动物模型以及用于产生动物模型的方法

专利名称：：动物模型以及用于产生动物模型的方法
技术领域：
：本发明涉及用于遗传性常染色体显性疾病的动物模型。本发明的模型可用作人已知的遗传性常染色体显性疾病的模型。用于人疾病，特别是那些如常染色体显性疾病这类经长时间发展而在生命晚期发作的疾病的动物模型对于获取关于患这类疾病的个体疾病发作，发展和采用的治疗方案的信息是非常有用的。这里的动物模型是非人的类动物。在本发明的一个方面，用于遗传性常染色体显性疾病的非人的动物模型是表达至少一个与通过至少一个遗传定子获得的所述遗传性常染色体显性疾病相关的表型的非人动物模型。在本发明的另一个方面，用于遗传性常染色体显性疾病的非人的动物模型是表达至少一个与通过精子介导的基因转移获得的所述遗传性常染色体显性疾病相关的表型的非人动物模型。应当理解的是，该非人的动物模型是通过使用至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个遗传定子获得的。按这里的描述，不管给定常染色体显性疾病的遗传定子是DNA，RNA或蛋白质的形式，其可在一个动物模型中结合以获得常染色体显性疾病的强的表型。如在本文其他地方所描述的，常染色体显性疾病是那些通常通过非性染色体而从父母的一方遗传得到的疾病。常染色体显性疾病包括那些被称作蛋白质构象疾病的疾病，神经变性疾病例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)，阿尔茨海默病，帕金森氏病，与三核苷酸重复相关的疾病，例如亨廷顿舞蹈病，以及与软骨发育不良相关的疾病。蛋白质构象疾病是神经变性疾病中的一类，其中蛋白质发生折叠紊乱。特定蛋白质的蛋白质错折叠可在染病神经元组织中观察到。根据本发明，蛋白质构象疾病为ALS，阿尔茨海默病，帕金森氏病，与三核苷酸重复相关的疾病，以及亨廷顿舞蹈病。ALS在一种实施方式中，非人动物模型至少对一种与ALS相关的表型进行表达。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与ALS相关的表型进行表达的猪模型。“肌萎缩性侧索硬化(ALS)”在这里被用来表示任何神经变性疾病，其通常既攻击上运动神经元也攻击下运动神经元并导致大脑和脊髓的衰退。医生们对于ALS的治疗只有有限的选择。目前，是唯一经过FDA批准用于治疗ALS的药物。在临床试验中，在适当地延长患有ALS患者的存活时间上具有体现出轻微的有益疗效。肌萎缩性侧索硬化(ALS)是最为常见的运动神经变性疾病，其特征是在脊髓、脑干以及运动皮层中运动神经元的逐步丧失，从而引起虚弱、肌肉消瘦和局部麻痹，最终导致死亡。该疾病的症状包括虚弱、僵硬、异常反射、成束、痉挛以及萎缩。然而，特别在该疾病的早期阶段，由于所有的症状很少在该阶段表现出来，所以ALS很难被诊断[1]。通常第一症状就是在手、脚、胳膊或腿部出现无痛虚弱，这种症状出现在一半以上的病例中。其它的早期症状包括吞咽或行走困难。引起ALS的生物学机理也仅仅部分被揭晓。ALS的一个已知起因是特定的人基因SOD1基因的突变。该突变被认为会产生一种对运动神经细胞有毒的缺陷蛋白质。然而，SOD1突变只占到ALS病例的1％或2％，或家族(遗传)病例的20％。家族性ALS占到整个病例的5％～10％-剩余的病例好像是自发出现于原先健康的成人中。本发明涉及用于ALS的非人动物模型的产生。下表1中示出了在人体中与ALS相关的突变。根据本发明，在表1中所列出的任何突变以及已知的来自于人的取代均为本发明的实施方式。因此，为了形成用于ALS的非人动物模型以及尤其用于ALS的猪模型，人SOD1和/或人SOD1基因/cDNA，RNA和/或蛋白质或其部分的猪同系物的突变形式可包括任何所列出的突变。应当明白的是至少一种或多种突变可以被引入到人SOD1和/或人SOD1基因/cDNA，RNA和/或蛋白质或其部分的猪同系物中。可组合使用如何数目的所列出的突变。表1此外，在ALS2(Ala46delA和Leu623delCT)中的两种突变和在ALS4，SETX中的三种突变(Thr3Ile，Leu389Ser和Arg2136His)均与ALS有关。因此，在本发明的一方面中，由于引入了至少一种遗传定子，其中至少一种遗传定子为人SOD1基因，mRNA和/或蛋白质的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分(参见SEQIDNO1，SEQIDNO2)，表达了至少一种与ALS相关的表型的非人动物模型包括至少一种产生表1中所描述的酸性突变或上面所描述的ALS2的突变的突变(Ala46delA和Leu623delCT)以及在ALS4，SETX中的三种突变(Thr3Ile，Leu389Ser和Arg2136His)，所有的突变均与ALS相关。