一种对男性个体进行快速Y‑STR分型的方法和系统与流程

本发明涉及一种亲权鉴定的方法和系统，尤其涉及一种对男性个体进行快速Y-STR分型的方法和系统。
背景技术：
：自1985年英国Jeffreys首次将DNA指纹图应用于一起移民案件的亲权鉴定以来，经过近三十年的发展，DNA分型技术不仅应用于常规案件中的生物物证检验，还应用于一些疑难和紧急案件的处理，例如在法定拘留或监控时间内查找证据或是危及生命的国际安全问题。然而，常规的检测方法需经过DNA提取和PCR扩增之后才能进行DNA分析，这一过程需要8～9个小时，其中PCR扩增需3-4个小时，是检验过程中最耗时的步骤，为缩短反应时间提高检验效率，由此提出了快速PCR技术。目前，快速PCR的研究主要集中在DNA聚合酶的改进、添加剂的研发及热循环仪的革新等三个方面。在PCR反应中，提高DNA聚合酶的延伸活性和速率将会显著缩短扩增时间。目前，商品化的快速聚合酶有Takara公司的SpeedSTARTMHS、Fermentas公司的PyroStartFastPCRMasterMix、Kappa公司的KAPA2GFastPCRKits等，不同聚合酶的保真度、特异性等都有差别。Vallone等尝试将PyroStart和SpeedSTAR两种热启动酶混合，于36分钟内完成了对1ng模板DNA的16重STR复合扩增。Verheij等利用高效的PhusionFlash聚合酶在PIKO快速热循环仪上，对多种实验样本(血斑、唾液斑、精斑、毛囊)DNA进行STR扩增。PCR反应每个循环中变性、退火、延伸时升降温所需时间直接影响PCR扩增时间，减少各阶段时间及循环数均可以缩短扩增时间。此外，采用热性能良好且热利用率高、升降温速率快的高速高效PCR仪也可实现快速PCR的目的。例如，美国Streck公司的PhilisaThermalCycler、德国耶拿公司的SpeedCycler2等。然而，快速PCR在缩短时间的同时也会带来一些诸如影子带增多、非特异性扩增、基因座之间平衡性被破坏、或等位基因丢失等问题，从而对DNA分型结果的解释造成困难。如何构建一个新的检测体系，在实现对男性个体进行快速的Y染色体STR分型的同时能避免上述问题成为有待解决的课题。技术实现要素：本发明提供了一种对男性个体进行快速Y-STR分型的方法，能快速获得所述检材16个Y染色体STR基因座的基因型，从而获得男性个体Y染色体STR分型结果。本发明还提供一种对男性个体进行快速Y-STR分型的系统，通过该系统可以实现对男性个体针对上述16个基因座的快速、准确分型，从而实现对所述男性个体进行快速父系亲属鉴定、家系排查等。本发明还提供了一种复合检测体系，所述检测体系能快速获得男性个体16个Y染色体STR基因座的基因型，为实现对所述男性个体进行快速父系亲属鉴定、家系排查等提供数据支持。本发明还提供了一种快速检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。本发明提供的一种对男性个体进行快速Y-STR分型的方法，该方法包括：1)提取所述男性个体的DNA；2)获得所述DNA16个Y染色体STR基因座的基因型，所述STR基因座为DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439；3)根据所述16个STR基因座的基因型获得所述男性个体Y-STR分型结果；其中2)包括采用与所述16个基因座对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤，扩增过程中采用的热循环参数为：①95℃，4min；②28-30个循环，每个循环95℃5s，59℃30s，72℃10s；③72℃，7min；④25℃，保温。在本发明的方案中，所述16个Y染色体基因座是申请人通过对中国人群男性个体的生活环境、种族起源等进行综合分析，考察各地区民族人口的表型特征差异，包括外形特征，生理指标等，针对这些差异进行文献和网络数据库调研，在已有研究的基础上获得的能进行Y染色体STR分型的特异性基因座的组合。在本申请的方案中，所述男性个体的Y-STR分型结果指的是能用于对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定等的Y-STR分型结果。进一步的，基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的扩增引物分别对应于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的扩增引物分别对应于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，扩增过程中采用的扩增体系为：10×缓冲液1μL，dNTP混合物0.2μL，25mM的MgCl20.72μL，扩增引物组1μL，DNA聚合酶0.4μL，模板DNA1ng，灭菌水补足至10μL，其中，所述dNTP混合物中每种dNTP的浓度为10mM，所述扩增引物组中各条引物的浓度为50μM。在本发明的另一个具体实施方式中，其中2)还包括在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述16个基因座的基因型的步骤。在本发明的方案中，所述遗传分析仪可以是本领域技术人员常规使用的遗传分析仪，例如ABI3130或ABI3500型遗传分析仪，通过ID-X软件或其他GeneMapper软件等分析该PCR扩增产物中所述16个基因座的基因型。