转染空质粒的对照宫颈癌 SiHa细胞以及未转染质粒的宫颈癌SiHa细胞各200个分别加入6孔板中，10%血清的完全 培养基培养连续培养14天，龙胆紫染料染色20分钟观察克隆形成情况。显微镜下观察，大 于50个细胞的细胞集落计为有效克隆，并进行统计。
[0068] 集落形成实验发现有效克隆的个数虽然未减少，但是克隆大小明显增大，恶性程 度增加（图5A)。
[0069] d.伤口愈合实验检测细胞的迀移能力：
[0070] 取对数生长期的过表达lncRNA_C3的宫颈癌SiHa细胞、转染空质粒的对照宫颈癌 SiHa细胞以及未转染的宫颈癌SiHa细胞各IX IO6个分别加入6孔板中，10 %血清的完全 培养基培养24小时后进行划痕。划线后使用D-Hank' s液洗涤2次去除脱落的细胞，加入 1 %血清的完全培养基连续培养48小时，观察细胞迀徙的情况。
[0071] 伤口愈合实验显示lnCRNA-C3表达增加后宫颈癌细胞的侵袭转移能力均明显提 高，恶性程度增加（图5B)。
[0072] e. Transwell 实验：
[0073] 细胞侵袭实验：取对数生长期的过表达lncRNA_C3的宫颈癌SiHa细胞、转染空质 粒的对照宫颈癌SiHa细胞以及未转染质粒的宫颈癌SiHa细胞各2 X IO4个悬浮于无血清 培养基中，加至铺好基质胶（稀释比1 : 8)的Transwell小室中，下室24孔板每孔加入 500 μ 1的10%血清的完全培养基，连续培养48小时后染色观察细胞穿过Transwell小室 的情况，随机多个视野下计数统计。
[0074] 细胞迀徙实验：取对数生长期的过表达lncRNA_C3的宫颈癌SiHa细胞、转染空质 粒的对照宫颈癌SiHa细胞以及未转染质粒的宫颈癌SiHa细胞各2 X IO4个悬浮于无血清 培养基中，加至无基质胶的Transwell小室中，下室24孔板每孔加入500 μ 1的10%血清的 完全培养基，连续培养48小时后染色观察细胞穿过Transwell小室的情况，随机多个视野 下计数统计。
[0075] Transwell实验均明确显示lncRNA-C3表达增加后宫颈癌细胞的侵袭转移能力均 明显提高，恶性程度增加（图5C)。
[0076] 该实施例数据显示，lncRNA_C3表达的增加与肿瘤的恶性程度程正相关，有作为临 床诊断辅助指标的应用前景。
[0077] 实施例5 : lncRNA-C3的RNA干扰靶点及短发夹寡核苷酸序列设计
[0078] 根据新克隆的lncRNA-C3序列，应用RNAi设计软件，寻找该IncRNA的最佳的靶 点，得到4个最佳干扰靶点序列：
[0079]
[0080] 按照以上靶点合成siRNA，瞬时转染SiHa细胞，筛选有效的干扰靶点，最后确认 RNAi-2为有效干扰位点。
[0081] 针对RNAi-2干扰靶点，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列， 其退火后复性可形成两端分别带BamH I和Hind III限制性酶切位点的DNA双链。所合成 的各条寡核苷酸序列如下：
[0082]
[0083] 将上述2条单链互补寡核苷酸序列，溶解至等浓度，互补单链各取10 μ 1混合， 95°C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链DNA片段。将退火所得的双链DNA片段以 合适的方法克隆到PSH-U6-GFP空载体质粒中，将得到的质粒转染生长状态良好的宫颈癌 细胞SiHa，筛选稳定转染的细胞系。
[0084] 成功转染shRNA-2干扰质粒并筛选获得干扰IncRNA表达的细胞系用于后续实验 (图 6A)。
[0085] 实施例6 :抑制lncRNA-C3表达后对宫颈癌细胞的影响
[0086] 以下lncRNA_C3抑制表达后对宫颈癌细胞的影响实验同实施例3中所列实验，前 期实验证明lncRNA-C3不会影响宫颈癌的增殖能力，而是会增强宫颈癌细胞的侵袭与转移 能力。
[0087] 在抑制lncRNA_C3表达后，利用克隆形成实验检测其对宫颈癌细胞集落形成的影 响，通过伤口愈合实验、Transwell实验研宄lncRNA-C3抑制表达后对宫颈癌细胞侵袭与转 移的影响，进而探讨以IncRNA为突破口进彳丁基因治疗的可彳丁性。
[0088] 结果显示lncRNA_C3降低后细胞形态由易转移且恶性程度较高的梭形转变为椭 圆形，表现出正常上皮样特征（图6B);
[0089] 集落形成实验发现有效克隆的个数虽然未减少，但是克隆大小明显减小，恶性程 度降低（图6C);
[0090] 伤口愈合实验以及Transwell实验均明显表明lncRNA-C3表达降低后宫颈癌细胞 的侵袭转移能力均明显降低（图6D、E)。
[0091] 实施例7 :动物实验进一步研宄lncRNA-C3表达改变后对宫颈癌细胞转移能力的 影响
[0092] 将30只5-6周龄的雌性BALB/c Nude小鼠随机平均分为5组，分别为lncRNA-C3 过表达组、过表达对照组、SiHa未转质粒组、shRNA-2干扰组、干扰对照组，通过尾静脉分别 注射100 μ 1含4X IO6个相应组别细胞的生理盐水溶液至小鼠体内。饲养8周后处死观察 肿瘤肺部转移情况，解剖显微镜下统计肺部转移形成的肿瘤结节数，组织切片HE染色观察 组织结构变化及成瘤情况，通过动物实验进一步研宄以IncRNA做为临床诊断辅助标准及 基因治疗靶点的可行性。
