一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法与流程

本发明涉及一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法，属于实验模型评估领域。

背景技术：

近十余年以来，microRNA(miRNA)一直是分子生物学领域的研究热点，目前已发现miRNAs是一类由非蛋白编码基因转录物形成茎环结构前体，经酶剪切成熟后形成的长度为18～25个核苷酸的小RNA分子。miRNAs可以在转录后水平参与调控真核生物的基因表达，其通过不完全的碱基互补，作用于特异性靶基因，形成强大的调控网络，导致靶基因稳定性降低或表达减少，在各种细胞的发育、增殖、分化以及细胞死亡等过程中起到举足轻重的作用。

目前学术界对于食物来源的MicroRNA能否被进食者吸收仍存在争议。现有的实验方法主要为给小鼠喂食含有某种特定MicroRNA的食物或合成MicroRNA，之后将小鼠血液中的MicroRNA反转录为DNA，使用聚合酶链式反应检测。现有方法主要存在如下不足：a、小鼠体内若存在与食物来源的MicroRNA序列相似的MicroRNA，则会对检测结果造成干扰，影响结果的准确性。b、使用合成MicroRNA时，实验成本高、周期长。

虽然学术界有大量以MicroRNA基因敲除动物为模型开展的研究。但是，对于该类模型的可靠性，特别是被敲除基因是否仍会出现在基因敲除小鼠中这一问题，仍然缺乏简单有效的评估手段。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法，通过喂食待验证的MicroRNA基因敲除动物特定食物，一定时间后取出喂食后动物血样，检测其中是否有被敲除的MicroRNA。

本发明提供一种准确、快捷、经济的判断食物来源的MicroRNA可吸收性的方法，喂食miR-144/451-/-基因敲除型小鼠富含MicroRNA-451的食物后，在miR-144/451-/-基因敲除型小鼠体内检测到MicroRNA-451(喂食的食物为野生型小鼠的血液)，解决了现有技术中存在的问题，对所有使用MicroRNA基因敲除动物的实验室有重要意义，具有较强的市场实施性。

本发明的具体技术方案如下：一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法，其特征在于，包括以下步骤:

1)准备好相关实验试剂；

2)野生型小鼠和miR-144/451基因敲除的雄性小鼠各两只，通过繁殖得到大量的野生型小鼠和miR-144/451基因敲除鼠；

3)按照SPF(Specific Pathogen Free无特定病原体)级饲养标准饲养小鼠，湿度控制在40％-70％，温度控制在20-25℃，用已灭菌处理的饲料、垫料和饮水一周更换二到三次；

4)合笼方式为1只miR-144/451基因敲除的雄鼠和1-5只miR-144/451基因敲除的雌鼠交配进行繁殖，发现雌鼠有怀孕表现立即分笼生育，并及时记录生育出的小鼠父母系来源；

5)步骤4)中的小鼠DNA提取:取3周龄的小鼠尾部末端组织，长度为0.5cm，放入1.5ml EP管中，每管加l00μl裂解液，95℃，静置20分钟，冷却后加入l00μl中和液混匀，取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR(聚合酶链式反应)进行小鼠基因型鉴定；

6)小鼠DNA的PCR：下列反应物构成20μl的PCR反应体系：含鼠DNA的上清液2μl、引物1μl、DNA聚合酶混合物10μl、双蒸水7μl；上述材料混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增：预变性，95℃，5分钟；变性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1min；循环，72℃，5分钟；

7)进行琼脂糖凝胶电泳：取琼脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE电泳缓冲液中，微波炉中加热至沸腾，将溶解澄清的琼脂物室温冷却至60℃加入Goldview5μl或EB 3μl混匀，缓缓倒入已置好梳子的胶板中，室温放置30min，待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子；将制备好的1.5％琼脂糖凝胶放入电泳槽，加入1×TAE溶液至高出凝胶表面；取PCR反应终产物10μl加样到胶孔中，电压100V电泳，时间为30min；

8)凝胶成像：电泳结束后，取出凝胶置于凝胶成像分析仪下拍照，小鼠电泳基因型片段为：miR-144/451野生型小鼠为290bp、纯合子190bpheterozygous(-/+)250bp和190bp；

9)喂食：使用带有抗凝剂的玻璃毛细管从miR-144/451野生型小鼠小内眦静脉取血200微升，使用12#灌胃器将野生型小鼠的血液喂食给miR-144/451基因敲除型小鼠；

