一种水体残留四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素同步检测的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水体环境中残留抗生素的富集检测技术领域，具体涉及一种水体残留 四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素同步检测的方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素作为环境中新兴污染物近年来引发大量关注，由于其长期持续性输入到环 境中，学术界将其称作假持久性有机物。在中国，近些年来抗生素滥用情况严重，广泛应用 在畜牧业和制药业中。环境中的抗生素来源广泛，包括制药厂的生产污水未处理排放和过 期药物的处置不当都会造成环境中抗生素的残留。此外，研宄表明，人类及动物饲养过程中 使用的抗生素，其中30% -90%未经生物体的有效利用而通过粪便等排泄物排除体外，污 水处理厂无法有效去除生活污水中的抗生素，进而使得大量的抗生素进入到环境中。抗生 素及其代谢产物通过多种途径进入到环境水体中，造成环境水体的污染。由于抗生素普遍 具有杀菌功能，在环境中残留的抗生素有利于促进自然界中细菌的基因进化产生耐药性细 菌，这将会对人类的健康及生物圈的生态平衡造成严重的威胁。
[0003] 检测环境样品中抗生素残留的手段，目前主要集中于使用固相萃取-高效液相色 谱串联质谱方法。该方法的优点是操作简便、耗时较短、高灵敏度、低检测限。但是，目前已 有的研宄中，多是针对少数几种抗生素且多属于同一类型的抗生素进行检测，虽然达到了 同时检测的目的，但是方法仍具有局限性。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种水体残留四环素类、氟喹诺酮类 和磺胺类抗生素同步检测的方法。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
[0006] -种水体残留四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素同步检测的方法，包括如下 步骤：
[0007] (1)水样前处理：水样经膜过滤后调节pH至3~4,再加入螯合剂Na2-EDTA,得到 待富集水样；
[0008] (2)使用固相萃取小柱富集目标抗生素：依次用甲醇和超纯水活化固相萃取小 柱，然后通入待富集水样，控制水样流速，使水样中的目标抗生素被吸附富集在固相萃取小 柱上，样品全部导入后，用超纯水淋洗固相萃取小柱，并在真空条件下抽干固相萃取小柱， 再使用甲醇洗脱，收集洗脱液并在氮气吹扫下浓缩，得到浓缩样品；
[0009] (3)上机检测：将浓缩样品用甲醇：0. 1%甲酸水=1 :1的溶液定容至lmL，加入内 标物，上机检测样品中四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素的含量。
[0010] 按上述方案，步骤（1)所述膜过滤的过滤膜为0.45 μ m玻璃纤维滤膜。所述调节 pH的溶液为盐酸溶液。
[0011] 按上述方案，步骤（2)所述固相萃取小柱为60mg/3mL规格的Oasis HLB小柱。
[0012] 按上述方案，步骤（2)所述的水样流速为：0. 5~5mL/min。
[0013] 按上述方案，步骤（3)所述内标物为IOOng西玛通。
[0014] 按上述方案，步骤（3)所述上机检测所使用的检测设备为高效液相色谱串联质 谱。
[0015] 按上述方案，所述高效液相色谱的参数设置为：流动相A为乙腈，流动相B 为含有0. 1 %甲酸和5mmol/L乙酸按的超纯水，流速为0. 25mL/min ;洗脱梯度为流 动相A初始浓度为15 %，保持2min，后在3min内增加到90 %，保持2min，然后在 3min降低至15 %并保持5min，洗脱总用时15min ;进样体积为5 μ L ;使用色谱柱为 Extend-C18column (1. 8 μ m, 2. Imm i. d. X 100mm，Agilent, USA)，温度保持 4CTC ;所述质谱 的参数设置为：阳离子模式；干燥气温度为325°C ;干燥气流速为6L/min ;毛细管电压为 3500V ;电喷雾压力为40psi。
