参与花青苷生物合成调控的myb转录因子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，设及一个参与菊花花瓣花青巧生 物合成转录调控的必陆转录因子紐掀公6 (SEQ;N0. 22)。
【背景技术】
[0002] 菊花是我国传统名花，亦是世界重要花弁之一，为仅次于玫瑰的世界第二大切花。 我国自主培育了近250个切花菊品种，其中单头切花大菊占切花产量总数的一半左右。花 色是菊花重要的观赏性状之一，单头切花大菊的花色多W原始色系黄、白为主，除此黄、白 之外，我国自主培育的菊花品种还有绿、青、粉红、红、紫和间色等其他色系，多色系的菊花 存在有助于改善切花菊文化的发扬及其产业的多元化。
[0003] 花青巧是众多红粉色系菊花品种的主要呈色色素，其积累量越高花色越偏红紫 色。花青巧的生物合成起始于苯丙氨酸途径，由多个酶参与催化，编码该些酶的基因转录水 平受到W化化席日FCW转录因子形成的MBW转录复合体的协同调控。在该S类转录因 子中，必阳转录因子对花青巧的生物合成调控具有最高的特异性。
[0004]W3是高等植物中成员众多的一类转录因子，依据结构划分，多数W巧或员属于 R2R3类，可参与植物表皮细胞分化、气孔细胞运动、黄酬类化合物(黄烧酬，花青巧和原花青 巧）生物合成调控、抵御冷害和干旱、糖响应和抗真菌感染等生命进程。参与植物花青巧生 物合成调控的W巧或员，已在众多植物体内得到鉴定，然而菊花中参与花青巧生物合成转 录调控的W巧或员至今未见报道，极大地限制了菊花花色品质改良育种及其产业多元化的 发展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一个参与菊花花瓣花青巧生物合成转录调控的必阳转录因 子恐6,其核巧酸序列如SEQ;N0. 22所示，具体特征如下； 1.序列特征 菊花恐6(SEQ;N0. 22)的编码序列全长为765个核巧酸，可编码一个含255氨基 酸的蛋白。CmMYB6蛋白序列中含有保守的R2R3 结构域，在转录因子大家族中属于 R2R3亚组。在CmMYB6的R3 结构域中，存在一个保守的巧/E化x2[R/口x3Lx化x3R基 序，可与bHLH转录因子相互作用，共同行使功能。此外，R3 结构域中还含有一个ANDV 基序，该基序存在于许多参与花青巧生物合成调控的必阳转录因子序列中。
[000引 2.基因功能 在菊花花瓣的发育过程中，公6(SEQ;N0. 22)的基因表达呈显著上升趋势，与花青 巧的积累呈良好正向相关性。紅例显著诱导菊花花青巧合成关键基因。?化7据动子活 性，进而增强花青巧的积累，且该一诱导效应受到转录因子的加强。
[0007] 本发明的另一个目的是提供必陆转录因子紐掀公6 (SEQ;N0. 22序列）在植物颜 色修饰的基因工程中应用，尤其在植物花青巧生物合成的转录调控中的应用。
[0008] 与化A化W协同在烟草叶片瞬时表达时，可强烈诱导花青巧的积累，使得 叶片呈现红色表型。基于此，。《S6(SEQ;N0. 22)可用于植物花青巧生物合成的转录调 控，进而改变植株颜色。
[0009] 恐6(SEQ;N0. 22)是菊花中首例报道的可调控花青巧生物合成，进而修饰植 株色泽的必巧成员。
[0010] 本发明W紫色切花菊'阿美地'为试材，应用RACE、实时定量PCR和瞬时表达等生 物学技术，分离鉴定出参与'阿美地'花瓣花青巧生物合成调控的必恐成员公6 (SEQ; NO. 22)。研究发现，随着'阿美地'花瓣中花青巧的积累，公6表达上调，与其呈良好正 向相关；公例增强菊花花青巧生物合成关键基因。巧垢动子活性，且与化A化公計办 同表达可显著诱导烟草叶片花青巧的积累。本发明利用RACE、实时定量PCR、双巧光素酶系 统技术和烟草瞬时表达技术，分离并鉴定出菊花。(SEQ;N0. 22)对花青巧生物合成 具有转录调控效应，可应用到植物颜色修饰的基因工程中。
【附图说明】
[0011] 图1 ;菊花4个W忍基因在花瓣发育过程及不同组织中表达模式分析。
[0012] 图2 ;菊花4个W忍基因在不同组织中表达模式分析。
