参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个参与花青苷生物合成调 控的新型菊花转录因子仏似（SEQ :N0. 1)。
【背景技术】
[0002] 菊花是世界重要花卉之一，为仅次于玫瑰的世界第二大切花。菊花亦是我国传统 名花，具有悠久的历史和深厚的文化积淀。至今，我国研究者已自主培育了近250个切花菊 品种，其中单头切花大菊占切花产量总数的一半左右。花色是菊花重要的观赏性状之一，单 头切花大菊的花色多以原始色系黄、白为主，除此黄、白色系之外，我国自主培育的菊花品 种还有绿、青、粉红、红、紫和间色等其他色系。分析紫红粉色系菊花的呈色机制，是培育多 色系菊花重要的理论基础，有助于改善切花菊文化的发扬及其产业的多元化。
[0003] 花青苷是众多紫红粉色系菊花品种的主要呈色色素，其积累量越高花色越偏红紫 色。花青苷，又名花色素苷，属黄酮类化合物，由花青素和糖基结合而成。花青苷在植物体 内的生物合成起始于苯丙氨酸途径，由多个酶参与催化，而编码这些酶的基因在转录水平 上则受到从MZ辨卩勝必转录因子形成的MBW转录复合体的协同调控。在这三类转录 因子中，尽管i/ra转录因子对花青苷的生物合成调控具有较高的特异性，然而专录因 子的协同作用亦不容忽视。
[0004] 是植物中第2大转录因子家族，其基因序列中拥有保守的bHLH结构域，由 约60个氨基酸组成。典型的bHLH结构域的N端包含13 ~ 17个亲水的碱性氨基酸残基， 其后连接被任意长度的环一分为二的a螺旋（HLH，helix-loop-helix)。在bHLH结构域 的碱性氨基酸序列中，ffiR (His5-Glu9-Argl3)基序具有高度的保守性，可结合启动子序列 中的六核苷酸E-box基序（CANNTG)，进而调控靶基因转录。可参与植物心皮、花药和 表皮细胞的发育，光敏色素信号转导，植物激素信号转导和逆境响应，黄酮类化合物的生物 合成调控等生命进程。参与植物花青苷生物合成调控的威员，已在众多植物体内得到 鉴定，然而菊花中参与花青苷生物合成转录调控的成员至今未见报道，极大地限制了 菊花花色品质改良育种及其产业多元化的发展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一个参与花青苷生物合成调控的新型菊花祕￡辟专录因子 (仏祕￡似)，具有SEQ :N0. 1的核苷酸序列，其编码序列全长为1842个核苷酸，可编码一个 含614氨基酸的蛋白。CmbHLH2氨基酸序列中含有碱性螺旋-环-螺旋结构域，且在碱性结 构域内含有高度保守的ffiR (His5-Glu9-Argl3)基序，可结合启动子序列中六核苷酸E-box 基序（CANNTG);在其氨基酸序列的C端分布着MIR结构域，可与转录因子相互作用。
[0006] 本发明提供的菊花祕￡辟专录因子（在红色菊花品种中的基因表达最高， 粉色次之，黄色品种中最低。的这一表达模式与不同菊花品种积累花青苷的能力呈 显著正向相关。CmbHLH2可与CmMYB6相互作用形成转录蛋白复合体，结合花青苷合成关键 基因启动子并增强其表达活性，进而诱导花青苷的积累。
[0007] 本发明的另一个目的是提供菊花辟专录因子在改变植物色泽中的应用。 仏MM2与仏#/及彻、同在烟草叶片中瞬时过量表达时，可强烈诱导花青苷的积累，使得原 本绿色的叶片变成红色。因此，通过转基因的手段，使得在植物中过量表达，或者 抑制菊花植株中的表达，即可分别获得花青苷合成受到增强或者抑制的转基因植 株，其色泽会因花青苷合成的变化而变化。 仏似（SEQ :N0. 1)是菊花中首例克隆并经过功能鉴定的可调控花青苷生物合成， 进而修饰植株色泽的成员。
[0008] 本发明以三种不同花色的菊花品种Z1 (红色)，Z2 (粉色）和Z3 (黄色）为试材，应 用RACE、实时定量PCR、酵母双杂交、瞬时表达等生物学技术，分离鉴定出参与菊花花青苷 生物合成调控的成员仏（SEQ :N0. 1)。研究发现，仏MM2的基因表达与菊花 花色中红色程度呈良好正向相关，即越红的菊花品种中，仏MM2的表达量越高； 可与仏俗相互作用形成转录蛋白复合体，增强菊花花青苷生物合成关键基因启动 子活性，进而显著诱导烟草叶片花青苷的积累。
【附图说明】
[0009] 图1菊花2个基因在不同菊花品种中的表达模式分析。
[0010] 图2菊花2个基因对花青苷合成基因启动子的调控效应分析。
[0011] 图3菊花2个bHLH与CmMYB6转录蛋白质间的相互作用分析。
