一种从葡萄果实中大量提取总dna的方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种从植物中提取物植物DNA的方法，特别涉及一种从葡萄果实中大量提取总DNA的方法。
【背景技术】
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[0002]葡萄作为一种重要果树品种，经常会需要进行相关的研宄。而在研宄葡萄分子生物学的过程中，有着相当多提取DNA的需要。提取DNA是进行基因库构建、基因克隆、遗传转化、分子标记等分子实验的研宄基础。这样一个普通的试验步骤对于后期的进一步试验起着十分重要的作用。提取DNA的产量，质量，和提取时间，对实验的准确性，可靠性有着较大的影响。
[0003]在提取植物总DNA的方法中，目前人们一般采用所有植物通用的提取方法例如CTAB法和SDS法等。这些提取方法步骤基本相似，首先破碎植物细胞壁，接着使核蛋白复合体中的蛋白充分变性，实验核蛋白与核酸的分离，然后将DNA与成语杂质分离，得到纯净的DNA。这些方法没有特定的提取样品，所以导致对葡萄果实的提取效率不高。
[0004]葡萄果实中富含大量的多糖类和酚类化合物，并且在成熟时会有大量的水分。这些物质在提取的过程中常与核酸形成复合物或者被氧化，不利于核酸的提纯。所以在提取果实总DNA时，通用方法没有考虑到上述问题，因此缺少很多必要步骤，导致提取效率下降。
[0005]本发明提供了一种从葡萄果实中提取总DNA的方法，针对葡萄果实中多酚、多糖和成熟时期水分多等问题，来高效快速的提取葡萄果实中的总DNA。
【发明内容】
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[0006]本发明提供了一种从葡萄果实中提取总DNA的方法，所述方法，包括以下步骤:
[0007]步骤I，将葡萄果实磨成颗粒；
[0008]步骤2，颗粒用山梨醇提取，过滤掉多糖成分，余下葡萄渣I ;
[0009]步骤3，葡萄渣I用巯基乙醇提取，过滤掉酚类成分；余下葡萄渣2
[0010]步骤4，葡萄渣2再用氯仿，异戊醇和KAc混合物提取，过滤掉蛋白成分，余下葡萄渣3，即为本发明的葡萄果实中的总DNA。
[0011]优选的，本发明的方法如下:
[0012](I)取新鲜或者冷冻的葡萄果实，加入液氮后使冻结，然后充分研磨得到冷冻颗粒；
[0013](2)将冷冻颗粒加入离心管中，向离心管中加入缓冲液，山梨醇，巯基乙醇；
[0014](3)震汤均勾后尚心；
[0015](4)将上清去掉，沉淀中加入缓冲液，CTAB, NaCl, EDTA和巯基乙醇；
[0016](5)震荡温育；
[0017](6)加入KAc，乙醇，氯仿；
[0018](7)室温震荡，离心；
[0019](8)上清转入一个新的离心管，加入等体积的氯仿；
[0020](9)室温震荡，离心；
[0021](10)上清转入一个新的离心管，加入LiCl和异丙醇，加入巯基乙醇，冷藏放置；
[0022](11)离心；
[0023](12)上清倒掉，沉淀干燥；
[0024](13)加入 DEPC 溶解；
[0025](14)得到 DNA 溶液；
[0026](15)在溶解后的DNA溶液中加入RNA酶，混匀；
[0027](16)放入 37°C孵育；
[0028](17)加入苯酚:氯仿混合溶液，离心；
[0029](18)加入异丙醇和醋酸钠，冷藏放置；
[0030](19)再离心；
[0031](20)去掉上清，沉淀干燥加入TE保存。
[0032]最优选的，本发明的制备方法见实施例。
[0033]本发明的有益效果如下:
[0034]本发明最优选的技术方案，和现有技术相比，可以有效去除葡萄果实中的多酚多糖，增加提取果实中总DNA的效率，其DNA收率为67%，最高可达80%。纯度A260/A280为 1.75-1.85.
