一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争elisa试剂盒及应用
【专利摘要】本发明公开了一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争ELISA试剂盒及应用。所述的试剂盒包括包被羊抗兔IgG的酶标板、抗氟喹诺酮类药物特异性抗体、氟喹诺酮类药物酶标半抗原、封闭液、洗涤液、底物液、终止液、氟喹诺酮类药物标准溶液。所述的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原。同时，本发明采用同样的方法合成诺氟沙星和辣根过氧化物酶的偶联物(NOR?HRP)，并结合多抗以及羊抗兔IgG，建立以羊抗兔IgG—多抗—NOR?HRP和氟喹诺酮类药物竞争ELISA的模式，实现对氟喹诺酮类药物的多残留检测。
【专利说明】
一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞 争ELISA试剂盒及应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争ELISA 试剂盒及应用，属于酶联免疫分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 氟喹诺酮类药物(FQs)是一类具有6-氟-7-哌嗪-4-诺酮环结构(母核结构）的杀菌 性抗菌药物，包括诺氟沙星(N0R)、环丙沙星、恩诺沙星、培氟沙星等，具有抗菌谱广，杀菌力 强的优点，尤其是对革兰阴性杆菌具有很高的抗菌活性;另外，氟喹诺酮类药物还具有吸收 快、体内分布广泛的优点，可治疗各个系统的感染性疾病。
[0003] 但是，随着氟喹诺酮类药物的滥用，氟喹诺酮类药物的残留已经严重危害到人体 健康。2002年，我国规定了环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星等氟喹诺酮 类药物在动物组织中的最高残留限量(MRL)为10-500yg/kg。
[0004] 目前，检测FQs残留的常用方法有色谱检测法和免疫学检测法。色谱检测方法需要 昂贵的仪器和专门的工作人员，而且样品处理较烦琐，其应用受到一定的局限，尤其在基层 大规模筛选和现场检测中的问题更加突出。免疫学检测方法灵敏、特异、快速、简便，克服了 以上的不足，适合大规模筛选。
[0005] 姜金庆等报道的文献，采用碳二亚胺二步法合成环丙沙星人工抗原，免疫新西兰 大白兔制备多克隆抗体，建立了检测环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星4种氟喹诺 酮类药物多残留的间接竞争ELISA。（姜金庆，杨雪峰，王自良.氟喹诺酮类药物多残留间接 竞争ELI SA检测方法的建立.中国预防兽医学报，2011，33( 11):887-892.)。
[0006] 郑晓冬的发明专利（CN103592167A)公开了一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制 备方法及其用途。其选取氟喹诺酮类药物中的六种药物，利用半抗原的羧基与载体蛋白合 成免疫抗原，其中环丙沙星，氧氟沙星，恩诺沙星的合成采用的是活性酯法，氟甲喹，达氟沙 星，诺氟沙星采用的是氯甲酸异丁酯法。然后混和六种免疫抗原免疫兔子，再经过杂交瘤技 术，得到抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体。单抗对恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟 罗沙星、达氟沙星等氟喹诺酮类药物都有很好的检测效果。
[0007] 但是，从目前的文献报道来看，还没有对十种以上的氟喹诺酮类药物具有很好检 测效果的试剂盒，因此从试剂盒的广谱度上进行完善，使试剂盒能够满足氟喹诺酮类药物 多残留的检测具有重要的意义。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制 备方法、酶标抗原、竞争ELISA试剂盒及应用，该人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法将牛 血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露， 制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原(N0R-BSA)。通过该抗原制备的抗氟喹 诺酮类多抗对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、伊 诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星等10种氟喹诺酮类药物都有很好的检测效果。
[0009] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] -种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，所述的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原是采用 碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星 的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原。
