阿司匹林抵抗相关的p2y1基因多态性位点及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学疾病治疗药物选择领域，具体涉及阿司匹林抵抗相关的P2Y1基 因多态性位点及应用。 技术背景
[0002] 随着我国人口老龄化，脑血管病发病率逐年攀升，最新调查结果表明从2010年起 脑血管病已成为超越肿瘤危害中国人健康的第一大杀手，每年我国新发病例200万，缺血 性脑血管病占70~80%，复发患者占27%，70%的患者留有神经功能缺损，脑血管病的高 致死率、致残率和复发率已造成了极大的社会负担和经济负担。抗血小板药物（尤其是阿 司匹林）在脑血管病的防治中起着至关重要的作用，但是目前的调查结果表明很多脑血管 病患者即使服用了抗血小板药物，仍然反复再发卒中，这种现象称为抗血小板药物抵抗。
[0003] 抗血小板药物抵抗与诸多因素相关，如脑血管病相关危险因素（性别、糖尿病、吸 烟、代谢综合征、急性冠脉综合征、既往心血管事件、肝肾功能异常、血液系统疾病等），患者 依从性或药物剂量，药物相互作用及基因多态性等。其中基因多态性是目前研宄热点。既 往研宄发现，在体内影响阿司匹林作用的多个环节的因子存在基因多态性，这种多态性直 接影响其功能，从而使得不同个体服用阿司匹林后对血小板的反应不同。据不完全统计，临 床阿司匹林抵抗的患者高达40%，但是因为影响阿司匹林作用的靶点众多，到目前为止，阿 司匹林抵抗相关的基因多态性还不确定。但是阿司匹林作为缺血性脑血管疾病二级预防的 重要药物，尽快明确阿司匹林抵抗相关基因多态性至关重要。
[0004] P2Y1是血小板表面G蛋白偶联受体，ADP通过P2Y1和P2Y12受体刺激血小板的激 活和聚集。基于申请人最近的研宄，申请人明确了一个与阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多 态性位点：P2Y1 (A745G)，该位点可用于为缺血性卒中患者选择抗血小板药物，降低阿司匹 林抵抗及卒中复发率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点：A745G。该 位点位于人P2Y1基因全长的第745位，其碱基为A或G，携带有P2Y1突变体745G等位基因 的患者与野生型A745患者相比，更易出现阿司匹林抵抗。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了检测阿司匹林抵抗相关P2Y1基因多态性位点 A745G的引物。
[0007] 本发明最后一个目的在于提供了基于P2Y1基因多态性位点A745G的引物在制备 筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒中的应用。该试剂盒可用于筛选阿司匹林抵抗患者，以便更 好的为缺血性卒中患者选择抗血小板药物，降低阿司匹林抵抗及卒中复发率。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
[0009] 与阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点，该位点是在人P2Y1基因的745位 发生了 A - G的突变，经检测携带有P2Y1突变体745G的患者更容易发生阿司匹林抵抗。基 于P2Y1基因的A745G位点设计引物，然后对该位点进行检测。
[0010] 本发明的保护内容还包括检测阿司匹林抵抗相关P2Y1基因多态性位点A745G的 引物，该引物只要是基于P2Y1基因的A745G位点设计的引物，并能成功扩增出包括P2Y1基 因的A745G的DNA片段的，均为本发明的保护内容。
[0011] 优选的，根据上述P2Y1基因多态性位点A745G设计的引物为：
[0012] 正义链：5 '-CACGGGTGGCCATGTCGC-3'
[0013] 反义链：5 '-TACCAGGTAAATCGATTT-3' ；
[0014] 或
[0015] 正义链：5 '-CACATGGGGGAGTTCAGG-3'