本发明一种对男性个体进行快速Y-STR分型的系统，所述系统包括DNA提取体系，复合检测体系，以及推断体系；所述DNA提取体系用于提取所述男性个体的DNA；所述复合检测体系用于获得所述DNA包括16个Y染色体STR基因座的基因型，所述STR基因座为DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439；获得所述16个基因座的分型结果的过程包括采用与所述16个基因座对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤，扩增过程中采用的热循环参数为：①95℃，4min；②28-30个循环，每个循环95℃5s，59℃30s，72℃10s；③72℃，7min；④25℃，保温；所述推断体系用于根据所述16个STR基因座的基因型获得所述男性个体Y-STR分型结果。进一步的，基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的扩增引物分别对应于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的扩增引物分别对应于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，扩增过程中采用的扩增体系为：10×缓冲液1μL，dNTP混合物0.2μL，25mM的MgCl20.72μL，扩增引物组1μL，DNA聚合酶0.4μL，模板DNA1ng，灭菌水补足至10μL，其中，所述dNTP混合物中每种dNTP的浓度为10mM，所述扩增引物组中各条引物的浓度为50μM。更进一步的，获得所述16个基因座的分型结果的过程包括中还包括在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述16个基因座的基因型的步骤。本发明提供的一种复合检测体系，所述体系包括男性个体DNA，扩增引物，以及扩增体系；所述复合检测体系用于利用所述扩增引物和扩增体系扩增男性个体DNA的16个基因座获得扩增产物，并由所述扩增产物获得男性个体的DNA的16个基因座的基因型；所述16个基因座为DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439；所述扩增引物由与所述16个基因座对应的扩增引物组成，其中基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的扩增引物分别对应于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的扩增引物分别对应于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列；所述扩增体系为：10×缓冲液1μL，dNTP混合物0.2μL，25mM的MgCl20.72μL，扩增引物组1μL，DNA聚合酶0.4μL，模板DNA1ng，灭菌水补足至10μL，其中，所述dNTP混合物中每种dNTP的浓度为10mM，所述扩增引物组中各条引物的浓度为50μM；扩增过程的热循环参数为：①95℃，4min；②28-30个循环，每个循环95℃5s，59℃30s，72℃10s；③72℃，7min；④25℃，保温。在本发明的方案中，所述DNA聚合酶可以是FastStartDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、HotstartDNA聚合酶中的一种或多种。本发明还提供了一种快速检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。在本发明的方案中，本发明利用所述复合检测体系进行16个基因座的分型的方法，包括：1)将提取的男性个体DNA作为模板；2)使用所述扩增引物利用上述扩增体系，在所述热循环参数下对作为模板的男性个体DNA进行多重PCR扩增反应以得到扩增产物；3)将所述扩增产物利用遗传分析仪进行分析，以获得16个基因座的分型结果。在本发明的方案中，所述16个基因座信息如表1所示：表1基因座重复序列荧光标记物DYS458GAAA6-FAMDYS390TCTR6-FAMDYS438TTTTC6-FAMDYS392TAT6-FAMDYS393AGATHEXDYS437TCTRHEXDYS385a/bGAAAHEXGATA_H4TAGAHEXDYS391TCTATAMRADYS447TAATATAMRADYS19TAGATAMRADYS448AGAGATTAMRADYS456AGATROXDYS635TSTAROXDYS439AGATROX本发明提供的优选扩增引物序列如下。16个基因座对应的扩增引物如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；表2基因座名称长度引物序列(5’-3’)序号DYS458PCRU25GGGTGGTGGAGGTTACTGSEQIDNo.1PCRL25CCCAAAGTTCTGGCATTASEQIDNo.2DYS390PCRU25CATTTTGGTACCCCATAATASEQIDNo.3PCRL25CTCAGAAACAAGGAAAGATASEQIDNo.4DYS438PCRU25GTTGAACGGTAAACAGTASEQIDNo.5PCRL25GAAACTCCATTTCAAATASEQIDNo.6DYS392PCRU25AAAGCCAAGAAGGAAAACAASEQIDNo.7PCRL25GAGGGATCATTAAACCTACCAASEQIDNo.8DYS393PCRU22GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATACSEQIDNo.9PCRL25CTCAAGTCCCAAAAATGAGGSEQIDNo.10DYS437PCRU25TGAGTAGCTGGGACTATGSEQIDNo