22bp、136 bp和154bp。W菊花actin基因（SEQ;N0.31)的表达为内参分析各个必阳转录因子的表 达模式，其QPCR引物组合为SEQ;N0. 32和SEQ;N0. 33。所有QPCR引物特异性经烙点曲 线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物再测序验证。
[002引分别提取四个'阿美地'花瓣发育阶段W及嫩叶和嫩茎的RNA，参照cDNA合成kit(Bio-Rad,USA)说明书，合成cDNA。参照SsofastEvaGreenSupermixkit(Bio-Rad,USA) 说明书开展QPCR分析，采用20ML体系；其中10ML2XSsofastEvaGreenSupermix 炬i0-Rad，USA)，1.0ML上游引物（10剛），1.0ML下游引物（10剛），2. 0ML稀释的cDNA 和 6. 0ML&0。QPCR程序为；94°C，10min;45 个循环的 94°C10s和 60°C30s。
[0023] 仁）实验结果 基因表达分析结果说明，C滅m?(SEQ;N0. 19)和C滅T公6(SEQ;N0. 22)的基因表达 在'阿美地'花瓣的发育过程中与花青巧积累呈良好正向相关（附图1)，且具有显著的组织 特异性（附图2)，而C滅T鮮（SEQ;N0. 20)和做5"(SEQ;N0. 21)的基因表达则与花青 巧合成无明显相关性（附图1和2)。
[0024] 实施例3;调控祀基因活性分析 (一）实验方法 应用引物组合SEQ;N0. ：34和SEQ;N0. 35、SEQ;N0. 36和SEQ;N0. 37、SEQ;N0. 38和SEQ；N0. 39及沈Q ;N0. 40和沈Q ;N0. 41，扩增C滅TW (沈Q ;N0. 19)、瓜公4 (沈Q ;N0. 20)、6Mf做5(SEQ;N0. 21)和C滅T公6(SEQ;N0. 22)的全长序列，分别搭载到pGreenll 0029 62-SK表达载体上，构建重组表达载体瓜似-况；恐况；做5"-况或恐6-况； 构建表达载体选用l^ast stat hi曲fidelity PCR system酶，PCR体系为Buffer (with Mgcl2)3 ML，dNTP (2. 5剛）2.4化，上下游引物（10剛）各1 ML，cDNA 0.6 化，酶0. 3化， 水21. 3化。将最终确认正确构建的表达载体电转化入GV3101: :pSoup农杆菌感受态细胞 中，挑选3个阳性克隆，用25%灭菌甘油保存，放于-80°C。
[00巧]将存放于-80°C的甘油菌划线接种于含25yg/ml庆大霉素、5yg/ml四环素和 50yg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28°C培养4她，选取少量菌落涂布到新的相同LB固 体培养基上，28°C培养12h。刮取生长良好的菌落，用渗透液（10mlMES，10mlMgCl2，150ml己酷了香酬，pH5. 6)悬浮，调其ODe。。为0.75左右。
[0026] 利用双巧光素酶系统，分析不同WS转录因子与菊花花青巧合成基因。巧垢 动子间是否存在调控效应。将含有不同重组表达载体的农杆菌按照两种方案进行组合处 理，①将含有紐似-況；恐況；恐5-況或恐6-況前农杆菌菌株分别与含有 化的农杆菌菌株按照10:1比例混合；③将含有做?-況;CffifeT鮮-況;做5"-或恐6-5轴勺农杆菌菌株分别与含有ifrMZW-5轴勺农杆菌菌株按照1:1比例混合，再按 照10:1比例与含有。巧?-Z化的农杆菌菌株混合。农杆菌菌株混合后，分别注射到本氏烟 草叶片中，每株烟草注射3片叶片。每个基因的3个阳性克隆各重复一次上述操作，构成3 个生物学重复。
[0027] 注射后的烟草于16h;她光暗周期、25°C、75%空气湿度的条件下培养3天，应 用Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(Promega，USA)和ModulusLuminometer (Promega，USA)检测叶片中两种巧光素酶（LUC和REN)的比值，据此分析转录因子与目标基 因启动子之间的调控效应。
