNA-C3重组载体 双酶切电泳图，M为分子标量，大小依次为：15000、10000、7500、5000、250