[0035]其多糖的含量极低，少于0.05%，其多酚的含量极低，少于0.05%。总杂质的含量少于0.1%。
[0036]本发明的DNA提取方法重复性好、实验结果稳定、琼脂糖电泳条带清晰，为进一步开展后续研宄奠定了工作基础。
【附图说明】
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[0037]图1:用本方法和其他方法提取的DNA，说明:I?3泳道为用传统方法提取的DNA，4?6泳道为本方法提取的DNA，7泳道为DL2000Marker.
[0038]图2:用本方法提取的DNA进行基因Actin的PCR扩增结果电泳图
[0039]图3:用本方法提取的DNA进行基因GAPDH的PCR扩增结果电泳图
【具体实施方式】
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[0040]以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0041]实施例1
[0042](I)取1g新鲜或者冷冻的葡萄果实，液氮充分研磨；
[0043](2)加入预冷的50ml离心管中，向离心管中加入20ml清洗缓冲液(0.1M Tris-硼酸(pH7.4),0.35M 山梨醇，10% PEG6000, 2%巯基乙醇)；
[0044](3)震荡均匀，40C，8000rpm 离心 1min ；
[0045](4)将上清去掉，沉淀中加入约15ml CTAB缓冲液(0.1M Tris-硼酸(pH7.4),2%CTAB, 1.4M NaCl, 20mmol/l EDTA (ρΗ8.0)，2%巯基乙醇)；
[0046](5) 55°C温育30min (CTAB缓冲液可提前预热)，温育期间手摇震荡几次；
[0047](6)加入 1.5ml 的 5M KAc, 1.5ml 的无水乙醇,15ml 氯仿；
[0048](7)放入摇床室温震荡20min, 100rpm离心1min ；
[0049](8)上清转入一个新的离心管，加入等体积的氯仿；
[0050](9)放入摇床室温震荡20min, 100rpm离心1min ；
[0051](10)上清转入一个新的离心管，加入1/3体积1M LiCl和0.8倍体积的预冷的异丙醇，加入I %巯基乙醇，_20°C放置2-4h ；
[0052](11) 100rpm 离心 30min ；
[0053](12)上清倒掉，沉淀在超净工作台中风吹干燥1min ;
[0054](13)加入500 μ I DEPC水溶解，放入50°C水浴中1min助溶；
[0055](14) DNA溶液用移液器吸到2ml离心管；
[0056](15)在溶解后的DNA溶液中加入5 μ I RNA酶，混匀；
[0057](16)放入 37°C，10min ;
[0058](17)加入500 μ I苯酚:氯仿(24:1)，12000rpm离心5分钟进行抽提，重复一次；
[0059](18)加入2/3体积的冰冻异丙醇和1/10体积的3M醋酸钠，_20°C放置4小时；
[0060](19) 12000rpm 离心 5 分钟；
[0061](20)去掉上清，沉淀在超净工作台中风吹干燥1min ；
[0062](21)加入100 μ I TE溶解，放入50°C水浴中1min助溶；
[0063](22)溶解的DNA可用于后续的试验。
【主权项】