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子而导致表达至少一种与ALS相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为猪SOD1基因，mRNA和/或蛋白质(参见SEQIDNO3，SEQIDNO4或其片段或部分)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，包括至少一种突变，该突变会形成表1中所描述的酸性突变或上面所描述的ALS2的突变(Ala46delA和Leu623delCT)以及在ALS4，SETX，(Thr3Ile，Leu389Ser和Arg2136His)，所有的突变均与ALS相关。应当明白的是至少一种突变存在于基因片段或DNA片段、RNA片段或蛋白质部分中。尤其具有SEQIDNO5的突变的猪SOD1cDNA被用来产生用于ALS的猪模型。用于ALS的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述至少一种遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法而产生。在一种具体的实施方式中，用于ALS的非人动物模型通过精子介导的基因转移来生成。本发明公开了一种用于ALS的猪模型，其在一种实施方式中是将本文其它地方所描述的突变的猪SOD1(SEQIDNO5)通过精子介导的基因转移所生成。然而，用于ALS的猪模型还可通过向靶细胞中引入突变的猪SOD1(SEQIDNO5)或对其表达的蛋白质(SEQIDNO6)来生成。应当明白的是至少一种突变会在人SOD1中产生表1中所列出的SOD1的氨基酸突变或如上所描述的ALS2的突变(Ala46delA和Leu623delCT)以及在ALS4，SETX中的三种突变(Thr3Ile，Leu389Ser和Arg2136His)，所有的这些与ALS相关的突变均被包含在本发明的人或猪SOD1基因或DNA，RNA或蛋白质中，例如至少两种突变、至少三种突变、至少四种突变、至少五种突变、至少六种突变、至少七种突变、至少八种突变、至少十种突变、至少十五种突变会产生表1中的SOD1氨基酸突变或如上所述ALS2的突变(Ala46delA和Leu623delCT)以及在ALS4，SETX中的三种突变(Thr3Ile，Leu389Ser和Arg2136His)，所有的这些突变均与ALS相关。用于ALS的非人动物模型，尤其是用于ALS的猪模型通常会出现上面所描述症状例如虚弱，僵硬、异常反射、成束、痉挛以及萎缩中的至少一种。常见的第一症状就是在腿部出现无痛虚弱，该情况要超过所有情况的一半。其它的早期症状包括吞咽或行走障碍。此外，这里的实施例中所描述的活组织检查中所用到的组织病理学可用来诊断患ALS的动物模型。对运动神经元的分析观察到存在聚集体，或者甚至是运动神经元的丧失也是ALS的特征。阿尔茨海默病在本发明的另一方面，非人动物模型表达至少一种与阿尔茨海默病相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与阿尔茨海默病相关的表型进行表达的猪模型。“阿尔茨海默病”在这里被用来表示任何神经变性的脑疾病，其特征是逐步的记忆丧失以及在后期病例中出现严重的痴呆。阿尔茨海默病与脑组织中一定的异常相关，其涉及特定的蛋白质、β-淀粉样蛋白。记忆损伤是用来诊断该类型痴呆的必要特征。还必须出现下述方面中某一方面的改变语言、决策能力、判断、注意力以及其它方面的精神功能和性格。发展的速度依人而异。如果阿尔茨海默病发病很快，则有可能持续快速发展。如果其发病慢，则有可能持续慢速发展。存在两种类型的阿尔茨海默病-早发型和晚发型。在早发型的阿尔茨海默病中，症状第一次出现在60岁之前。早发型的阿尔茨海默病较不常见，仅占整个病例的5-10％。然而，其趋向于快速发展。早发型疾病出现在家族中且涉及常染色体显性，遗传突变可能是这类疾病的起因。目前，已经确认有三种类型的早发性基因。晚发型阿尔茨海默病是该疾病最为常见的形式，在60岁或更老的人群中发生并且不太可能出现在家族中。晚发型阿尔茨海默病可能会出现在某些家族中，但基因的作用是较不直接和较不确定的。这些基因不会引起疾病本身，但容易增加斑和缠结或其它的与阿尔茨海默病相关的病状在脑形成的可能性。阿尔茨海默病的起因还未被完全知晓但被认为同时包括基因和环境因素。对阿尔茨海默病的诊断是根据特征症状以及排除其它的痴呆起因。证实阿尔茨海默病病例的唯一方法是在死亡后对脑组织的样品进行显微检查。脑组织显示“神经原纤维缠结”(堵塞细胞的神经细胞内的蛋白质的缠结片段)、“神经炎斑”(死亡和频邻死亡神经细胞、其它的脑细胞和蛋白质的异常聚集)以及“老年斑”(死亡的神经细胞的产物累积在蛋白质周围的区域)。