[0011] -种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0012] (1)将6.6mg BSA和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到A液；
[0013] ⑵将3.6mg诺氟沙星溶解于200μ1 DMF，得到B液；
[0014] (3)将Β液加入Α液中，室温避光磁力搅拌过夜，用ρΗ7 · 2PBS透析3天，每天换液3次， 收集透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，-20°C保存备用。
[0015] -种氟喹诺酮类药物酶标半抗原，所述的氟喹诺酮类药物酶标半抗原的制备方 法，包括以下步骤：
[0016] (1)将4mg HRP和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到C液；
[0017] ⑵将3.6mg诺氟沙星溶解于200μ1 DMF，得到D液；
[0018] (3)将D液加入C液中，室温避光磁力搅拌过夜，用ρΗ7 · 2PBS透析3天，每天换液3次， 收集透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，-20°C保存备用。
[0019] -种检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括包被羊抗 兔IgG的酶标板、抗氟喹诺酮类药物特异性抗体、氟喹诺酮类药物酶标半抗原、封闭液、洗涤 液、底物液、终止液、氟喹诺酮类药物标准溶液。
[0020] 所述的抗氟喹诺酮类药物特异性抗体为抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体。
[0021] 所述的抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0022]将氟喹诺酮类药物人工免疫抗原免疫新西兰白兔，每组3只，免疫剂量为每次500μ g/只，背部皮下分点注射:首免，用PBS溶解氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，与等量FCA混合 乳化;加强免疫，用PBS溶解氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，与等量FIA混合乳化;首免后15 天进行，共免8次，每次间隔15天，最后一次免疫后10天兔耳缘静脉采血，分离血清，饱和硫 酸铵盐析法纯化抗氟喹诺酮类的多克隆抗体，_20°C冻存备用。
[0023]所述的试剂盒还包括阴性对照和包被液。
[0024] 所述的洗涤液为TOST洗涤缓冲液，即含质量分数0 · 05%的Tween-20的0 · Olmol/L、 pH7.2磷酸盐缓冲液;封闭液为含质量分数5 %猪血清的PBST;底物液为含TMB的底物溶液； 包被液为〇. 〇5mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液;终止液为2mol/L H2S〇4。
[0025] 所述的氟喹诺酮类药物包括诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、 洛美沙星、沙拉沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星。
[0026] -种检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒在检测氟喹诺酮类药物残留方 面的应用。
[0027]本发明的有益效果
[0028] 1、本发明采用碳二亚胺一步法将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的 氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免 疫抗原(N0R-BSA)。同时，本发明利用该抗原免疫新西兰白兔制备抗氟喹诺酮类药物的多克 隆抗体，实验证明，本发明的抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙 沙星、二氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星等10种氟喹 诺酮类药物都有很好的检测效果。
[0029] 2、本发明采用同制备人工免疫抗原的方法合成诺氟沙星和辣根过氧化物酶的偶 联物(N0R-HRP)，并结合多抗以及羊抗兔IgG，建立以羊抗兔IgG-多抗一 N0R-HRP和氟喹诺 酮类药物竞争ELISA的模式，实现对氟喹诺酮类药物的多残留检测。
[0030] 3、本发明的试剂盒具有成本低、效率高、简单、快速、灵敏，可以同时实现10种氟喹 诺酮类药物的残留检测，并且检测限低，符合国家的检测要求。实验证明，本发明的试剂盒 的检出限为0.2yg/L，多抗对诺氟沙星的半数抑制浓度IC 5Q为2. lyg/L，竞争ELISA的线性检 测范围为0.2~107.2yg/L。
【附图说明】
[0031] 图1为抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体对诺氟沙星的抑制曲线。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0033] 实施例1氟喹诺酮类药物人工免疫抗原的制备