[0016] 反义链：5 '-AACAGTCAGTACAATGAT-3' ；
[0017] 或
[0018] 正义链：5 '-ACAAAGACTGTACGTAGT-3' ；
[0019] 反义链：5 '-GTCACCTGATACGTGGCA-3'。
[0020] 基于P2Y1基因多态性位点A745G的引物在制备筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒中 的应用，包括利用P2Y1 (A745G)位点引物对缺血性卒中患者的DNA进行检测，若检测到携带 有P2Y1突变体745G的患者，则该患者有更易产生阿司匹林抵抗的趋势，检测方法包括但不 限于目前已有的针对SNP位点的检测技术。
[0021] 包括利用本发明提供的P2Y1 (A745G)位点引物，与其他阿司匹林抵抗相关的多态 性位点引物结合组成的试剂盒，对患者的DNA进行检测，来筛选更易产生阿司匹林抵抗的患 者。所述的其他与阿司匹林抵抗相关的多态性位点为：人COX-I基因多态性位点（A842G)， 引物为：正义链：5 ' -AAGCCTTATTAGAGGGTA-3 '，反义链：5 ' -TACTTTGACGCCGGTGGG-3 ' ；和 人GP I a基因多态性位点（C807T)，引物：正义链：5'-TTCCTTAACTGTTACTTC-3'，反义链： 5 '-CTGTGCCATCTCCTATTT-3'。
[0022] 所述的其他与阿司匹林抵抗相关的多态性位点或为：人GP I a基因多态性位点 (C807T)，引物：正义链：5 '-TTCCTTAACTGTTACTTC-3'，反义链：5 '-CTGTGCCATCTCCTATTT-3' 和人GP III a基因多态性位点（A1166C)，引物：正义链：5 '-TGTCAGACACTACACTCA-3'，反义 链：5 '-GGATAATCCTAGGAAAAT-3'。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0024] 1)本发明提供的P2Y1基因多态性位点（A745G)与阿司匹林抵抗相关，意在为缺血 性卒中患者更好的选择抗血小板药物，降低卒中复发率。
[0025] 2)本发明提供的针对检测P2Y1基因多态性位点A745G的引物，意在制备筛选阿司 匹林抵抗的患者的试剂盒。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。本发明所述技术方案，如未特别说 明，均为本领域的常规方案。
[0027] 实施例1 :
[0028] 与阿司匹林抵抗相关的P2Y1基因多态性位点（A745G)的发掘：
[0029] 从卒中数据库中调取2010~2014年卒中患者数据，根据缺血性卒中诊断标准，筛 选确诊为缺血性卒中患者，并且进一步选取明确服用阿司匹林作为二级预防（二级预防是 针对已经有脑卒中症状或已发生卒中后的患者而言，这些人需要预防再次发生脑卒中）的 患者为研宄对象作为总样本（共5033人）。
[0030] 1.明确总样本中卒中复发的人数，探讨总样本中P2Y1(A745G)基因的多态性与卒 中复发的关系（表2);
[0031] 2.总样本中，回院复诊患者（包括已复发的和未复发的患者，共3429人），采集患 者外周血，采用VerifyNow仪器检测阿司匹林反应单元（ARU)，确定ARU彡550的人数，探讨 P2Y1 (A745G)基因的多态性与ARU彡550的关系（表1)。
[0032] 本发明实施例中中，以下两种情况任意一种发生均视为发生阿司匹林抵抗：
[0033] 1.若患者服用阿司匹林期间，仍然发生卒中，则定义为阿司匹林抵抗；
[0034] 2.采用VerifyNow仪器检测阿司匹林反应单元（ARU)，如果ARU彡550,则定义为 血小板高反应性，表明这个患者存在阿司匹林抵抗。
[0035] 结果表明，服用阿司匹林进行二级预防的缺血性卒中患者中，与野生型患者相比， P2Y1 (A745G)突变型组患者阿司匹林反应单元ARU值明显高，且ARU彡550患者人数明显高 于野生型组（表1);同时卒中复发率也明显高（表2)。