尽管这些改变在脑内均会随年龄在一定程度发生，但在患有阿尔茨海默病的人的脑内变化更大。神经细胞(神经元)的破坏导致神经递质(神经元为传递信息至另一个神经元所分泌的物质)的减少。神经递质的正确平衡对于脑来讲是至关重要的。通过引起脑发生结构和化学上的问题，阿尔茨海默病将正常情况下一起工作的脑区域给分离开来。下述的人基因与阿尔茨海默病相关早老素1(PSEN1，NM_000021)，早老素2(PSEN2，NM_000447)，淀粉样β-前体蛋白(APP，NM_000484)下述指出的取代被认为与用于阿尔茨海默病的转基因猪模型相关。表2在APP(NM_000484)中引起阿尔茨海默病的突变表3在PSEN2(NM_000447)中引起阿尔茨海默病的突变表4在PSEN1(NM_000021)中引起阿尔茨海默病的突变因此，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子，表达至少一种与阿尔茨海默病相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人PSEN1基因，mRNA和/或蛋白质(参见SEQIDNO7，SEQIDNO8)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，包括至少一种突变，该突变会形成表4中所描述的氨基酸突变。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与阿尔茨海默病相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为猪的PSEN1基因，mRNA和/或蛋白质(参见SEQIDNO9，SEQIDNO10)或各自的片段或部分)的基因活DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，包括至少一种突变，该突变会形成表4中所描述的氨基酸突变。应当理解，至少一个突变存在于基因片段或DNA片段、RNA片段或蛋白质部分。特别的，具有SEQIDNO11的突变的猪的PSEN1蛋白质被用来产生用于阿尔茨海默病的猪模型。用于ALS的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述至少一种遗传定子引入到靶细胞中产生，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法。在一个具体的实施方式中，用于阿尔茨海默病的非人动物模型通过精子介导的基因转移来形成。根据本发明，在一种实施方式中这里用于阿尔茨海默病的猪模型是通过本文其它地方所描述的突变猪的PSEN1的精子介导的基因转移所形成。然而，用于阿尔茨海默病的猪模型还可通过向靶细胞中引入突变的PSEN1或对其进行表达的蛋白质(SEQIDNO11)来形成。此外，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子所以表达至少一种与阿尔茨海默病相关的表型的非人动物模型，其中一种遗传定子为人PSEN2基因，mRNA和/或蛋白质(参见SEQIDNO12，SEQIDNO13)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，包括至少一种突变，该突变会形成表3中所描述的氨基酸突变。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子所以表达至少一种与阿尔茨海默病相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为猪PSEN2基因，mRNA和/或蛋白质(分别对应于SEQIDNO14，SEQIDNO15或其片段或部分)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其包含至少一种突变，该突变会形成表3中所描述的氨基酸突变。应当明白的是至少一种突变存在于基因片段或DNA片段、RNA片段或蛋白质部分中。特别的，具有SEQIDNO16的突变猪的PSEN2DNA被用来产生用于阿尔茨海默病的猪模型。用于ALS的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述至少一种遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法来形成。在一具体的实施方式中，用于阿尔茨海默病的非人动物模型通过精子介导的基因转移来形成。根据本发明，在一种实施方式中，这里用于阿尔茨海默病的猪模型是通过本文其它地方所描述的突变猪的PSEN1的精子介导的基因转移所形成。然而，用于阿尔茨海默病的猪模型还可通过向靶细胞中引入突变的PSEN1或对其进行表达的蛋白质(SEQIDNO16)来形成。