.11PCRL25GATAGATAACCACAGATAAATASEQIDNo.12DYS385a/bPCRU23GGAAGGAAGGAAGGAAGGSEQIDNo.13PCRL25GGAAGGAAGGAAGGAAGGSEQIDNo.14GATA_H4PCRU21GAGACCTAAGCAGAGATGTTGGTTTTCSEQIDNo.15PCRL25CCTCTGATGGTGAAGTAATGGAATTAGASEQIDNo.16DYS391PCRU20CTATTCATTCAATCATACACCCATSEQIDNo.17PCRL25AGGTAGGCAGGCAGATAGGCSEQIDNo.18DYS447PCRU25AGCATGGCTTGGTTTTATSEQIDNo.19PCRL21TCTGCCTTTCTGGACAGASEQIDNo.20DYS19PCRU25CTACTGAGTTTCTGTTATAGTSEQIDNo.21PCRL22ATGGCCATGTAGTGAGGACASEQIDNo.22DYS448PCRU21TGTCAAAGAGCTTCAATGSEQIDNo.23PCRL25TTTCCTCATATTTCTGGCSEQIDNo.24DYS456PCRU22TTGTGGGACCTTGTGATAATSEQIDNo.25PCRL25AGAGGGACAGAACTAATGGASEQIDNo.26DYS635PCRU25AGTGTCTCACTTCAAGCACCAAGCACSEQIDNo.27PCRL25GCAGCAAAATTCACAGTTGGAAAAATGTSEQIDNo.28DYS439PCRU21GGTTTTCTTCTCGAGTTGTTSEQIDNo.29PCRL19CTGGCTTGGAATTCTTTTACSEQIDNo.30本发明方案具有以下的优点：1、本发明提供的方法和系统，能对快速获得男性个体Y染色体STR分型结果，进而实现对该男性个体的父系亲属鉴定。在本发明方案中优化了获得男性个体DNA扩增体系，使得可在1小时左右完成PCR扩增，与3小时左右的常规检测系统相比，显著缩短了PCR时间，从而使得对男性个体Y染色体STR分型的检测过程时间大大缩短。2、虽然本发明方法和系统扩增时间由以前的三小时缩短到了1小时左右，但分型结果依然非常准确稳定。3、通过对猪、山羊、狗、大鼠、兔子、鱼、大肠杆菌的DNA检测，证明本发明方法具有良好的种属特异性。附图说明图1显示了未知男性个体1血样DNA的STR分型；图2显示了未知男性个体2血样DNA的STR分型；图3显示了采用本发明方法和系统得到的标准DNA9948(10ng)的16个基因座的分型图谱；图4显示了本发明系统的灵敏度检测统计结果；图5显示了本发明方法和系统的种属特异性检测结果；图6显示了采用本发明方法和系统得到的16个基因座的分型图谱；图7显示了采用DNATyperY21试剂盒得到的16个基因座的分型图谱。具体实施方式以下实施例中使用的男性个体血液样本100份，收集于公安部物证鉴定中心；猪、山羊、狗、大鼠、兔子、鱼、大肠杆菌的DNA各2份，由公安部物证鉴定中心提供。以下实施例中使用的方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂耗材和仪器如下表所示：FastStartDNA聚合酶Roche公司dNTP混合物Roche公司PCR缓冲液Roche公司DNA聚合酶(DNApolymerase)Roche公司9700型PCR扩增仪ABI公司3130xl型遗传分析仪ABI公司QIAampDNABloodMidi试剂盒QIAGEN公司NanoDrop2000cSpectrophotometerThermo公司实施例1、对本发明的对快速获得男性个体Y染色体STR分型的方法和系统准确性的验证在本实施例中，使用男性个体血液样本100份，这些检材为申请人从公安部物证鉴定中心收集的样本，已知其个体来源，但在本申请实施例1的实施过程中设定其个体来源未知，采用本申请方法和系统对其Y染色体STR分型，包括：1)利用本发明的系统中的DNA提取体系提取男性个体的DNA，2)利用本发明的系统中的复合检测体系获得所述DNA16个Y染色体STR基因座的分型结果,所述STR基因座为DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439，3)根据所述16个STR基因座的基因型获得所述男性个体Y-STR分型结果。本实施例中，所述复合检测体系包括检材DNA，扩增引物，以及扩增体系，所述复合检测体系用于利用所述扩增引物和扩增体系扩增男性个体的DNA的16个基因座获得扩增产物，并由所述扩增产物获得男性个体的DNA的16个基因座的基因型；所述16个基因座为DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439；所述扩增引物由与所述16个基因座对应的扩增引物组成，其中基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的扩增引物分别对应于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的扩增引物分别对应于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列；所述扩增体系为：10×缓冲液1μL，dNTP混合物0.2μL，25mM的MgCl20.72μL，扩增引物组1μL，DNA聚合酶0.4μL，模板DNA1ng，灭菌水补足至10μL，其中，所述dNTP混合物中每种dNTP的浓度为10mM，所述扩增引物组中各条引物的浓度为50μM；扩增过程的热循环参数为：①95℃，4min；②28-30个循环，每个循环95℃5s，59℃30s，72℃10s；③72℃，7min；④25℃，保温。