[0016] 本发明的有益效果如下：（1)本发明一次上机进样可以同时检测出水体中的多种 抗生素（21种抗生素），检测过程耗时少（耗时15min)，检测的精确度和灵敏度高，检出限 低，可以检测出环境水体中痕量抗生素的残留情况；同时，本发明方法还具有高回收率，相 对标准偏差较小，这说明本申请的前处理方法及检测方法可靠且重复效果好；（2)本发明 检测方法操作简便，有机试剂使用量少，环境毒性低。
【附图说明】
[0017] 图1为不同环境水样（地下水、河水、废水）中抗生素回收率比较。
[0018] 图2为100 μ g · Γ1浓度的21种抗生素混合标准品溶液的总离子流图，横坐标为 保留时间，纵坐标为信号强度。
[0019] 图3为环境水样中的主要残留抗生素（金霉素、多西霉素、司帕沙星、诺佛沙星、磺 胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑）的浓度-峰面积标准曲线，其中横坐标为抗生素浓度与内标浓 度比值，纵坐标为抗生素峰面积与内标峰面积比值。
[0020] 图4为环境水样中的主要残留抗生素（金霉素、多西霉素、司帕沙星、诺佛沙星、磺 胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑）在100 μ g/L浓度下的选择离子谱图。
【具体实施方式】
[0021] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0022] 实施例1水样预处理
[0023] 实验中使用的所有玻璃器皿均经过有机洗液清洗，静置4小时后依次用自来水、 超纯水洗涤八次。实验过程中样品避免光源直射，所用玻璃器皿部分为棕色，部分需要观察 样品现象的步骤则使用无色玻璃器皿但是需用铝箔覆于表面以避光。
[0024] 对于不同类型的水样可以量取不同体积的样品进行浓缩且能够达到可检测浓度， 经过一系列实验得到，地下水1L，河水0. 5L，废水0. 1L。用量筒称量一定体积的水样，将该 水样经过配有0. 45 μ m的玻璃纤维滤膜的玻璃过滤器，收集经过过滤的水样，用盐酸溶液 调节经过滤水样至pH为3~4,再加入IOmL浓度为5 % (v/v)的螯合剂Na2-EDTA,以防止 四环素类抗生素与水体中的金属阳离子络合进而影响对目标抗生素的检测。
[0025] 实施例2固相萃取方法 [0026] (1)活化固相萃取柱
[0027] 使用Waters Oasis HLB 60mg/3mL规格的固相萃取柱进行萃取。固相萃取柱使用 前先向其中加入6mL色谱纯的甲醇溶液，并在重力作用下使甲醇溶液慢慢通过固相物质以 进行活化。为避免固相中残留甲醇溶剂在通入水样时对其中目标化合物的富集产生影响， 再向其中加入6mL超纯水，同样在重力作用下通过固相物质，以完成活化。
[0028] (2)导入预处理样品
[0029] 向经过活化后的固相萃取柱中通入预处理后的水样，经过流速控制对比实验，本 发明选择流速为地下水5mL/min，河水2. 5mL/min，废水0. 5mL/min。具体操作为连接12管 固相萃取装置、废液瓶及真空泵，打开真空泵，调节每个固相萃取柱下端萃取装置上的流速 控制阀控制流速，通过大容量进样器将水样导入到固相萃取柱中，水样通过固相物质过程 中目标化合物被吸附富集到固相物质上，之后水样流向废液瓶。
[0030] (3)淋洗固相萃取柱
[0031] 在水样通过固相萃取柱的过程中，不仅目标化合物被固相物质吸附富集，水样 中一些非检测杂质也会部分残留在固相萃取柱中，如水样预处理步骤中加入的螯合剂 Na2-EDTA等。因此用12mL超纯水在同等条件下通过固相萃取柱以淋洗固相物质去除杂质。 淋洗之后，在抽真空条件下，干燥固相萃取柱IOmin后等待洗脱。
[0032] (4)洗脱固相萃取柱
[0033] 本发明通过实验发现，甲醇对于三大类目标化合物的洗脱效果最佳。因此向抽干 的固相萃取柱中加入6mL甲醇溶液，在重力作用下将固相物质中吸附的抗生素洗脱出来， 收集到玻璃试管中，最后再打开真空泵施加负压使固相萃取柱中的甲醇全部流出并收集。
[0034] (5)洗脱液吹氮定容