此外，在另一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子所以表达了至少一种与阿尔茨海默病相关的表型的非人动物模型，其中一种遗传定子为人APP基因、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO17，SEQIDNO18)的基因或DNA或其片段和/或RNA或其片段和/或蛋白质或其部分，其包括至少一种突变，该突变会形成表2中所描述的氨基酸突变。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子所以表达了至少一种与阿尔茨海默病相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为对应于SEQIDNO19，SEQIDNO20或其片段或部分的猪APP基因，mRNA和/或蛋白质的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其包括至少一种突变，该突变会形成表2中所描述的氨基酸突变。应当明白的是至少一种突变存在于基因片段或cDNA片段、RNA片段或蛋白质部分中。特别地，突变猪APPDNA被用来生产用于阿尔茨海默病的猪模型。用于阿尔茨海默病的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述至少一种遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中而形成。在一个具体的实施方式中，用于阿尔茨海默病的非人动物模型通过精子介导的基因转移来形成。根据本发明，在一种实施方式中，这里用于阿尔茨海默病的猪模型是通过本文其它地方所描述的突变猪的APP的精子介导的基因转移所形成。然而，用于阿尔茨海默病的猪模型还可通过向靶细胞中引入突变的APP或对其进行表达的蛋白质(SEQIDNO21)来产生。在本发明的范围内，产生至少一种与表4，3和/或2中所列出的人PSEN1，PSEN2和/或APP同源的氨基酸突变包含在本发明的人或猪的PSEN1，PSEN2和/或APP基因中或DNA，RNA或蛋白质中，例如至少两种突变、至少三种突变、至少四种突变、至少五种突变、至少六种突变、至少七种突变、至少八种突变、至少十种突变、至少十五种突变，产生与表4，3和/或2中所列出的人PSEN1，PSEN2和/或APP同源的氨基酸突变。应当明白的是一种或多种基因及其突变可被组合在一种动物模型中，例如用于阿尔茨海默病的猪模型。用于阿尔茨海默病的非人模型，尤其是用于阿尔茨海默病的猪模型通常会形成至少一种上面所描述的症状例如逐步的记忆丧失以及在后期病例中出现的严重痴呆，其可通过行为研究来进行监控。还有证据表明嗅觉也会受到损害，这可通过行为改变来进行监控。此外，还可使用磁共振和/或正电子发射断层显像对动物模型的脑的扫描来确定动物模型是否患有阿尔茨海默病。帕金森氏病在本发明的一种实施方式中，非人动物模型表达至少一种与帕金森氏病相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与帕金森氏病相关的表型进行表达的猪模型。“帕金森氏病”在这里被用来表示与下列症状相关的遗传病-所有的这些症状都是由于产多巴胺的脑细胞的缺失所致胳膊、颚、腿以及脸部的震动或颤抖；肢体和躯干的僵硬或僵化；运动徐缓-运动变慢；姿势不稳定或受损害的平衡和协调。帕金森氏病(PD)是常见的渐进性神经变性疾病，感染60岁以上人口的1-2％。患PD的个体数目在那些平均年龄在60～65岁(1)之间开始发病且在70～79岁之间达到最大值。PD主要的临床症状是静止性颤抖、运动徐缓、僵硬以及姿势不稳定。PD的病态表现是由于黑质致密部内的多巴胺能神经元的变性以及在退化的神经元中出现所谓的lewy小体所导致。lewy小体是细胞质蛋白包涵体，主要构成是α-突触核蛋白质。lewy小体是用于PD的病态诊断必需，但其也可在其它的神经变性疾病中被观察到。多巴胺能神经元的退化导致多巴胺形成的减少，而缺少这种信号物质会导致运动徐缓以及僵硬。PD的病因大体上是未知的但其可能是由于基因和环境因素所致。受损的线粒体功能、通过泛素-蛋白酶体途径的蛋白质分选的改变以及易化的细胞凋亡可能全代表了与PD(2)发展相关的因素。可能的环境因素是暴露于杀虫剂和重金属(3)。PD的大多数病例是散发性的，但有5-10％的病例是由于基因突变所引起。已经确立了几种PD的转基因模型，包括线虫类(C.elegans)、果蝇、小鼠和大鼠以及与基因相关的不同PD。已经发现了小鼠模型存在的几种限制，包括在某些模型中不会出现黑质纹状体的多巴胺能神经元的缺失，这表明更好的动物模型对于研究PD病状中的因素和根本机理将更为有利。