基于杂交连接法检测非编码rna转录水平的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种精确测量非编码RNA转录水平的方法，尤其涉及一种与实时荧光 定量PCR联用检测非编码RNA的方法。
【背景技术】
[0002] 传统观念认为RNA的主角就是mRNA、rRNA、tRNA这些基因表达的重要组件，有 关ncRNA全新功能的发现为生命科学研宄带来了一个全新领域，现在越来越多的研宄证实 RNA可以在生命活动中扮演更多不同的角色。除了基因转录和蛋白质合成，ncRNA还参与到 了各种RNA进程、DNA损伤修复以及基因组重排这些生命活动中。随着越来越多的新ncRNA 被发现及鉴定出来，它们组成了一个日渐庞大的生物网络，不仅革新了生命科学领域的传 统观念，并且展示出在临床应用方面的无限可能，也让生物学家们更加关注ncRNA的功能 机制以及它们在人类疾病中所起到的作用。
[0003] 现在，大多数的人类ncRNA已经被鉴定及测序并且可以在GenBank、NONCODE、还有 UCSC等数据库中查找得到。除了蛋白质外，ncRNA会对外界胁迫以及环境刺激产生应答。 在受刺激之后的细胞中ncRNA表达量的变化将成为了解细胞应对环境刺激的关键所在。因 此，通过分析特定ncRNA的表达水平将有助于识别诊断细胞的状态变化，比如判断其是否 处于肿瘤形成期间或正在应对某种外界环境的刺激。那么，与临床参数（如疾病严重等级 或治疗效果）相关的ncRNA的稳定表达水平可以作为临床应用相关的生物学指标。所以， 一种可以精确测定人体细胞或组织中ncRNA某时期稳定表达水平的方法会是发现ncRNA在 健康和疾病中所起到的生物学、病理学以及临床角色的重要工具。
[0004] 实时荧光定量PCR无疑是定量检测核酸分子的生物技术先驱。大量新发现的细 胞调控机制以及对临床诊断和预后生物靶标的不断研宄，导致使用此技术发表的论文数目 一直都在快速增长中，同时也反映了其在分子生物学领域的重要地位，其常与逆转录联用 (RT-qPCR)广泛地应用于ncRNA的表达检测。为了获得始终一致的、生物学相关的qPCR测 量值，研宄者们必须完成大量复杂的技术步骤、充分解决一系列的质控问题、合理地设置仪 器得到精确的扩增图谱，还要选择合适的相关统计学方法分析所得到的数据。
[0005] 实际上，许多被报道出来的qPCR结果都是无意义的，因为若无法获取反应条件优 化、质控过程、数据分析等步骤的具体信息，论文读者也不能将可信结果从一大堆有偏差的 数据中区分开来。而这种无意义的qPCR结果往往是由于与逆转录反应联用所产生的，主要 是因为逆转录效率严格受到样品本身的质量、样品的制备方法、模板的特性及所采用的分 析方法等各因素影响，具有极大的局限性和不稳定性。
[0006] 在与非编码RNA相关的研宄中，检测它转录水平的变化是非常关键的数据。该数 据可能表征或预示人类是否健康和处于某种疾病，可以成为临床诊断的依据之一（该数据 只是在未来的研宄中可能成为临床诊断疾病的一种依据，但与疾病诊断并不构成严格的 一一对应关系，且除了用于疾病诊治，该数据还可广泛应用到其他非诊断类的生物医学科 研活动中）。实时荧光定量PCR常与逆转录联用（RT-qPCR)广泛地应用于非编码RNA的检 测，但由于逆转录非编码RNA的效率不稳定，使许多有重大意义的研宄结果都无法重现。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是，克服以上【背景技术】中提到的不足和缺陷，提供一 种基于杂交连接法检测非编码RNA转录水平的方法，该方法能简便、快速、安全、准确地进 行定量分析待测非编码RNA，且能提高实验结果的可重现性。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种基于杂交连接法检测非编码 RNA转录水平的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)经提取、提纯获得含待检测目标ncRNA的样本液；
[0010] (2)配制杂交反应体系，使上述样本液中的待检测目标ncRNA与两个完全互补配 对的DNA片段进行杂交，形成ncRNA-oligos杂合链；
[0011] (3)配制连接反应体系，用T4DNA连接酶对上述得到的ncRNA-oligos杂合链进行 缺口修复，得到含杂交连接DNA(简称HL-DNA)的待检测样本；前述合成HL-DNA的方法可称 为"杂交连接法"，所构建的体系可称为"杂交连接检测体系"；