[0034]本发明氟喹诺酮类药物人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的 羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环 结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原(N0R-BSA)，具体的制备方法包括如下步骤：
[0035] (1)将6.6mg牛血清白蛋白（BSA)和3mg 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺 (H)C)溶于2ml超纯水中，得到A液；
[0036] (2)将3.6mg诺氟沙星溶解于200μ1二甲基甲酰胺(DMF)，得到B液；
[0037] (3)将Β液加入Α液中，室温避光磁力搅拌过夜，用ρΗ7 · 2PBS透析3天，每天换液3次， 收集透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，-20°C保存备用。
[0038]实施例2氟喹诺酮类药物酶标半抗原的制备
[0039]本发明的氟喹诺酮类药物酶标半抗原(N0R-HRP)的制备方法，包括以下步骤：
[0040] (1)将4mg辣根过氧化物酶(HRP)和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到C液；
[00411 (2)将3.6mg诺氟沙星溶解于200μ1 DMF，得到D液；
[0042] (3)将D液加入C液中，室温避光磁力搅拌过夜，用ρΗ7 · 2PBS透析3天，每天换液3次， 收集透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，-20°C保存备用。
[0043] 实施例3抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体的制备
[0044] 本发明抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0045]将氟喹诺酮类药物人工免疫抗原免疫新西兰白兔，每组3只，免疫剂量为每次500μ g/只，背部皮下分点注射:首免，用PBS溶解氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，与等量FCA混合 乳化;加强免疫，用PBS溶解氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，与等量FIA混合乳化;首免后15 天进行，共免8次，每次间隔15天，最后一次免疫后10天兔耳缘静脉采血，分离血清，饱和硫 酸铵盐析法纯化抗氟喹诺酮类的多克隆抗体，_20°C冻存备用。
[0046] 实施例4竞争ELISA试剂盒的组装
[0047]组装检测氟喹诺酮类药物的竞争ELISA试剂盒，具体如下：
[0048] (1)包被羊抗兔IgG的酶标板；
[0049] (2)氟喹诺酮类药物酶标半抗原；
[0050] (3)抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体；
[00511 (4)氟喹诺酮类药物标准溶液，浓度分别为64yg/L、32yg/L、16yg/L、8yg/L、4yg/L、 2yg/L、lyg/L;氟喹诺酮类药物标准溶液也当作阳性对照；
[0052] (5)阴性对照:Oyg/L的标准品，也就是稀释标准品的PBS缓冲液；
[0053] (6)洗涤液为PBST洗涤缓冲液，即含质量分数0.05%的1>的11-20的0.01111 〇1/^ ρΗ7·2磷酸盐缓冲液；0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS):NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HP〇4 1.44g (Na2HP〇4· I2H2O 3.56g)，KH2P〇4 0.2g，溶于双蒸水，并定容至lOOOmL;
[0054] (7)底物液为含TMB底物溶液；
[0055] 母液配方如下：
[0056] A液：用0 . lmol/L、pH 5.0醋酸钠/柠檬酸缓冲液加热溶解0.5g过氧化脲，再与 0.08g非那西@了 (预先加热溶于双蒸水)混合，再加入双蒸水定容至1000mL。
[0057] B液:3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB) 1.27g溶于500mL甲醇，再与500mL甘油混合。
[0058] 使用前将A液和B液体积比1:1混合。
[0059] (8)终止液为2mol/L H2S〇4;
[0060] (9)封闭液(SPBST)为含质量分数5 %猪血清的PBST;
[0061] (10)包被液（CBS)为 0.05mol/L、pH9.6 碳酸盐缓冲液：Na2C03 1.59g、NaHC03 2.93g，加双蒸水定容至1000mL。
[0062] 实施例5多抗和酶标半抗原工作浓度的确定
[0063] 采用方阵滴定法确定竞争ELISA试剂盒中抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体和酶标 半抗原工作浓度，包括如下步骤：
[0064] (1)包被:将羊抗兔IgG用包被液稀释后，包被于酶标板；
[0065] (2)封闭：用封闭液封闭；
[0066] (3)加系列浓度（1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800)的抗氟喹诺酮类 药物的多克隆抗体；