10)提取样本：在喂食3小时、6小时、12小时、24小时后，分别使用带有抗凝剂的玻璃毛细管从miR-144/451基因敲除型小鼠小内眦静脉取血200微升；

11)提取样本中的RNA：每0.1mL步骤10)得到的全血加入裂解液Trizolreagent 1ml，大力混匀，静置5到10分钟；加入200μl氯仿，剧烈摇晃15s，静置5分钟；4℃，12000g离心15min；将上清转入新的EP管，加入500μl异丙醇，颠倒混匀后室温沉淀10min；4℃，12000g离心20min；弃上清，加入1ml75％乙醇；4℃，12000g离心5min；弃上清，室温静置至干燥加入20μlDEPC水溶解；55℃水浴5min；

12)反转录RNA:配置反应液体系：步骤11)中得到的总RNA 1ng、RTase Mix1μl、5xReaction Buffer 5μl，使用ddH₂O将反应体系补足至25μl；混匀后加温至37℃，而后保温60分钟，再加温至85℃，保温10分钟；

13)全血DNA的PCR：下列反应物构成20μl的PCR反应体系：步骤12)得到的全血DNA 2μl、上游引物2μl、下游引物2μl、DNA聚合酶混合物10μl、双蒸水7μl；混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增：预变性，95℃，5分钟；变性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1min；循环，72℃，5分钟；

14)使用U6作为内参，判断miR-451的表达水平。

步骤7)中，50ml的TAE电泳缓冲液由57.1ml的冰乙酸、242g的Tris-base、100ml浓度为0.5mol/L的EDTA配制而成，并由双蒸水定容至1L。

步骤7)中，1×TAE电泳缓冲液由10ml的50xTAE电泳缓冲液加双蒸水定容至500ml。

步骤7)中，所述EB浓度为10mg/ml，由1g的EB、100ml的去离子水混匀溶解后避光保存，室温放置而制成。

步骤5)中，所述裂解液由40μl的0.5M EDTA、25μl的10N NaOH、100ml的蒸馏水制成，并调节PH至8.0。

步骤5)中，所述中和液由4ml的1M Tris-HCl加蒸馏水定容至100ml。

本发明通过提供一种准确、快捷、经济的判断食物来源的MicroRNA可吸收性的方法，可以辅助判断实验室使用的MicroRNA基因敲除动物是否可靠。主要实施方法如下：

1.培育基因敲除特定MicroRNA的小鼠；

2.通过查阅文献，找到该种MicroRNA含量丰富的动植物组织；

3.将上述动植物组织制成食物喂食给特定MicroRNA基因敲除型小鼠；

4.在喂食后三小时、六小时、十二小时、二十四小时取出小鼠血，检测其中的MicroRNA含量。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

通过喂食待验证的MicroRNA基因敲除动物特定食物之后，一定时间后取出喂食后动物血样，在其中检测到了被敲除基因所编码的MicroRNA。可以得出结论：被敲除的MicroRNA可以通过食物进入MicroRNA基因敲除动物体内，MicroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性不高。

本发明将含有MicroRNA-451的食物喂食给MicroRNA-451基因敲除型小鼠，继而在小鼠体内检测到该种MicroRNA。喂食之后，小鼠红细胞的抗氧化能力增强，说明食源性MicroRNA可以通过消化道进入小鼠体内，并发挥功能，因此mm-451基因敲除型小鼠不能排除食源性MicroRNA-451的干扰，可靠性不高。本发明提供一种判断MircroRNA基因敲除动物作为实验动物模型的可靠性的方法，将被使用MicroRNA基因敲除动物开展相关实验的研究机构和企业广泛应用，具有极大的科学价值和经济效益。

附图说明

图1是喂食富含MicroRNA-451血液之后，miR-144/451-/-基因敲除型小鼠体内MicroRNA-451含量变化情况；

图2是不同基因型小鼠鉴定凝胶电泳图。

具体实施方式

一种根据本方法判断miR-144/451-/-基因敲除型的实验方法，包括以下步骤：

S1：准备好相关实验试剂

(1)本实施例涉及的实验试剂如下表所示：

(2)本实施例涉及的主要自配试剂如下表所示：

(3)本实施例中应用到的PCR引物：

(3.1)实时荧光定量PCR用引物：

miR-451上游引物5’-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3’

下游引物为GeneCopoeia公司All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit中的通用引物。

