烟草赤霉素合成转录调控因子基因的植物表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及烟草赤霉素合成转录调控因子基因RSG植物表达载体及其在缓解铝胁迫能力增强的转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002]在自然界中，铝通常以难溶性的硅酸盐或氧化铝的形式存在，对植物的生长是没有毒害的。但在土壤酸化过程中，土壤的pH值会下降，当pH低于5.0时铝离子就会从硅酸盐或氧化物中释放出来，并且溶解到土壤中，以Al3+的形式存在。在酸性土壤环境中，不溶性的铝化物转变为溶解状态的铝(Al3+)，进入土壤对植物产生毒害作用，甚至微摩尔水平的Al3+就能对植物产生严重的毒害效应。铝对植物的毒害作用主要是:影响细胞内正常信号转导途径等；铝离子与DNA/RNA结合干扰基因的复制和转录；影响细胞质膜上膜脂的流动性；影响细胞核的正常功能；影响植物根系对营养物质的吸收。铝毒对植物最显著的影响就是抑制根的生长，主要表现为根的伸长生长受到抑制，主根和侧根的根冠脱落，并且变粗短，根部颜色也变为褐色并弯曲膨大，表皮细胞也受到一定程度的损害；同时铝毒对植物叶片也有相当大的损害，会导致植物叶片数变少且发黄卷曲，光合作用过程受到抑制，植物碳、氮代谢、矿物质和水份的吸收均受到很大影响。
[0003]RSG (REPRESS1N OF SHOOT GROWTH)是从烟草中被分离出来的一种转录激活因子，它含有一个碱性亮氨酸拉链结构域(bZIP)，含有一个酸性结构域，在蛋白结构靠近N端有一个苯丙氨酸聚集区，在它的C端有一个丝氨酸富集区和一个谷氨酰胺富集区可能是转录激活结构域。在拟南芥基因组序列中包含bZIP家族中75种不同成员，其中有将近50个在文献中没有报道。RSG参与调解内源性GAs的含量，通过结合并激活拟南芥GA3 [编码在GA生物合成途径上的内根-贝壳杉稀氧化酶(ent-kaurene oxidase,KO:GA合成代谢的关键酶)启动子，从而参与调控内源性GAs的量。负显性的RSG抑制了转基因烟草中KO基因的表达。这个下调减少了内源性GAs的量，并且严重抑制了茎细胞伸长过程，导致植株矮化。因此，RSG通过控制内源性GAs的量来控制植物的形态。尽管GA的生物合成限于特定区域(包括生长活跃区和伸长组织)，但RSG在植物组织中的表达无处不在。这种不一致表明它是一个参与转录后和翻译后修饰的转录因子。一种可能的RSG调节功能的机制是:RSG与辅助蛋白(包括不同的转录活化物，阻遏物，一般转录因子，共激活物或伴侣蛋白)的相互作用。
[0004]RSG能调节控制GAs生物合成酶来控制内源性GAs的量。在植物组织中，RSG的普遍表达表明:它是一个参与转录后和翻译后修饰的转录因子。在植物体内只有少数具有活性的GAs分子(如GAl和GA4等)就调控生物体细胞伸长、叶片延展，茎杆延生和开花等形态发生等多方面。在之前的报道中，RSG严格调控KO和GA20OX基因的表达从而控制内源性GAs的合成，而这种调控又受到外界环境及植物发展本身的影响。Atga3突变体拟南芥由于KO基因和功能欠缺，导致植株表型出现矮化。采用自然突变得到的矮化水稻Tan-Ginbozu是赤霉素缺陷型突变体，其GAs合成过程中，由于KO和GA20OX催化的步骤受阻，从而影响了 GAs的合成，结果导致植株矮化。目前编码KO的基因在水稻、拟南芥、豌豆、玉米、南瓜、甜叶菊等植物中相继得到克隆，同时，也报道了草莓、桃和苹果多年生果树上得到了的部分cDNA片段。而采用反义抑制表达技术构建的抑制表达RSG或GA20ox的烟草植株同样发现，烟草出现显著的矮化现象，同时叶片呈暗绿色且表面呈现显著的凹凸样，且花朵和种子量均显著低于对照组烟草，对内源性活性的赤霉素GAl的测定结果表明，GAl的量明显低于对照组，约为对照组的七分之一。而过表达35S:RSG的转基因烟草，植物生长的更高，叶片数和花朵种子的数量也都显著高于对照组，茎杆也相对更粗，这说明RSG能通过调节内源性GAs的量来调控植物形态的建成。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种含有烟草赤霉素合成转录调控因子基因(即基因)的植物表达载体pk2-35S-7?5^，同时提供该载体的构建方法，以及利用该载体制备耐受铝胁迫的转基因植物的应用。