[002引仁）实验结果 双巧光素酶瞬时表达分析结果显示，4个W巧或员中，仅6MT公6 (SEQ;N0. 22)具有激 活菊花花青巧合成基因。巧垢动子的效应，且在必化做协同表达时，该效应得到显著增 强（附图3)。
[0029] 实施例4;诱导花青巧积累分析 (一）实验方法 将分别含紐掀公6-况；必如化况或pGreenll 0029 62-SK的GV3101: :pSoup农杆 菌菌株按照1:1比例组合成农杆菌混合液，包括：口紙恐6-娜+pGreenll 0029 62-SK， 必如化娜+ pGreenll 0029 62-SK、C滅T公6-娜+必如化况；选取一株长势优良普 通烟草植株的3片嫩叶，W每片叶片中屯、叶脉为分界线，用无针头注射器在叶片左侧注射 恐6-娜+pGreenll 0029 62-SK混合液，右侧注射恐6-娜+化A化况絕合液； 另一株烟草3片嫩叶的左侧注射必化化-娜+pGreenll 0029 62-SK混合液，右侧注射 公化W-5於昆合液。注射部位为远离叶片中屯、叶脉的表皮细胞内，烟草于 16h ;她光暗周期、25°C、75%空气湿度的条件下培养8天，观察叶片的注射部位有无花青巧 的积累。每个基因的3个阳性克隆各重复一次上述操作，构成3个生物学重复。
[0030] 仁）实验结果 分析结果显示，注射公化做-5於昆合农杆菌的烟草叶片表皮细胞内可显 著积累花青巧，使得注射部位呈现明显的红色（附图4)。
[0031] 本发明利用RACE、实时定量PCR、双巧光素酶系统技术和烟草瞬时表达技术，分离 并鉴定出菊花。(SEQ;N0. 22)对花青巧生物合成具有转录调控效应，可应用到植物 颜色修饰的基因工程中。
【主权项】
1. 一个参与花青苷生物合成调控的转录因子，其特征在于，是参与菊花花瓣花青 苷生物合成转录调控的转录因子其核苷酸序列如SEQ:N0. 22所示。
2. 根据权利要求1所述的一个参与花青苷生物合成调控的#7辟专录因子，其特征在 于，所述转录因子的编码序列全长为765个核苷酸，可编码一个含255氨基酸的蛋白， CmMYB6蛋白序列中含有保守的R2R3MYB结构域，在MYB转录因子大家族中属于R2R3亚组， 在CmMYB6的R3MYB结构域中，存在一个保守的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序，可与bHLH 转录因子相互作用，共同行使功能。
3. 根据权利要求2所述的一个参与花青苷生物合成调控的#7辟专录因子，其特征在于， 所述R3MYB结构域中还含有一个ANDV基序，该基序存在于许多参与花青苷生物合成调控 的#7辟专录因子序列中。
4. 权利要求1所述一个参与花青苷生物合成调控的#7辟专录因子在植物颜色 修饰的基因工程中应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转录因子在植物花青苷生物 合成的转录调控中应用，进而改变植株颜色。
【专利摘要】本发明提供一个参与菊花花瓣花青苷生物合成调控的MYB转录因子CmMYB6，其编码区序列含765个核苷酸。CmMYB6氨基酸序列中含有保守的R2R3 MYB结构域，并在R3结构域内存在一个[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序和一个ANDV基序，前者可与bHLH相互作用，后者为参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子的特征基序。CmMYB6的基因表达在花瓣发育过程中呈上调趋势，与花青苷合成呈显著正相关，可诱导花青苷合成关键基因CmDFR启动子的活性，与MrbHLH1协同表达时，诱导效能显著增强，可强烈诱导烟草叶片花青苷的积累。因此，可用于植物花青苷生物合成的转录调控，修饰植株色泽。
【IPC分类】C12N15-29, C12N15-82, C07K14-415, A01H5-00
【公开号】CN104774251
【申请号】CN201510132705
【发明人】李方, 刘晓芬, 向理理, 殷学仁, 陈昆松
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月25日