(3.2)基因型鉴定引物：

miR451上游引物：5’-TTCTGCCTGTAACTCTGGATCCCTAAGAGA

miR451下游引物-1：5’-GGGTACCCAGACTAGTACATCATCTATA

miR451下游引物-2：5’-ATCCCCTCGAGGGACCTAATAACTTC

S2：扬州大学非编码RNA中心由美国宾夕法尼亚大学附属费城儿童医院引进β-globin-/+和miR-144/451-/-基因敲除雄性小鼠各两只，扬州大学比较中心C57/BL6雌性小鼠若干只，目前已繁殖得到大量的基因敲除β-地中海贫血鼠，miR-144/451基因敲除鼠和miR-144/451基因敲除的β-地贫鼠模型。

S3：按照SPF(Specific Pathogen Free无特定病原体)级饲养标准饲养小鼠。湿度控制在40％-70％，温度控制在20-25℃，用已灭菌处理的饲料、垫料和饮水一周更换二到三次。

S4：合笼方式为1只基因敲除的雄鼠和1-5只基因敲除的雌鼠交配进行繁殖，发现雌鼠有怀孕表现如阴栓或腹部呈梨形立即分笼生育并及时记录小鼠父母系来源。

S5：小鼠DNA提取：取3周龄的小鼠尾部末端组织，大小约0.5cm，放入1.5ml EP管中，每管加l00μl裂解液，95℃静置20min。冷却后加入l00μl中和液混匀，取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR进行小鼠基因型鉴定。

S6：小鼠DNA的聚合酶链式反应(PCR)：引物由上海生工生物工程有限公司提供。PCR反应体系：下列反应物构成20μl的反应体系。鼠尾DNA 2μl，引物(20μmol)μ1，DNA聚合酶混合物(Taq DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2和反应缓冲液)10μl，双蒸水7μl。混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增：预变性，95℃，5分钟；变性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1分钟；循环；72℃，5分钟。

S7：进行琼脂糖凝胶电泳：取琼脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE电泳缓冲液中，微波炉中加热至沸腾，将溶解澄清的琼脂物室温冷却至60℃加入Goldview 5μl或EB 3μl混匀，缓缓倒入已置好梳子的胶板中，室温放置30min待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子。将制备好的1.5％琼脂糖凝胶放入电泳槽，加入1×TAE溶液至高出凝胶表面。取PCR反应终产物10μl加样到胶孔中。电压100V电泳，时间为30分钟。

S8：凝胶成像：电泳结束后，取出凝胶置于凝胶成像分析仪下拍照，小鼠电泳基因型片段为：β-地中海贫血小鼠鉴定是，一条大小为567bp(base pair，碱基)的条带为野生型正常鼠，一条大小为1000bp的条带为纯合子β-地中海贫血小鼠；出现以上两条条带的为β-地中海贫血杂合子。miR-144/451野生型小鼠为290bp；纯合子190bp；杂合子(-/+)250bp和190bp。

S9：喂食：使用带有抗凝剂的玻璃毛细管从miR-144/451野生型小鼠小内眦静脉取血200微升，使用12#灌胃器将野生型小鼠的血液喂食给miR-144/451基因敲除型小鼠；

S10：提取样本：在喂食3小时、6小时、12小时、24小时后，分别使用带有抗凝剂的玻璃毛细管从miR-144/451基因敲除型小鼠小内眦静脉取血200微升；

S11：提取样本中的RNA：每0.1mL步骤10)得到的全血加入裂解液Trizolreagent 1ml，大力混匀，静置5到10分钟；加入200μl氯仿，剧烈摇晃15s，静置5分钟；4℃，12000g离心15min；将上清转入新的EP管，加入500μl异丙醇，颠倒混匀后室温沉淀10min；4℃，12000g离心20min；弃上清，加入1ml75％乙醇；4℃，12000g离心5min；弃上清，室温静置至干燥加入20μlDEPC水溶解；55℃水浴5min；

S12：反转录RNA:配置反应液体系：步骤11)中得到的总RNA 1ng、RTase Mix 1μl、5xReaction Buffer 5μl，使用ddH₂O将反应体系补足至25μl；混匀后加温至37℃，而后保温60分钟，再加温至85℃，保温10分钟；

S13:全血DNA的PCR：下列反应物构成20μl的PCR反应体系：步骤12)得到的全血DNA 2μl、上游引物2μl、下游引物2μl、DNA聚合酶混合物10μl、双蒸水7μl；混匀离心后置于PCR仪设定条件循环扩增：预变性，95℃，5分钟；变性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1min；循环，72℃，5分钟；

S14:使用U6作为内参，判断miR-451的表达水平。