[0067] (4)洗涤后，加入系列浓度（1: 250、1: 500、1:1000、1: 2000)的酶标半抗原，使每个 浓度的抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体均与不同浓度的酶标半抗原进行结合反应；
[0068] (5)加底物液显色:加入新鲜配制的TMB底物溶液；
[0069] (6)终止反应:加入终止液终止反应。
[0070] (7)酶标仪读取各孔0D45Q值，选择0D45Q值为1.0左右时抗氟喹诺酮类药物的多克隆 抗体和酶标半抗原的浓度为最佳工作浓度。方阵滴定结果显示，抗氟喹诺酮类药物的多克 隆抗体的工作浓度为1:6400 ;N0R-HRP的工作浓度为1:500。
[0071]实施例6竞争ELISA试剂盒的检测
[0072 ]本发明竞争ELI SA试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0073] (1)包被:将羊抗兔IgG用包被液稀释后，包被于酶标板;羊抗兔IgG的质量浓度为4 yg/mL，100μL7孔，4°C包被过夜;PBST洗板，洗3次，每次浸泡3min;
[0074] (2)封闭：用封闭液进行封闭；300μ!7孔，37 °C温育lh，PBST洗板；
[0075] (3)加一抗：加入抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体；lOOyL/孔，37°C温育30min， PBST洗板；
[0076] (4)加入酶标半抗原和竞争物：加入酶标半抗原(N0R-HRP)，50μ!7孔;再按照设定 在每孔中分别加入浓度为64以8凡、32以8凡、16以8凡、8以8凡、4以8凡、2以8凡、]^8凡的氟喹诺酮 类药物标准溶液、待测样品或阴性对照(〇yg/L的标准品，也就是稀释标准品的PBS缓冲液）， 每孔均为50yL/孔;37°C温育30min，PBST洗板；
[0077] (5)加底物液显色:加入新鲜配制的TMB底物溶液；1 OOyL/孔，显色1 Omin;
[0078] (6)终止反应:加入终止液终止反应，100μL7孔；
[0079] (7)结果判定：测定450nm波长下的0D值，与阴性对照相比，大于阴性对照0D值的 2.1倍，即为阳性。
[0080]以系列氟喹诺酮类药物标准溶液不同浓度对数值（log C)为横坐标，以多抗对不 同浓度氟喹诺酮类药物标准溶液的抑制率B/Bo(B是氟喹诺酮类药物不同浓度标准品的 〇D45Q值，Bo是氟喹诺酮类药物浓度0yg/L的0D 45Q值)为纵坐标绘制标准曲线，根据待测样品 的抑制率计算氟喹诺酮类在待测样品中的含量，以20 %的抑制率确定其检测限。
[0081 ]实施例7竞争ELISA试剂盒的检测方法 [0082] (1)样品溶液的制备：
[0083] lg鸡肉样样品用1ml提取物（甲醇:PBS = 1:1)匀浆，在旋涡震荡器上混匀5s，然后 用高速搅拌器剧烈搅拌l〇min，4°C12000rpm离心10min，取上清用PBS做1:10倍稀释后备用。
[0084] (2)包被:将羊抗兔IgG用包被液稀释后，包被于酶标板;羊抗兔IgG的质量浓度为4 yg/mL，100μL7孔，4°C包被过夜;PBST洗板，洗3次，每次浸泡3min;
[0085] (3)封闭：用封闭液进行封闭；300yL/孔，37°C温育lh，PBST洗板；
[0086] (4)加一抗：加入抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体；lOOyL/孔，37°C温育30min， PBST洗板；
[0087] (5)加入酶标半抗原和竞争物：加入酶标半抗原(N0R-HRP)，50μ!7孔;再按照设定 在每孔中分别加入待测样品或阴性对照，每孔均为50μLν孔;37°C温育30min，PBST洗板； [0088] (6)加底物液显色:加入新鲜配制的TMB底物溶液；100μL7孔，显色1 Omin;
[0089] (7)终止反应:加入终止液终止反应，100μL7孔。
[0090] (8)于酶标仪450nm波长下的测定0D值。计算其抑制百分率。
[0091]同时，以系列浓度的N0R标准溶液替代样品溶液，重复上述步骤，计算抑制百分率。 以抑制百分率B/Bo为纵坐标，诺氟沙星浓度对数值（logC)为横坐标，绘制标准曲线（图1)， 根据标准曲线计算样品中N0R的含量。
[0092] 多抗对N0R的抑制曲线如图1所示，回归方程Y = -0.293X+0.596，相关系数R2 = 0.996。以80%结合率为最低检出量，即抑制率为20% (IC2Q)，则竞争ELISA试剂盒的最低检 出限为〇.2yg/L，多抗对N0R的半数抑制浓度IC5Q为2.1yg/L。竞争ELISA的线性检测范围为 0 · 2~107·2yg/L。
[0093] 实施例8竞争ELISA试剂盒的准确度测定
[0094] 取3个浓度的N0R样品进行添加回收实验，每个浓度做3个平行，分别计算回收率和 变异系数CV%，结果见表1。由表1可见，鸡肉样的添加回收率在89.1 %~94.8%，变异系数 CV 3.31~5.79%，说明检测结果具有较高的准确度。
[0095] 表1竞争ELISA试剂盒测定鸡肉样品中诺氟沙星含量回收率实验结果(n = 3)
[0096]
[0097] 实施例9竞争ELISA试剂盒的交叉反应率测定
[0098] 测定本发明制备的多抗对10种氟喹诺酮类药物的交叉反应率和IC5Q，结果见表2。 由表2可见，本发明制备的多抗对10种氟喹诺酮类药物的交叉反应率在66~100%之间，半 数抑制浓度在2.1~3.2yg/L之间，可以实现对多种氟喹诺酮类药物的检测。
[0099] 表2本发明制备的抗体对氟喹诺酮类药物的交叉反应率
[0100]
[0101] 实施例10竞争ELISA试剂盒的稳定性测定