下述的基因与帕金森氏病相关α-突触核(SNCA，NM_000345)，泛素C-末端水解酶(UCHL1，NM_004181)，富含亮氨酸重复的激酶(LRRK2，NM_198578)。下述指出的取代被认为与用于帕金森氏病的转基因猪模型相关。表5在SNCA(NM_000345)中引起帕金森氏病的突变突变#突变1Ala30Pro2Glu46Lys3Ala53Thr表6在UCHL1(NM_004181)中引起帕金森氏病的突变突变#突变1Ser18Tyr2Ile93Met表7在LRRK2(NM_198578)中引起帕金森氏病的推断发病突变突变#突变1Arg793Met2Gln930Arg3Arg1067Gln4Ser1096Cys5Ser1228Thr6Ile1371Val7Arg1441His8Arg11514Gln9Met1869Thr10Arg1941His11Thr2356Ile12Gly2385Arg因此本发明的一个方面涉及一种由于引入了至少一种遗传定子所以表达至少一种与帕金森氏病相关的表型的非人类动物模型，，其中一种遗传定子为人SNCA基因，mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO22，SEQIDNO23)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段和/或蛋白质或其部分，包括至少一种突变，该突变会形成表5中所描述的氨基酸突变。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与帕金森氏病相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为猪SNCA基因，mRNA和/或蛋白质(分别对应于SEQIDNO24，SEQIDNO25或其片段或部分)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其包括至少一种突变，该突变会形成表5中所描述的氨基酸突变。应当明白的是至少一种突变存在于基因片段或DNA片段、RNA片段或蛋白质部分中。特别地，具有SEQIDNO26的突变的猪SNCAcDNA被用来产生用于帕金森氏病的猪模型。用于ALS的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述至少一种遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法来生成。在一个具体的实施方式中，用于帕金森氏病的非人动物模型通过精子介导的基因转移来形成。根据本发明，在一种实施方式中这里用于帕金森氏病的猪模型是通过本文其它地方所描述的突变猪的SNCA(SEQIDNO26)的精子介导的基因转移所形成。然而，用于帕金森氏病的猪模型还可通过向靶细胞中引入突变的SNCADNA(SEQIDNO26)或对其进行表达的蛋白质(SEQIDNO27)来产生。此外，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与帕金森氏病相关的表型的非人动物模型，其中一种遗传定子为人UCHL1基因，mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO28，SEQIDNO29)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其包括至少一种突变，该突变会形成表6中所描述的氨基酸突变。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与帕金森氏病相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为猪UCHL1基因，mRNA和/或蛋白质或其片段或部分的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其包括至少一种突变，该突变会形成表6中所描述的氨基酸突变。应当明白的是至少一种突变存在于基因片段或DNA片段、RNA片段或蛋白质部分中。特别地，突变猪UCHL1DNA被用来生产用于帕金森氏病的猪模型。用于帕金森氏病的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述至少一种遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中来产生。在一个具体的实施方式中，用于帕金森氏病的非人动物模型通过精子介导的基因转移来产生。根据本发明，在一种实施方式中这里用于帕金森氏病的猪模型是通过本文其它地方所描述的突变猪的UCHL1的精子介导的基因转移所形成。然而，用于帕金森氏病的猪模型还可通过向靶细胞中引入突变的UCHL1或对其进行表达的蛋白质(SEQIDNO16)来产生。