0、1000、250bp ; Double Digests泳道，为重组质粒双酶切片段；Control Plasmid泳道，为pcDNA3. 1(+)空 白质粒酶切图，双酶切结果显示，长905bp的lncRNA-C3序列成功插入pcDNA3. 1 (+)质粒 中；图3B :pcDNA3. l(+)lncRNA-C3重组载体DNA测序图，显示插入序列为lncRNA-C3且无突 变。
[0033] 图4A-C表示lncRNA_C3过表达对宫颈癌细胞增殖的影响。其中untransfected 为未转染质粒的宫颈癌SiHa细胞、pcDNA3. 1为转染空质粒的对照宫颈癌SiHa细胞、 lncRNA-C3为过表达IncRNA的宫颈癌SiHa细胞。图4A :lncRNA-C3过表达细胞系的筛选 结果；图4B :CCK-8实验检测lncRNA-C3对宫颈癌细胞增殖的影响；图4C :流式细胞术检测 lncRNA-C3对宫颈癌细胞增殖的影响。筛选到lncRNA-C3过表达的SiHa稳定细胞系后进行 了相关细胞生物学实验，结果显示lncRNA-C3并未增强宫颈癌细胞的增殖能力，但使更多 的宫颈癌细胞异常停滞于合成遗传物质的S期，使得宫颈癌细胞的突变可能性增加，提高 了其恶性程度（*P < 0. 05)。
[0034] 图5A-C表示lncRNA_C3过表达对宫颈癌细胞侵袭转移的影响。其中 untransfected为未转染质粒的宫颈癌SiHa细胞、pcDNA3. 1为转染空质粒的对照宫颈癌 SiHa细胞、lncRNA-C3为过表达IncRNA的宫颈癌SiHa细胞。图5A :lncRNA-C3过表达后 对宫颈癌细胞集落形成的影响；图5B :lncRNA-C3过表达后对宫颈癌细胞迀移能力的影响； 图5C :lncRNA-C3过表达后对宫颈癌细胞侵袭和转移能力的影响。以上细胞生物学实验结 果均显示lncRNA-C3可明显增加宫颈癌的侵袭与转移能力（*p < 0. 05)。
[0035] 图6A-D为lncRNA-C3抑制表达对宫颈癌细胞侵袭转移的影响。其中scrambled 为RNAi阴性对照、RNAil-4为不同的位点的siRNA、untransfected为未转染质粒的宫颈癌 SiHa细胞、pSH-U6-GFP为转染干扰空质粒的对照宫颈癌SiHa细胞、shRNA-2为转染RNAi-2 位点干扰质粒的宫颈癌SiHa细胞。图6A :lncRNA-C3抑制表达细胞系的筛选结果；图6B : lncRNA-C3抑制表达后对宫颈癌细胞形态的影响；图6C :lncRNA-C3抑制表达细胞对宫颈癌 细胞集落形成的影响；图6D :lncRNA-C3抑制表达后对宫颈癌细胞迀移能力的影响；图6E : lncRNA-C3抑制表达后对宫颈癌细胞侵袭和转移能力的影响。以上细胞生物学实验结果均 显示lncRNA-C3干扰表达后可明显抑制宫颈癌的侵袭与转移能力，并且使其细胞形态向上 皮样细胞转换，使宫颈癌细胞恶性程度降低（*P < 〇. 05)。
[0036] 图7A-B为lncRNA_C3表达改变后对宫颈癌细胞在小鼠体内侵袭转移能力的影 响。其中untransfected为未转染质粒的宫颈癌SiHa细胞、pcDNA3. 1为转染过表达空质 粒的对照宫颈癌SiHa细胞、lncRNA-C3为过表达IncRNA的宫颈癌SiHa细胞、pSH-U6-GFP 为转染干扰空质粒的对照宫颈癌SiHa细胞、shRNA-2为转染RNAi-2位点干扰质粒的宫颈 癌SiHa细胞。图7A :lncRNA-C3表达改变后不同组别肺部表明情况；图7B :lncRNA-C3表达 改变后不同组别肺部表明结节数；图7C :lncRNA-C3表达改变后不同组别肺组织HE染色结 果，放大倍数为100倍，箭头所指为癌巢所在。动物实验结果显示lncRNA-C3过表达增加会 明显提高宫颈癌的侵袭与转移能力，肺部表面结节较对照组明显增多；而降低lncRNA-C3 的表达后使得宫颈癌细胞的侵袭与转移能力降低，肺部表面结节较对照组明显减少（*P < 0. 05对比于过表达对照，#p < 0. 05对比于干扰对照）。
【具体实施方式】
[0037] 以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明 的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发 明的保护范围之内。本发明属于分子生物学领域，在实施例中，包括了很多常用试剂、常规 方法，故实施例中出现的试剂不仅限于列出的试剂供应商品牌。
[0038] 在申请文件中，IncRNA序列初步命名为lncRNA_C3,【附图说明】、实施例中可能存在 LncRNA、lncRNA_C3,含义相同，代表同一基因。
[0039] 实施例1 :生物信息学初步筛选宫颈癌相关新基因
[0040] 使用癌症基因组解析计划CGAP平台的cDNA xProfiler与美国国立生物技术信息 中心 NCBI 平台的 BLAST、DDD(Digital Differential Display)工具共同筛选。
[0041] 1)使用 CGAP 平台的 cDNA xProfiler 工具：