[0012] 图4仏（SEQ:N0. 1)诱导花青苷生物合成功能的鉴定。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图和实施例，对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护 范围。在下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第三版)。
[0014] 实施例1:菊花仏MZ似基因克隆 依据菊花RNA-Seq数据库信息，筛选出可能参与菊花花青苷生物合成调控的辟专录 因子仏MM2部分序列（SEQ:N0. 2)。应用基因特异引物2(GSP2)SEQ:N0. 3,以及巢式基 因特异引物2(NGSP2)SEQ:N0. 4,利用3' cDNA末端快速扩增（3' RACE)技术获得仏 的3'非编码区（3'UTR)序列（SEQ:N0. 5)。进而应用基因特异引物1 (GSP1)SEQ:N0. 6， 以及巢式基因特异引物1(NGSP1)SEQ:N0. 7,利用5' cDNA末端快速扩增（5' RACE)技术 获得仏MM2的5'非编码区（5' UTR)序列（SEQ:N0. 8)。根据所得的3'和5' UTR拼接 得到自起始密码子（ATG)至终止密码子的仏似（SEQ :N0. 1)的全长序列。
[0015] RACE 中第一轮 PCR 程序为 94°C 5min ; 94°C 10 s，72°C 2 min 30 s，5 个循环； 94〇C 10 s，70°C 30s，72°C 2 min 30 s，5 个循环；94°C 10 s，67°C 30s，72°C 2 min 30 s， 30 个循环；72°C 10 min，16°Chold。第二轮 PCR 程序为 94°C 5min;94°C 10 s，65°C 30s， 72〇C 2 min 30 s，30 个循环；72〇C 10 min，16〇Chold。
[0016] RACE第一轮PCR体系为10 X Ex-Buffer 2 yL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 yL，10 ymol/L GSP1或GSP2 0.5 yL，下游引物UPM 2 yL，Ex-Taq 0.1 yL，cDNA 0.5 yL，加 灭菌双蒸水至20yL。第二轮PCR体系为10 X Ex-Buffer 2 yL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 yL，10 ymol/LNGSPl或NGSP2 0.5 yL，下游引物NUP2 yL，Ex-Taq0.1 yL，稀释10倍的第一轮PCR产物1 yL，加灭菌的双蒸水至20yL。
[0017] 根据3'和5' UTR拼接得到自起始密码子（ATG)至终止密码子的仏（SEQ : NO. 1)的全长序列。为更加明确阐述本发明的内容，文中还应用了仏(GenBank KC686698)和仏#/万6 (GenBank KR002097)两个基因，其序列均来自已有的报道。
[0018] 实施例2:菊花仏MM2基因表达模式分析 (一）实验方法 利用 Primer Premier 5,依据~(SEQ :N0. 9)和~（SEQ :N0. 5)的 3' UTR序列分别设计实时定量PCR(QPCR)引物组合SEQ :N0. 10和SEQ :N0. 11以及SEQ :N0. 12和SEQ:N0. 13，PCR产物包含终止密码子，长度分别为201 bp和192 bp。以菊花actin 基因（SEQ :N0. 14)的表达为内参分析仏和仏MM2的表达模式，其QPCR引物组合为 SEQ:N0. 15和SEQ:N0. 16。所有QPCR引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR 产物再测序验证。
[0019] 分别提取三种不同花色的菊花品种的花瓣RNA，参照cDNA合成kit(Bi〇-Rad，USA) 说明书，合成 cDNA。参照 Ssofast EvaGreen Supermix kit(Bi〇-Rad，USA)说明书开展 QPCR 分析，米用 20 ML体系：其中 10 ML 2 XSsofast EvaGreen Supermix (Bio_Rad，USA)，1.0 ML上游引物（10剛），1.0 ML下游引物（10剛），2.0 ML稀释的cDNA和6.0 ML H20。QPCR 程序为：94°C，10 min;94°C 10 s，60°C 30 s，45 个循环。
[0020] (二）实验结果 基因表达分析结果表明，仏似（SEQ :N0. 1)的基因表达与不同花色菊花品种中的 花青苷积累呈良好正向相关（附图1)，即在红色菊花品种Z1中表达量最高，在粉色 菊花品种Z2中表达量次之，而在黄色菊花品种Z3中不表达。仏(SEQ :N0. 9)的基 因表达虽然也呈相