1、提取待检测的100样本的DNA作为模板采用QIAampDNABloodMidi试剂盒(QIAGEN公司，德国)分别提取上述100样本的DNA，使用NanoDrop2000cSpectrophotometer(Thermo公司，美国)进行定量。提取DNA步骤和定量步骤按照试剂盒说明书进行。2、利用所述复合检测体系进行16个基因座的分型，包括：将提取的男性个体DNA作为模板；使用所述扩增引物利用上述扩增体系在所述热循环参数下对提取的DNA模板进行多重PCR扩增反应，以获得扩增产物；将扩增产物利用遗传分析仪确定16个基因座的分型结果。具体过程如下：2.1、引物池配置扩增引物池的配置，其中所述扩增引物中为所述16个基因座对应的扩增引物，本实施例中，基因座DYS458、DYS390、DYS438、DYS392、DYS393和DYS437的扩增引物分别对应于SEQIDNo.1至SEQIDNo.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQIDNo.13至SEQIDNo.14的核苷酸序列；基因座GATA_H4、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448、DYS456、DYS635和DYS439的扩增引物分别对应于SEQIDNo.15至SEQIDNo.30的核苷酸序列；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成好的引物用1×TE缓冲液稀释到100μM，将16个基因座的上下游引物按照以下体积和浓度进行混合作为多重PCR引物池(即PrimerMix)。2.2、多重PCR反应本实施例使用9700型PCR扩增仪进行多重PCR反应。(1)配置PCRmix(10μL体系)试剂名称配置量(μL)10×PrimerMix1μLdNTPMix(10mMeach)0.2μL10×PCR缓冲液1μLMgCl2(25mM)0.72μLFast-StartDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL男性个体DNA模板(1ng/μL)1μL灭菌水补足至10μL(2)扩增程序2.3、PCR产物分型取1μLPCR产物与9.5μL甲酰胺、Typer500内标混匀，95℃3min后立即冰浴5min。对扩增产物采用ABI3130XL型遗传分析仪通过IDv3.2软件进行分析，获得所述16个基因座的基因型，100份DNA样品中扩增分型代表性结果如图1和图2所示，图1显示了未知男性个体1血样DNA的STR分型，图2显示了未知男性个体2血样DNA的STR分型。由图1-2可以看出，利用本发明提供的方法均可成功获得男性基因组DNA的准确分型，无位点等位基因丢失现象。2.4、为了验证分型结果的准确性，从100份DNA样品中随机抽取50份DNA样品，对16个基因座进行测序(北京迈奥德恩生物科技有限公司测序)，采用本实施例的复合检测体系获得的所有的分型结果与测序结果均一致，一致性达到100％，此结果证本发明复合检测体系分型结果的准确。3、根据所述男性个体16个基因座的基因型Y染色体STR分型。由本实施例方法获得的上述100份检材的父系亲属鉴定结果，与其已知的个体父系亲属鉴定结果一致，说明本发明方法可以进行男性个体的父系亲属鉴定。实施例2本发明对男性个体Y染色体STR分型的系统与现有Y染色体STR分型试剂盒的比较将实施例1的100份DNA样品用本申请的系统进行16个基因座的分型，同时采用现有Y染色体STR分型试剂盒DNATyperY21(即常规检测系统)对上述样品Y染色体基因座进行分型，如图6(采用本发明方法和系统得到的16个基因座的分型图谱)和图7(采用DNATyperY21试剂盒得到的16个基因座的分型图谱)所示。将本发明的系统，与现有Y染色体STR分型试剂盒(相比，在相同基因座上获得的DNA检测结果一致，检出率均达100％，结果见表3，各组实验重复结果按照同一基因座出现该峰2次以上的统计原则进行综合分析。分型效果分析指标采用“检出率”(有效分型次数/重复次数)、“等位基因丢失率”(等位基因丢失条带数/预计等位基因条带数)。结果表明本发明的系统具有较好的准确性和一致性，可以用于进行男性个体的父系亲属鉴定，并且本发明的系统可在1小时左右完成PCR扩增，与3小时左右的上述常规检测系统相比，显著缩短了PCR时间，大大提高了Y染色体STR分型的效率。表3100份血液样本的DNA检测结果实施例3本发明方法和系统结果的灵敏性分别取DNA标准品994810ng、5ng、2.5ng、1.25ng、625pg、313pg、157pg、78.5pg、39.3pg和19.7pg，按本发明提供的方法进行扩增并检测，平行重复3次，结果如图3-图4所示，其中图3显示了采用本发明方法和系统得到的标准DNA9948(10ng)的16个基因座的分型图谱，图4显示了本发明系统的灵敏度检测统计结果。由图4可以看出，本发明方法最佳DNA模板量在157pg～1.25ng之间，在78.5pg或以下的模板量时，虽然仍可得到完整STR分型但一些等位基因峰高低于50RFU；DNA模板量为39.3pg甚至更低可能出现等位基因丢失，无法得到完整的STR基因分型；DNA模板量在2.5ng及以上时，可以获到完整STR分型但一些等位基因峰高超过6000RFU，导致出现了峰渗透或拔起现象。实施例4本发明方法和系统结果的种属特异性分别取猪、山羊、狗、大鼠、兔子、鱼、大肠杆菌的DNA按实施例1方法进行扩增并分型，平行重复3次。结果如图5所示，图5显示了本发明方法和系统的种属特异性检测结果，可以看出，猪、山羊、狗、大鼠、兔子、鱼、大肠杆菌的种属特异性扩增检测中均未有任何扩增产物出现。