[0042] Pool A选择宫颈癌相关的所有cDNA文库；
[0043] Pool B选择除宫颈癌以外所有的癌与非癌cDNA文库。
[0044] 2)选择整理cDNA文库差异比对结果中未知的100条EST序列，在Genbank数据库 中进行比对，排除已知的重复基因及基因组污染序列，获得9条EST序列可用于进行下一步 筛选，排除9条EST序列中PCR扩增存在非特异条带的片段，留下C3片段进行RACE扩增其 全长序列（图1)。
[0045] 实施例2 :PCR扩增全长基因
[0046] 1)制备抽提制备人宫颈癌细胞RNA ;
[0047] 2)以RNA为模板合成3' RACE cDNA模板，使用以下引物进行PCR获得3' RACE产 物；
[0048] C3的3' RACE引物3C3核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2 ;
[0049] C3的3' RACE巢式PCR引物：3C3N核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3
[0050] 3)以RNA为模板合成5' RACE cDNA模板，使用以下引物进行PCR获得5' RACE产 物；
[0051] C3的5' RACE引物5C3核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4 ;
[0052] C3的5' RACE巢式PCR引物5C3N核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5 ;
[0053] 4)通过5' RACE及3' RACE序列拼接，得到全长序列。
[0054] 按照常规RACE方法，准备RACE相关试剂，进行RACE扩增；以RACE产物为模板，进 行巢式PCR扩增，3' RACE和5' RACE扩增结果（图2A、B)拼接后成功获得C3基因的全长 序列；通过Northern blot杂交确定PACE扩增所得片段已为该基因的全部长度，并且真实 存在（图2C);通过生物信息学分析比对后判断该基因为长链非编码RNA，含多聚A尾的全 长为923bp，位于人类基因组11号染色体pll. 2区域，由两个外显子构成（图2D、E);初步 命名为 lncRNA-C3。
[0055] 实施例3 :lncRNA-C3基因全长的获得及真核表达载体的构建
[0056] 设计PCR引物扩增lncRNA-C3的全长，引物上分别加入BamH I与Hind III酶切位 点，所得片段连接至pcDNA3. 1(+)真核表达载体，扩增引物核苷酸序列见核苷酸序列表SEQ ID No. 2、No. 5。扩增所得片段，经过常规的酶切，连接等操作，插入到pcDNA3. 1(+)真核表 达载体。获得的重组质粒，经双酶切（图3A)、DNA测序进行确定（图3B)，结果显示重组质 粒正确，可以用于后续研宄。
[0057] 实施例4 :lncRNA-C3基因过表达后对宫颈癌细胞的影响
[0058] 将成功构建的lncRNA_C3过表达载体转染至生长状态良好的宫颈癌细胞SiHa。 SiHa细胞接种于24孔板中，每孔2 X IO5个细胞，置于37°C，5 % CO 2细胞培养箱中，待培养 细胞生长至90 %融合度即可开始转染。
[0059] 48小时后加入G418抗生素筛选，半个月后挑取单克隆进行扩大培养。细胞数量足 够后抽提RNA逆转录成cDNA，PCR鉴定出lncRNA-C3稳定表达的宫颈癌细胞系用于后续实 验（图4A)。
[0060] a. CCK-8实验检测lncRNA-C3对宫颈癌细胞增殖的影响：
[0061] 取对数生长期的过表达lncRNA_C3的宫颈癌SiHa细胞、转染空质粒的对照宫颈癌 SiHa细胞以及未转染质粒的宫颈癌SiHa细胞各1000个分别加入96孔板中，5%血清的完 全培养基培养。每孔加入10 μ I CCK-8溶液，孵育2小时后测定450nm的各孔吸光度，连续 检测5天，并进行统计。
[0062] 通过CCK-8实验分析发现lncRNA-C3并不影响细胞的增殖速度（图4B)。
[0063] b.流式细胞术检测lncRNA_C3对宫颈癌细胞增殖的影响：
[0064] 取对数生长期的过表达lncRNA_C3的宫颈癌SiHa细胞、转染空质粒的对照宫颈癌 SiHa细胞以及未转染质粒的宫颈癌SiHa细胞各5 X IO6个，充分打散为单个细胞，D-Hank' s 液洗涤细胞3次，分别加入-20°C预冷的75%乙醇固定。检测前用含有0. 01 % RNase和 0. 5%碘化丙锭的溶液4°C处理细胞20分钟，于488nm激发波下检测细胞各周期DNA含量。
[0065] 流式细胞术分析发现lncRNA-C3增加表达后，细胞G2期数量未发生明显变化，增 殖能力未加强，S期数量明显上升，其恶性程度明显增加（图4C)。
[0066] c.克隆形成实验检测lncRNA_C3过表达后对宫颈癌细胞集落形成的影响：
[0067] 取对数生长期的过表达lncRNA_C3的宫颈癌SiHa细胞、