磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，属于生物技术领域。 技术背景
[0002] 革兰阳性菌、革兰阴性菌是根据对细菌进行革兰氏染色的结果来区分的，如果将 细菌作革兰氏染色，凡染后菌体呈紫色的，称"革兰氏阳性菌"，菌体呈伊红色，称"革兰氏阴 性菌"。无论阳性菌还是阴性菌都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌是临床最 为常见的病原菌，葡萄球菌属于革兰阳性球菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科，除 大肠杆菌以外，临床较常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌、沙门氏菌、克雷白杆菌；绿脓杆 菌属于假单胞菌，为非发酵菌，是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。
[0003] 革兰氏阴性菌是原核生物，构造相对简单，遗传背景清晰，培养操作容易，因此也 常常被作为基因工程的对象加以利用：研宄者常常将外源基因导入质粒，将质粒整合入革 兰氏阴性菌基因，这样，革兰氏阴性菌就能够表达基因重组后的蛋白（例如胰岛素，某些疫 苗等）了。此外，革兰氏阴性菌还常常作为模型生物参与细胞学实验。
[0004] 革兰氏阴性菌分布广泛，是微生物遗传学和分子遗传学重要的研宄对象，对革兰 氏阴性菌遗传学研宄的许多重要发现，加深了我们在分子水平上对生物遗传机制的理解； 同时由于我们对革兰氏阴性菌遗传背景有较深的了解，革兰氏阴性菌在基因工程研宄中占 据着不可替代的重要地位。为了更好地研宄革兰氏阴性菌的遗传信息，需要提取革兰氏阴 性菌的基因组DNA。研制一种适用于革兰氏阴性菌基因组DNA提取的方便、快捷、实用的方 法，解决使用常规方法所获得的DNA样品提取时间长的问题。此外，有效的提取革兰氏阴性 菌基因组DNA，能够为进行基因分析与基因克隆提供重要保证，从而丰富基因组学的研宄内 容。
【发明内容】
： 本发明提供一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，与传统方法相比，利用该方 法能够方便、快捷地提取革兰氏阴性菌基因组。
[0006] 磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，包括革兰氏阴性菌细胞的破碎，DNA的游 离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，具体步骤如下： 革兰氏阴性菌细胞的破碎：取I. 5ml革兰氏阴性菌过夜培养液加到I. 5ml离心管中， 10000-13000rpm/min离心1-5分钟后弃上清。往菌体沉淀中加入0. 5-lml溶菌酶溶液悬浮 沉淀，37°C温育 2-4h。加入 0· 5-lml SDS 溶液，反复颠倒混匀 10-20min，10000-13000rpm/ min离心10-20分钟后取上清至新的I. 5ml离心管。
[0007] DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入200-600 μ 1酚、氯仿和异戊醇抽提，其中酚：氯 仿：异戊醇的体积比为25:24:1，10000-13000rpm/min离心10-20分钟，将上清转移至干净 的I. 5ml离心管中。加入200-600 μ 1氯仿和异戊醇抽提，其中氯仿：异戊醇体积比为24:1， 10000-13000rpm/min离心10-20分钟，将上清转移至干净的I. 5ml离心管中。
[0008] 磁珠法快速纯化基因组DNA :往溶液中加入等体积的Buffer A。震荡10-30S。室 温放置Ι-lOmin，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧 时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入0.5-1. 5ml Buffer B，打匀后室温静 止5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸 去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入30-60 μ I Buffer C，将离心管放在磁力架 上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为革兰氏阴性 菌基因组DNA产物。于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0009] 所述的溶菌酶溶液：0. 1-0. 3mol/L氯化钠（Nacl)，0. 1-0. 2mol/L乙二胺四乙酸 (EDTA), 10-20mg/ml 溶菌酶，PH = 7-9。
[0010] 所述的SDS溶液：0· 1-0. 2mol/L氯化钠（Nacl)，0· Ι-lmol/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris)，5-20%质量体积比的十二烷基硫酸钠（SDS) ,PH= 7-9。
[0011] 所述的Buffer A:异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠 和水按照1:2体积比配置。 所述的 Buffer Β:4· 3-21. 4mmol/L 三轻甲基氨基甲烧（Tris) ,2.1-4. 2mmol/L 乙二胺 四乙酸（EDTA) ,42. 9-85. 7mmol/L 氯化钠（Nacl)，60-80%无水乙醇。
[0012] 所述的 Buffer C:5-10mmol/L 三轻甲基氨基甲烧（Tris)，PH = 7. 0-9. 0。
[0013] 磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum。购买自温州安科纳米科技有限公司，产品编号： AKl-GlOOOo
[0014] 本发明的显著优点： 常规的革兰氏阴性菌基因组通常采用无水乙醇沉淀基因组，需要12h以上的操作时 间，长时间的操作也容易造成革兰氏阴性菌基因组的降解。一种磁珠法提取革兰氏阴性菌 基因组的方法与常规的革兰氏阴性菌基因组提取方法相比仅需3h就能提取到革兰氏阴性 菌基因组。与常规革兰氏阴性菌基因组提取方法相比，本发明不仅节省了大量提取时间，同 时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到革兰氏阴性菌基因组DNA。
【附图说明】
[0015] 图1为利用本方法提取的革兰氏阴性菌基因组DNA的电泳检测图。 具体实施例
[0016] 图1中，泳道1为利用本方法提取大肠杆菌基因组DNA的结果图，泳道2为利用本 方法提取铜绿假单胞菌基因组DNA的结果图，泳道3为利用本方法提取变形杆菌基因组DNA 的结果图，泳道4为TAKARA公司的DL4500Marker。
[0017] 磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，具体步骤如下： (1)革兰氏阴性菌细胞的破碎：分别取I. 5ml大肠杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌过夜 培养液加到I. 5ml离心管中，12000rpm/min离心1分钟后弃上清。往菌体沉淀中加入0. 5ml 溶菌酶溶液悬浮沉淀，37°C温育2h。加入0. 5ml SDS溶液，反复颠倒混匀10min，12000rpm/ min离心10分钟后取上清至新的I. 5ml离心管。
[0018] (2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入500 μ1酚：氯仿：异戊醇（其体积比为 25 :: 24:1)抽提，12000rpm/min离心10分钟，将上清转移至干净的I. 5ml离心管中。加入 5