[0013] 图3 ;菊花4个必巧基因对花青巧合成基因。巧垢动子的调控效应分析。
[0014] 图4 恐6(SEQ;N0. 22)诱导花青巧生物合成功能的鉴定。 具体实施例
[0015] 下面结合附图和实施例，W不具有调控花青巧生物合成功能的基因紐似（SEQ; NO. 19)、6M瓜公沈Q;N0. 20)和 做5(沈Q;N0. 21)，W及C滅做6(沈Q;N0. 22)为 例，对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
[0016] 在下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第=版)。
[0017] 实施例1;菊花。《^基因克隆 依据菊花RNA-Seq数据库信息，筛选出四个可能参与菊花花青巧生物合成调控的必恐 转录因子CffifeT公义CffifeT公朵。巧日CffifeT公6,其中CffifeT公6已含有部分开放型阅读框（0RF) 序列及3'非编码区（3'UTR)序列（SEQ;N0. 1)，C滅T公沈Q;N0. 2)和做5(沈Q;N0. 3)已含有部分0RF序列及5'UTR序列。应用基因特异引物2 (GSP2)SEQ;N0. 4、SEQ;N0. 5 和SEQ;N0. 6，W及巢式基因特异引物 2(NGSP2)SEQ;N0. 7、SEQ;N0. 8 和SEQ;N0. 9,利 用3'cDNA末端快速扩增（3'RACE)技术分别获得瓜似（SEQ;N0. 10)、恐4(SEQ; NO. 11)和做5"(569;祖12)的（3'UTR)序列。进而应用基因特异引物1(GSP1)SEQ; NO. 13 和SEQ;N0. 14，W及巢式基因特异引物 1(NGSP1)SEQ;N0. 15 和SEQ;N0. 16,利 用5'cDNA末端快速扩增（5'RACE)技术分别获得瓜似（SEQ;N0. 17)和恐6(SEQ; NO. 18)的5'非编码区（5'UTR)序列。
[001引 RACE程序中第一轮PCR程序为94°C，5min，5个循环的94°C10S和72°C2min30 s，5 个循环的 94°C10s，70°C30s和 72°C2min30s，30 个循环的 94°C10s，67°C30s和 72°C2min30s，72°C10min，4°Chold。第二轮PCR程序为 94°C，5min，30 个循环的 94°C 10s，65°C30s和 72°C2min30s，72°C10min，4°Chold。
[0019] RACE第一轮PCR体系为10 X Ex-Buffer 2 uL，2.5 mmol/L dNTPs1.6uL，10 ymol/L GSPl或GSP2 0. 5 uL，下游引物UPM 2 uL，Ex-hq 0. 1 uL，cDNA 0. 5 uL，加 灭菌双蒸水至20 uL。第二轮PCR体系为lOXEx-Buffer 2 uL，2.5 mmol/L dNTPs1.6 UL，10 ymol/LNGSPl或NGSP2 0.5 uL，下游引物NUP2 yL，Ex-Taq0.1 uL，稀释10 倍的第一轮PCR产物1uL加灭菌的双蒸水至20 uL。
[0020] 根据3'和5'UTR拼接得到自起始密码子（ATG)至终止密码子的恐J(SEQ; NO. 19)、C滅T公4 (沈Q;N0. 20)、做5(沈Q;N0. 21)和C滅T公6 (沈Q;N0. 22)的全长 序列。
[0021] 实施例2;菊花做基因表达模式分析 (一）实验方法 利用PrimerPremier5,依据紐掀似（沈Q;N0. 10)、C滅T公4 (沈Q;N0. 11)、做5"(SEQ;N0. 12)和C滅T公6(SEQ;N0. 1)的3'UTR序列分别设计实时定量PCR(QPCR)引物 组合沈Q;N0. 23 和沈Q;N0. 24、沈Q;N0. 25 和沈Q;N0. 26、沈Q;N0. 27 和沈Q;N0. 28 及SEQ;N0. 29和SEQ;N0. 30,PCR产物包含终止密码子，长度分别为198bp、2