此外，在另一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达了至少一种与帕金森氏病相关的表型的非人动物模型，其中一种遗传定子为人LRRK2基因，mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO30，SEQIDNO31)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其包括至少一种突变，该突变会形成表7中所描述的氨基酸突变。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与帕金森氏病相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为猪LRRK2基因，mRNA和/或蛋白质或其各自的片段或部分的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其包括至少一种突变，该突变会形成表7中所描述的氨基酸突变。应当明白的是至少一种突变存在于基因片段或DNA片段、RNA片段或蛋白质部分中。特别地，突变猪LRRK2DNA被用来生产用于帕金森氏病的猪模型。用于帕金森氏病的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述至少一种遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中而产生。在一个具体的实施方式中，用于帕金森氏病的非人动物模型通过精子介导的基因转移来产生。根据本发明，在一种实施方式中这里用于帕金森氏病的猪模型是通过本文其它地方所描述的突变猪的LRRK2的精子介导的基因转移所形成。然而，用于帕金森氏病的猪模型还可通过向靶细胞中引入突变的LRRK2或对其进行表达的蛋白质来产生。在本发明的范围内，产生至少一种与表5，6和/或7中所列出的人SNCA，UCHL1和/或LRRK2同源的氨基酸突变的突变是被包含在本发明的人或猪的SNCA，UCHL1和/或LRRK2基因中或DNA，RNA或蛋白质中，例如至少两种突变、至少三种突变、至少四种突变、至少五种突变、至少六种突变、至少七种突变、至少八种突变、至少十种突变、至少十五种突变产生与表5，6和/或7中所列出的人SNCA，UCHL1和/或LRRK2同源的氨基酸突变。应当明白的是一种或多种基因及其突变可被组合在一种动物模型中，例如用于帕金森氏病的猪模型。用于帕金森氏病的非人动物模型，尤其是用于帕金森氏病的猪模型通常会出现至少一种上面所描述的症状-所有的这些症状都是由于产多巴胺的脑细胞的缺失所致颚、腿以及脸部的震动或颤抖；肢体和躯干的僵硬或僵化；运动徐缓-运动变慢；姿势不稳定或受损害的平衡和协调。三核苷酸重复(TNR)疾病在本发明的一种实施方式中，非人动物模型表达了至少一种与三核苷酸重复(TNR)疾病疾病相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与三核苷酸重复(TNR)疾病疾病相关的表型进行了表达的猪模型。三核苷酸重复(TNR)疾病或扩张疾病是由于在含有重复多次的相同三核苷酸的基因中的DNA连续序列所致。不稳定的微卫星重复在所有的基因组序列中均有发现且TNRs构成了这种不稳定重复的亚群。核苷酸重复的不稳定性与人的超过40种遗传性神经变性的，神经肌肉的，以及智力迟钝的疾病有关[2，3]。核苷酸重复的不稳定性过程是一个动态过程，其中突变在减数分裂期间以及在有丝分裂的组织内持续复发[3]。长的重复连续片段比短的重复连续片段更易扩张且长度与发病的年龄和疾病的严重性有关，这一现象被称之为早现遗传(anticipitation)[3]。由三核苷酸重复(TNR)的不稳定导致的疾病可分为两组。在第一组中，TNRs存在于染病基因的未翻译的部分。这种未翻译的TNR扩张，构成CTGs，CAGs，GAAs，或CGGs，导致了RNA功能获得，其可改变患病基因的基因表达调控或对在染色质水平的剪接和基因调控产生顺式或反式影响[4-7]。扩展的非编码TNRs已被识别为导致包括Friedreich共济失调，脊髓小脑型共济失调8(SCA-8)，SCA-12，强直性肌营养不良，和脆性X综合症的疾病的致病突变。在第二组中，TNRs位于转录物的编码区域。这种类型的TNRs在编码区框架内被翻译，且扩展包括编码聚-天冬酰胺的GAC，编码聚-丙胺酸的GCG，以及最常见的被确认为编码聚-谷酰胺的CAGTNRs[3]。扩展的CAGTNRs被认为是导致包括SCA-1，SCA-2，SCA-3，SCA-6，SCA-7，SCA17，亨廷顿氏症，脊髓延髓肌肉萎缩症(SBMA)，以及齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(DRPLA)在内的疾病的致病突变。