[0102] 将试剂盒放置在2°c-8°c保存12个月，期间每隔1个月检测一次，测定试剂盒的IC50 值、ODmax、回收率等各项参数均在正常范围内。同时将试剂盒放置在37°C和-20°C放置6天， 每天检测一次，测定试剂盒的IC 5Q值、ODmax、回收率等各项参数均在正常范围之内。
[0103] 从以上结果看出，三种条件保存试验，本试剂盒的各项指标均符合质量要求，因 此，本发明的试剂盒可以在2°C_8°C保存至少12个月。
【主权项】
1. 一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，其特征在于，所述的氟喹诺酮类药物人工免疫 抗原是采用碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联， 使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原。2. -种如权利要求1所述的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤： (1) 将6.6mg BSA和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到A液； (2) 将3.6mg诺氟沙星溶解于200μ1 DMF，得到B液； (3) 将Β液加入Α液中，室温避光磁力搅拌过夜，用pH7.2PBS透析3天，每天换液3次，收集 透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，-20°C保存备用。3. -种氟喹诺酮类药物酶标半抗原，其特征在于，所述的氟喹诺酮类药物酶标半抗原 的制备方法，包括以下步骤： (1) 将4mg HRP和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到C液； (2) 将3.6mg诺氟沙星溶解于200μ1 DMF，得到D液； (3) 将D液加入C液中，室温避光磁力搅拌过夜，用pH7.2PBS透析3天，每天换液3次，收集 透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，-20°C保存备用。4. 一种检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括 包被羊抗兔IgG的酶标板、抗氟喹诺酮类药物特异性抗体、氟喹诺酮类药物酶标半抗原、封 闭液、洗涤液、底物液、终止液、氟喹诺酮类药物标准溶液。5. 根据权利要求4所述的检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，其特征在于， 所述的抗氟喹诺酮类药物特异性抗体为抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体。6. 根据权利要求5所述的检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，其特征在于， 所述的抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤： 将氟喹诺酮类药物人工免疫抗原免疫新西兰白兔，每组3只，免疫剂量为每次500yg/ 只，背部皮下分点注射:首免，用PBS溶解氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，与等量FCA混合乳 化;加强免疫，用PBS溶解氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，与等量FIA混合乳化;首免后15天 进行，共免8次，每次间隔15天，最后一次免疫后10天兔耳缘静脉采血，分离血清，饱和硫酸 铵盐析法纯化抗氟喹诺酮类的多克隆抗体，-20°C冻存备用。7. 根据权利要求4所述的检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，其特征在于， 所述的试剂盒还包括阴性对照和包被液。8. 根据权利要求4所述的检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，其特征在于， 所述的洗涤液为TOST洗涤缓冲液，即含质量分数0.05%的Tween-20的0.01mol/L、pH7.2磷 酸盐缓冲液;封闭液为含质量分数5 %猪血清的PBST;底物液为含TMB的底物溶液;包被液为 0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液;终止液为2mol/L H2S〇4。9. 根据权利要求4-8任一项所述的检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，其特 征在于，所述的氟喹诺酮类药物包括诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、 洛美沙星、沙拉沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星。10. -种如权利要求9所述的检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒在检测氟喹 诺酮类药物残留方面的应用。
【文档编号】C07K14/765GK106008700SQ201610406844
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】赵银丽, 苏兰利, 王金荣, 赵红月, 刘珍, 黄进
【申请人】河南工业大学