1.一种从葡萄果实中提取总DNA的方法，所述方法，包括以下步骤: 步骤I，将葡萄果实磨成颗粒； 步骤2，颗粒用山梨醇提取，过滤掉多糖成分，余下葡萄渣I ; 步骤3，葡萄渣I用巯基乙醇提取，过滤掉酚类成分；余下葡萄渣2步骤4，葡萄渣2再用氯仿，异戊醇和KAc混合物提取，过滤掉蛋白成分，余下葡萄渣3，即为本发明的葡萄果实中的总DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下: (1)取新鲜或者冷冻的葡萄果实，加入液氮后使冻结，然后充分研磨得到冷冻颗粒； (2)将冷冻颗粒加入离心管中，向离心管中加入缓冲液，山梨醇，巯基乙醇； (3)震汤均勾后尚心； (4)将上清去掉，沉淀中加入缓冲液，CTAB,NaCl, EDTA和巯基乙醇； (5)震荡温育； (6)加入KAc，乙醇，氯仿； (7)室温震汤，尚心； (8)上清转入一个新的离心管，加入等体积的氯仿； (9)室温震汤，尚心； (10)上清转入一个新的离心管，加入LiCl和异丙醇，加入巯基乙醇，冷藏放置； (11)离心； (12)上清倒掉，沉淀干燥； (13)加入DEPC溶解； (14)得到DNA溶液； (15)在溶解后的DNA溶液中加入RNA酶，混匀； (16)放入37°C孵育； (17)加入苯酚:氯仿混合溶液，离心； (18)加入异丙醇和醋酸钠，冷藏放置； (19)再离心； (20)去掉上清，沉淀干燥加入TE保存。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下: (1)取1g新鲜或者冷冻的葡萄果实，用液氮冻结后充分研磨； (2)研磨后的果实加入预冷的50ml离心管中，向离心管中加入20ml清洗缓冲液(0.1MTris-硼酸(pH7.4),0.35M 山梨醇，10% PEG6000, 2%巯基乙醇)； (3)震荡均勾,4°C, 8000rpm 离心 1min ； (4)将上清去掉，沉淀中加入15mlCTAB缓冲液(0.1M Tris-硼酸(pH7.4),2%CTAB, 1.4M NaCl, 20mmol/l EDTA (ρΗ8.0)，2%巯基乙醇)； (5)55°C温育30min(CTAB缓冲液可提前预热)，温育期间手摇震荡几次； (6)加入1.5ml的5M KAc, 1.5ml的无水乙醇,15ml氯仿； (7)放入摇床室温震荡20min,100rpm离心1min ； (8)上清转入一个新的离心管，加入等体积的氯仿； (9)放入摇床室温震荡20min,100rpm离心1min ； (10)上清转入一个新的离心管，加入1/3体积1MLiCl和0.8倍体积的预冷的异丙醇，加入I %巯基乙醇，_20°C放置2-4h ；(11)100rpm 离心 30min ； (12)上清倒掉，沉淀在超净工作台中风吹干燥1min; (13)加入500μ I DEPC水溶解，放入50°C水浴中1min助溶； (14)DNA溶液用移液器吸到2ml离心管； (15)在溶解后的DNA溶液中加入5μ I RNA酶，混匀；(16)放入37°C，1min ； (17)加入500μ I苯酚:氯仿(24:1)，12000rpm离心5分钟进行抽提，重复一次； (18)加入2/3体积的冰冻异丙醇和1/10体积的3M醋酸钠，_20°C放置4小时；(19)12000rpm 离心 5 分钟； (20)去掉上清，沉淀在超净工作台中风吹干燥1min; (21)加入100μ I TE溶解，放入50°C水浴中1min助溶； (22)溶解的DNA可用于后续的试验。
【专利摘要】本发明涉及一种从葡萄果实中大量提取总DNA的方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1，将葡萄果实磨成颗粒；步骤2，颗粒用山梨醇提取，过滤掉多糖成分，余下葡萄渣1；步骤3，葡萄渣1用巯基乙醇提取，过滤掉酚类成分；余下葡萄渣2步骤4，葡萄渣2再用氯仿，异戊醇和KAc混合物提取，过滤掉蛋白成分，余下葡萄渣3，即为本发明的葡萄果实中的总DNA。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104975008
【申请号】CN201510480832
【发明人】邓洋, 陈志勇, 贾海锋, 房经贵, 施乃溶, 朱传根, 施泽波, 张 荣
【申请人】江苏绿之邦生态庄园有限公司, 南京农业大学, 扬州海骅苗木有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年8月3日