在这些疾病中，由于转录调节蛋白的猝灭，细胞骨架和小泡的功能以及细胞基因表达的调节受到影响。对造成TNR不稳定的分子机制还不完全清楚。组织特异性的和遗传性的TNR不稳定的程度是通过在染病基因内的特异性顺式序列以及反式功能代谢蛋白质如DNA修复蛋白来决定的[3]。TNR不稳定可能牵涉在DNA复制，修复和重组期间形成特定的DNA结构[8]。在DNA复制中的滑移是得到最佳表征的机制。通过TNR束指导DNA进行复制也对稳定性产生影响[9-11]。除了TNR自身外，重复的序列环境也对不稳定的机制构成贡献，例如类似的CAGR束的长度显示出基于基因组环境的不同的稳定性[3，12]。在人群中，TNR重复束的长度是多态但稳定传输的[13]。超出一定的TNR长度(这似乎是基因特异的)，则TNR束就变得不稳定[3]。尚未扩展到完全的疾病表型所需尺寸的不稳定的TNR束称作前突变[2]。然而，在如FMR1中的前突变尺寸的TNR扩展已显示出导致晚期发作的特定疾病表型。TNRs的遗传不稳定性与重复束的长度有关，且扩展的束比原始的束具有增加的受到后续扩展突变的影响[2，3，14]。TNR中断，例如在CAGTNRs中的CAA三联密码也对赋予TNR稳定性扮演着重要的作用，而缺少它们则会使等位基因倾向于不稳定和引起病态扩展[15]。对前突变和完全扩展的TNR束，可观察到较大程度的体细胞的和传递不稳定性[2，3]。完全扩展的和引起疾病的TNR束可由约20个如在SCA-6中观察到的TNRs到如在强直性肌营养不良中观察到的几千个TNRs组成[2，3]。有趣的是，最近研究表明诱导水平的转录可促使人体细胞内的TNR束的减少[16]。此外，TNR不稳定的转基因动物模型还指出对特定的TNR两翼序列对于产生TNR不稳定性的重要性[9，17，18]。本发明的一种实施方式涉及人动物模型，其表达至少一种与强直性肌营养不良相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与强直性肌营养不良相关的表型进行表达的猪模型。强直性肌营养不良是由在人强直性肌营养不良蛋白质激酶基因，DMPK的3′-UTR中的TNR所引起[19-23]。该TNR的正常大小是在5～37。从高于50到几千CTG重复的扩张会导致强直性肌营养不良。因此本发明的一个方面是涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与强直性肌营养不良相关的表型的非人动物模型，其中一种遗传定子为人强直性肌营养不良蛋白质激酶基因、DMPK基因、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO32，SEQIDNO33)中的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CTG的重复数目至少为40，45，50或至少60。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达了至少一种与强直性肌营养不良相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为人DMPK基因的猪同系物，mRNA和/或蛋白质或其各自的片段或部分的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中DNA中的CTG的重复数目至少为40，45，50或至少60。用于强直性肌营养不良的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法来产生。在具体的实施方式中，用于强直性肌营养不良的非人动物模型通过精子介导的基因转移来产生。根据本发明，在一种实施方式中，强直性肌营养不良的猪模型是通过人或猪的DMPK基因、mRNA和/或蛋白质的精子介导的基因转移产生，其中在DNA中CTG的重复数目至少为40，45，50或至少60。然而，用于强直性肌营养不良的猪模型还可通过向靶细胞引入人或猪的DMPK基因、mRNA和/或蛋白质或其表达的蛋白质来产生，其中在DNA中CTG的重复数目至少为40，45，50或至少60。用于强直性肌营养不良的非人动物模型，尤其是用于强直性肌营养不良的猪模型通常会产生至少一种症状如全身性虚弱和影响面部和颈部的肌肉消瘦；从脚延伸到腿部、肩部和臀部伸缩困难。其它的症状包括肌肉消瘦(肌肉营养不良)、眼晶状体的不透明(白内障)、心脏传导缺陷以及肌强直(难以进行肌肉放松)。脆性X综合症本发明的一种实施方式涉及人动物模型，其表达至少一种与脆性X综合症相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与脆性X综合症相关的表型进行表达的猪模型。