[0035] 将收集到玻璃试管中的洗脱液放置在温和的氮气气流下进行吹扫使甲醇挥发，当 洗脱液浓缩至约0. 5mL时停止吹氮，将其转移至2mL棕色进样瓶中，加入IOOng内标化合 物西玛通后继续吹氮浓缩至近干，再用甲醇：〇. 1 %甲酸水=1:1的溶液定容至lmL，放置在 4 °C冰箱中等待上机检测。
[0036] 实施例3 :HPLC_MS/MS检测方法建立
[0037] 对于样品中痕量抗生素，使用高效液相色谱串联质谱进行检测，配备高性能自动 进样器、二元泵、恒温色谱柱室及可变波长检测器，具体检测参数见下表1。
[0038] 表1高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS)检测参数
【主权项】
1. 一种水体残留四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素同步检测的方法，其特征在于， 包括如下步骤： (1) 水样前处理：水样经膜过滤后调节PH至3~4,再加入螯合剂Na2-EDTA,得到待富 集水样； (2) 使用固相萃取小柱富集目标抗生素：依次用甲醇和超纯水活化固相萃取小柱，然 后通入待富集水样，控制水样流速，使水样中的目标抗生素被吸附富集在固相萃取小柱上， 样品全部导入后，用超纯水淋洗固相萃取小柱，并在真空条件下抽干固相萃取小柱，再使用 甲醇洗脱，收集洗脱液并在氮气吹扫下浓缩，得到浓缩样品； (3) 上机检测：将浓缩样品用甲醇：0. 1%甲酸水=1 :1的溶液定容至lmL，加入内标 物，上机检测样品中四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素的含量。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)所述膜过滤的过滤膜为 0. 45ym玻璃纤维滤膜。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2)所述固相萃取小柱为 60mg/3mL规格的OasisHLB小柱。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2)所述的水样流速为：0. 5~ 5mL/min〇
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤⑶所述内标物为IOOng西玛 通。
6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤⑶所述上机检测所使用的检测 设备为高效液相色谱串联质谱。
7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的参数设置为： 流动相A为乙腈，流动相B为含有0. 1 %甲酸和5mmol/L乙酸铵的超纯水；流速为0. 25mL/ min;洗脱梯度为流动相A初始浓度为15 %，保持2min，后在3min内增加到90 %，保持2min， 然后在3111；[11降低至15%并保持51]1；[11，洗脱总用时151]1；[11 ;进样体积为5 1^;使用色谱柱 为Extend-CIScolumn，温度保持40°C;所述质谱的参数设置为：阳离子模式；干燥气温度为 325°C;干燥气流速为6L/min;毛细管电压为3500V;电喷雾压力为40psi。
【专利摘要】本发明属于水体环境中残留抗生素的富集检测技术领域，具体涉及一种水体残留四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素同步检测的方法。所述检测方法包括如下步骤：(1)水样前处理；(2)使用固相萃取小柱富集目标抗生素；(3)使用高效液相色谱串联质谱上机检测。本发明一次上机进样可以同时检测出水体中的多种抗生素，检测过程耗时少，检测的精确度和灵敏度高，检出限低，可以检测出环境水体中痕量抗生素的残留情况，同时，本发明检测方法操作简便，有机试剂使用量少，环境毒性低。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104730168
【申请号】CN201510148387
【发明人】姚林林, 王焰新, 童蕾
【申请人】中国地质大学（武汉）
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月31日