因此，本申请的系统和方法具有良好的种属特异性。序列表<110>公安部物证鉴定中心<120>一种对男性个体进行快速Y-STR分型的方法和系统<130>165986GF<160>30<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gggtggtggaggttactg18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cccaaagttctggcatta18<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3cattttggtaccccataata20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ctcagaaacaaggaaagata20<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gttgaacggtaaacagta18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6gaaactccatttcaaata18<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7aaagccaagaaggaaaacaa20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8gagggatcattaaacctaccaa22<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9gtggtcttctacttgtgtcaatac24<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10ctcaagtcccaaaaatgagg20<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11tgagtagctgggactatg18<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12gatagataaccacagataaata22<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13ggaaggaaggaaggaagg18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14ggaaggaaggaaggaagg18<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15gagacctaagcagagatgttggttttc27<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16cctctgatggtgaagtaatggaattaga28<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17ctattcattcaatcatacacccat24<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18aggtaggcaggcagataggc20<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19agcatggcttggttttat18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20tctgcctttctggacaga18<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21ctactgagtttctgttatagt21<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22atggccatgtagtgaggaca20<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23tgtcaaagagcttcaatg18<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24tttcctcatatttctggc18<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25ttgtgggaccttgtgataat20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26agagggacagaactaatgga20<210>27<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27agtgtctcacttcaagcaccaagcac26<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>28gcagcaaaattcacagttggaaaaatgt28<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29ggttttcttctcgagttgtt20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30ctggcttggaattcttttac20当前第1页1 2 3