[0012] (4)以上述得到的含HL-DNA的待检测样本为模板，直接用于荧光定量PCR的检测， 根据检测结果分析待检测目标ncRNA的转录水平。
[0013] 上述的方法中，优选的，所述步骤（1)中的提取是采用Trizol法，具体包括以下操 作：
[0014] (1. 1)以特定目标细胞为培养对象，培养完成后吸除旧培养液，用预热后的 1XPBS清洗目标细胞；
[0015] (1. 2)使用细胞刮刀将目标细胞刮下、收集，经冷冻离心机离心处理；
[0016] (1.3)将离心处理后的上清液去除，加入Trizol，经涡旋震荡后，加入氯仿，继续 将其涡旋震荡，室温放置后自然分相；
[0017] (1. 4)再经冷冻离心机离心处理，此时样品分为三层，取上层无色透明清液转移至 离心管中；
[0018] (1. 5)在转移后的无色透明清液中加入异丙醇，然后静置，再离心处理；
[0019] (1.6)当离心处理分层后，移除上清液，在剩余的白色沉淀中加入预冷的乙醇冲 洗，震荡清洗白色沉淀；
[0020] (1. 7)继续离心处理，去除上清液后干燥；
[0021] (1. 8)最后加入RNase-freeH20溶解干燥后的沉淀，使其充分溶解，离心处理后转 移至EP管中保存。
[0022] 上述的方法中，优选的，所述步骤（1)中的提纯是采用DNaseI处理和抽提处理， 具体包括以下操作：
[0023] (2. 1)使用DNaseI处理经提取后获得的总RNA，反应体系如下：按照一定的添加 比例向总RNA中加入DNaseI和ReactionBuffer，无菌水补足至最终体积，上下颠倒混勾， 置于37°C反应，然后加入一定量的EDTA，震荡离心，65°C反应一段时间；
[0024] (2. 2)在经过上述DNaseI处理后的总RNA中加入为总体积1/10的NaAc溶液，再 加入等体积的氯仿/苯酚/异丙醇，涡旋震荡，离心；取上层清液，再加入等体积的氯仿，涡 旋震荡，离心；取出上层清液，使用糖原沉淀RNA，稍加混匀后再加入无水乙醇略微震荡混 匀；于-80°C中放置超过15min，离心，弃上层清液，再加入乙醇溶液，震荡，清洗沉淀，再离 心处理后弃上层清液，室温晾干沉淀，干燥后加入适量ddH20溶解沉淀。
[0025] 上述的方法中，优选的，所述步骤（2)中的杂交反应体系的配制方法包括：
[0026] 配制组分：
[0027]上游片段，lyM，0.5yL;
[0028] 下游片段，1yM，0. 5yL;
[0029] 10 X杂交缓冲液0? 5 y L ;
[0030] 提纯后的总RNA，彡 2. 555yg，补加RNase-freeH20 至 5yL;
[0031] 混匀后，按照以下条件进行杂交反应：95°C、5min，45°C、30min，然后立即取出冷却 至室温（针对不同的目标非编码RNA，本领域人员可以自行设计与待检测非编码RNA互补配 对的上游片段和下游片段）。更优选的，所述上游片段和下游片段的长度范围为50?59bp。
[0032] 上述的方法中，优选的，所述步骤（3)中的连接反应体系的配制方法包括：
[0033] 配制组分：
[0034] 步骤⑵杂交后的杂交产物，2 y L ;
[0035] 5XBuffer(连接缓冲液），4yL;
[0036] T4DNA连接酶，1yL;
[0037]补加RNase-freeH20至20 uL;
[0038] 混匀后，按照以下条件进行酶连反应：251：、211，651：、1〇1^11，冷却至4°〇；
[0039] 最后将连接好的HL-DNA瞬间离心，可放于-20°C长期保存。
[0040] 上述的方法中，优选的，所述步骤（4)中的荧光定量PCR的扩增程序包括：预变性 95°C、5min，变性温度95°C、10s，退火温度55°C?57°C、30s，延伸温度72°C、10s，循环次数 40,紧接恪解曲线分析；检测结束后，使用Bio-RadCFXManager进行结果分析。
[0041] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明设计了一种全新的单一ncRNA检测 方法可以越过逆转录这一步骤，直接针对目标ncRNA，这让检测变得更准确、更专一。相比逆 转录法与实时荧光定量PCR联用，杂交连接法取代了逆转录这一步骤，且直接针对待检测 的目标ncRNA，这为检测特定的ncRNA转录水平提供了更优越的检测环境。因此，本发明对 定量检测某一特定ncRNA的准确度有所提升，且检测结果的可重现性更佳，若用其检测不 同时期细胞中同一ncRNA的转录量可信度