[0093] 肺转移模型实验结果显示，lncRNA_C3过表达组肺部表面结节数明显多于对照组， 其干扰组肺部表面结节数则明显少于对照组（图7A、B)。
[0094] HE染色镜下观察显示，肺组织中存在多处癌巢，癌巢组织中细胞排列紧密，核大深 染，核浆比增大，可见核分裂象，平均每个低倍视野下lncRNA-C3过表达组癌巢较对照组增 多，干扰组癌巢则较对照组明显较少（图7C)。
[0095] 动物实验结果表明lncRNA_C3表达量增加后宫颈癌细胞在裸鼠体内的侵袭转移 能力会明显提高，使其恶性程度增加。
[0096] 实施例8 :统计学分析
[0097] 所有数据用均数土标准差（mean土SEM)形式表示，η彡3。其中，两两比较采用 Student' s T检验，多组之间比较采用ANOVA方差分析，当ρ < 0. 05,认为差异有统计学 意义。用图像分析软件ImageJ进行半定量分析，用统计学软件SPSS17. 0进行数据分析， GraphPad Prism 5绘制统计图表。
[0098] 从实施例1到7实验结果显示，未来lncRNA_C3可被用于临床诊断的参考指标；抑 制该IncRNA的表达可有效减弱肿瘤细胞在动物体内的侵袭转移能力，使其恶性程度明显 降低，抑制该IncRNA的表达可做为基因治疗抑制肿瘤转移的一个有效手段。
【主权项】
1. 一种人宫颈癌转移相关的新长链非编码RNA，其特征在于，其核苷酸序列如序列表 中 SEQ ID No. 1 所示。2. -种从样本中扩增、检测权利要求1所述RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 制备人宫颈癌细胞RNA ; 2) 以RNA为模板，以下面引物对进行PCR获得3' RACE产物； C3的3' RACE引物3C3,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2 ; C3的3' RACE巢式PCR引物3C3N，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3 3) 以RNA为模板，以下面引物对，进行PCR获得5' RACE产物； C3的5' RACE引物5C3,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4 ; C3的5' RACE巢式PCR引物5C3N，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5 ; 4) 通过5' RACE及3' RACE序列拼接，得到全长序列。3. -种编码权利要求1所述RNA的DNA序列，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 6 所示。4. 权利要求1所述人宫颈癌转移相关的新长链非编码RNA在制备诊断宫颈癌辅助诊断 试剂中的用途。5. -种可用于权利要求1所述人宫颈癌转移相关的新长链非编码RNA siRNA作用靶核 苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7、8、9、10任一序列所示。6. 权利要求5所述siRNA作用靶核苷酸序列在制备治疗宫颈癌疾病的药物中的用途。7. -种可用于权利要求1所述人宫颈癌转移相关的新长链非编码RNA序列RNAi用的 短发夹片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 11、12任一序列所示。8. 权利要求6所述RNAi用的短发夹片段在制备治疗宫颈癌疾病的药物中的用途。9. 包含权利要求1、3、5、7任一所述的核苷酸序列的载体。10. 包含权利要求1、3、5、7任一所述的核苷酸序列的重组子。
【专利摘要】本发明涉及人宫颈癌转移相关的新长链非编码RNA序列、可用于RNA干扰的靶点序列、编码干扰靶点的短发夹序列、及含有长链非编码RNA序列的RNAi靶点序列、shRNA短发夹核酸序列重组载体和重组子，本发明还涉及了该新长链非编码RNA序列的分离方法及其用途。本发明的长链非编码RNA序列基是通过生物信息学方法，从宫颈癌相关的cDNA文库中通过RACE扩增得到，通过测序、杂交、细胞增殖、细胞侵袭等试验，验证了该RNA序列的功能及其用途；设计该序列特异性的RNAi用shRNA、siRNA序列及重组载体，并验证了siRNA、shRNA的功能。本发明提供的长链非编码RNA序列、RNAi干扰靶点、shRNA短发夹序列在宫颈癌的早期诊断和治疗上具有重要意义。
【IPC分类】A61P35/00, A61K48/00, A61K31/7088, C12N15/10, C12N15/113, C12Q1/68
【公开号】CN104975023
【申请号】CN201510164640
【发明人】李官成, 蒋斌元, 房淑娟, 孙瑞利, 秦长飞, 李跃辉, 潘曦
【申请人】中南大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年4月2日