[0036] 本实施例中针对P2Y1 (A745G)基因的多态性的检测通过以下方法实现：
[0037] 针对P2Y1基因多态性位点（A745G)设计引物如下：
[0038] 正义链：5 '-CACGGGTGGCCATGTCGC-3'
[0039] 反义链：5 '-TACCAGGTAAATCGATTT-3'。
[0040] 以患者总DNA为模板，利用常规PCR进行扩增，扩增片段长度为350bp，测序，检测 扩增片段的第185个碱基。野生型患者的DNA序列为SEQ ID NO. 1所示，突变型患者的DNA 序列为SEQ ID NO. 2所示。采用该对引物扩增出的序列中第185个碱基对应P2Y1基因中 的第745位点。
[0041] 表1 P2Y1 (A745G)野生型患者与突变型患者ARU值
[0042]
[0043] 表2 P2Y1(A745G)野生型患者与突变型患者卒中复发率
[0044]
[0045] 结果表明，基于该位点设计的引物可用于P2Y1(A745G)突变型患者的筛选，以便 更好的为缺血性卒中患者选择抗血小板药物，降低阿司匹林抵抗及卒中复发率。
[0046] 实施例2 :
[0047] 与阿司匹林抵抗相关P2Y1基因多态性位点（A745G)引物在制备筛选阿司匹林抵 抗患者试剂盒中的应用：
[0048] 对所有首次发生缺血性卒中患者，给予阿司匹林进行二级预防，3个月后对患者进 行随访，检测每个患者ARU，及卒中复发情况。同时取患者外周血通过基因测序检测患者是 否存在P2Y1 (A745G)多态性，分析突变型和野生型患者阿司匹林抵抗发生率。
[0049] 从2013年8月开始研宄，病例纳入截止时间为2014年8月，根据缺血性卒中诊断 标准，选取确诊为缺血性卒中患者作为研宄对象，完成以下工作：
[0050] 1.根据缺血性卒中二级预防指南，给予所有患者阿司匹林进行二级预防；
[0051] 2.所有患者在启动二级预防90天时进行随访，检测随访研宄对象的ARU及卒中复 发情况；
[0052] 3.采取患者外周血，利用本发明提供的引物（正义链： 5 ' -AAGCCTTATTAGAGGGTA-3 ' ；反义链：5 ' -TACTTTGACGCCGGTGGG-3 '，进行 PCR 扩增，测序， 扩增出的片段全长350bp，其中第185位碱基对应P2Y1基因的第745位点。因此，通过对扩 增的序列第185位碱基进行判断，检测患者是P2Y1(A745)野生型还是P2Y1(745G)突变型。
[0053] 4.分析突变型和野生型患者ARU值和卒中复发率。
[0054] 结果表明，服用阿司匹林进行二级预防的缺血性卒中患者中，与P2Y1(A745)野生 型患者相比，P2Y1 (745G)突变型组患者ARU值更高，且ARU彡550患者人数明显高于野生 型组（表3)，卒中复发率也明显高（表4)。
[0055] 表3 P2Y1 (A745G)野生型患者与突变型患者ARU值
[0056]
[0057] 表4 P2Y1(A745G)野生型患者与突变型患者卒中复发率
[0058]
[0059] 实施例3 :
[0060] 与阿司匹林抵抗相关其他基因多态性位点的发掘：
[0061] 1)与阿司匹林抵抗相关的COX-I基因多态性位点（A842G)的发掘：
[0062] 以实施例1同样的卒中数据库，血液样本和方法，检测总样本（共5033人，与实施 例1相同）中COX-I (A842G)基因的多态性与卒中复发的关系（表6);及回院复诊患者（包 括已复发的和未复发的患者，共3429人，与实施例1相同）中COX-I (A842G)基因的多态性 与ARU彡550的关系（表5)。
[0063] 结果表明，服用阿司匹林进行二级预防的缺血性卒中患者中，与野生型患者相比， COX-I (A842G)突变型组患者阿司匹林反应单元ARU值明显高，且ARU彡550患者人数明显 高于野生型组（表5);同时卒中复发率也明显高（表6)。
[0064] 本实施例中针对COX-1 (A842G)基因的多态性的检测通过以下方法实现：
[0065] 针对C0X-1基因多态性位点（A842G)设计引物如