[0006]本发明所提供的载体含有烟草赤霉素合成转录调控因子基因、CaMV35S强启动子，所述的赤霉素合成的转录调控因子基因必15前cDNA来源于烟草(Nicotiana tabacum),GenBank 登录号为 AB040471.1。
[0007]上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pMD18_T(购于大连TaKaRa生物公司)。
[0008]本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的:
1、植物表达载体的构建
(I)从GenBank中查找烟草基因的cDNA序列，并设计一对序列如下的引物:
上游引物 5’ GGATCCATGGACCCGAAGTTCAGCGGAAAGC 3’(含有 BamHI 位点)；
下游引物 5’ CTCGAGTCAACCCCTGTTATTGAAGTTCATG 3’(含有 XhoI I 位点)；
上游引物5’端加GGATCC特征序列，并由此形成BamHI酶切位点；下游引物3’末端加XhoI I酶切位点，以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到RSG基因的全长cDNA。
[0009](2)回收并纯化全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD_18_T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-T-RSG。
[0010]2、构建入门克隆载体 pENTR-2B-NtRSG，用 BatnHlM Xhol 酶切 pMD18_n5^和pENTR-2B，回收前cDNA片段，通过连接酶亚克隆到pENTR，得到入门克隆载体pENTR-RSG ；
3、构建植物过表达载体pK2-35S-7?51?，通过Gateway技术的LR反应把7P515亚克隆到植物表达载体PK2GW7中，获得基因的植物表达载体pK 2-35S-7?^o
[0011]本发明的植物表达载体对那些能实施转基因操作的植物都适用，如烟草、拟南芥、矮牵牛、非洲菊等，在本发明的实施中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。
[0012]4、农杆菌浸染烟草
使用叶盘转化法，以根癌农杆菌C58C1为媒介，转染烟草15-20 min，浸染成功后的烟草外植体，放置于MSl培养基(含3%蔗糖)黑暗条件下共培养48 h，再转移至MS4 (含3%蔗糖、5(^g/ml卡拉霉素和100 μ g/ml头孢霉素)发芽培养基上分化愈伤组织并诱导出芽，在培养条件(日间30°C /夜间25°C，12 h光照，200 Ix)约25 d后，转染成功的外植体会分化出转基因小苗，剪取小苗并继代与MS (含2%蔗糖、50 μδ/πι1卡拉霉素和lOOPg/ml头孢霉素)琼脂糖培养基中进行传代培养一次，以抑制农杆菌生长，以后传代则可以在无抗性的生根培养基MS琼脂糖培养基中培养。
[0013]5、忍堪因插入情况的检测
为了检测目的基因是否插入有卡那霉素抗性和头孢霉素抗性的植株烟草的基因组，以抗性苗的基因组为模板，利用/?兄上下游引物做PCR检测，PCR扩增产物片段长度与理论值相符，说明目的基因/PM已插入到烟草基因组中。
[0014]6、7?515基因转录水平的检测
为了检测目的基因在转基因烟草中是否转录，提取转基因苗的RNA，提取可溶性蛋白，分离蛋白，利用Western-blot检测，说明目的基因/?兄已在转基因烟草中正常转录。
[0015]7、基因过表达后植物根长度的检测
为了检测目的基因过表达烟草中对铝的耐性是否提高，选取经RT-PCR检测正确的转基因株系的嫩叶，对根伸长进行了检测，测定结果显示，过表达烟草根伸长率明显高于野生型，说明前过量表达能够缓解铝胁迫对烟草根伸长的影响。
[0016]8、7?51?过表达烟草赤霉素含量的检测
以转基因烟草R03和RIlO为材料，经50 μΜ铝处理12 h后，以WT烟草味对照，对转基因烟草的根部赤霉素含量进行了测定，结果发现RSG过表达烟草R03的赤霉素含量明显高于WT烟草；而RSG抑制表达烟草的赤霉素含量比WT烟草明显要低。这说明RSG的过量表达能够缓解铝胁迫对烟草根伸长的影响与赤霉素有关。
【附图说明】
[0017]图1是本发明载体pMD18T-RSG的构建图；
图2是本发明RSG植物过载体载体pK2-35S-7?515构建示意图；
图3是本发明过表达RSG转基因烟草基因组插入