脆性X综合症是由在人FMR1基因的启动子区域内的重复所致，一般存在的是6-52个CGG重复[24，25]。在55-200重复范围内的扩展导致前突变，而在200-几千重复范围内的全突变导致脆性X综合症。脆性X综合症也可由在人FMR2基因5′末端的TNR内的CCG重复所致，其中重复数在6-35之间变化[26]。含有61～200重复的扩展导致前突变并且超过200重复单元的扩展导致完全突变和脆性X综合症。因此本发明的一个方面是涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达了至少一种与脆性X综合症相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人FMR1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO34，SEQIDNO35)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CGG的重复数目至少为55，60，70或至少200，和/或人FMR2基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO36，SEQIDNO37)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CGG的重复数目至少为61，65，70，80或至少200。类似地，在涉及非人动物模型的实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达了至少一种与脆性X综合症相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人FMR1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CGG的重复数目至少为55，60，70或至少200，和/或人FMR2基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CGG的重复数目至少为61，65，70，80或至少200。用于脆性X综合症的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述至少一种遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中而产生。在一个具体的实施方式中，用于脆性X综合症的非人动物模型通过精子介导的基因转移来产生。根据本发明，在一种实施方式中，脆性X综合症的猪模型是通过人FMR1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质、片段或部分片段的人或猪同系物的精子介导的基因转移产生，其中CGG的重复数目至少为55，60，70或至少200，和/或通过人FMR2基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质、片段或部分片段的人或猪同系物的精子介导的基因转移产生，其中CGG的重复数目至少为61，65，70，80或至少200。然而，用于脆性X综合症的猪模型还可通过引入人或猪的FMR1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质、片段或部分片段来产生，其中CGG的重复数目至少为55，60，70或至少200，和/或向靶细胞引入人或猪的FMR2基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质、片段或部分片段或其表达的蛋白质来产生，其中CGG的重复数目至少为61，65，70，80或至少200。用于脆性X综合症的非人动物模型，尤其是用于脆性X综合症的猪模型通常会形成至少一种与孤独症相关的症状。孤独症的非限制性例子例如重复性的行为以及在弱的社交能力。脊髓小脑型共济失调本发明的一种实施方式涉及人动物模型，其表达了至少一种与脊髓小脑型共济失调相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与脊髓小脑型共济失调相关的表型进行了表达的猪模型。脊髓小脑型共济失调(SCA12)是由于人PPP2R2B基因的5′-UTR内的重复所引起的并且CAG的重复数目是在7～28内变化且TNRs的扩展是65～68。脊髓小脑型共济失调(SCA1)是由于ATX1蛋白质内的CAG重复所引起。人SCA1TNR区域的特征是存在12个CAG重复后面紧接2个CAT重复，其两侧带有一个CAG三联体[28]。易于扩展的CAGTNR通常是由6～39个重复组成并且扩展物由41～81个重复组成。脊髓小脑型共济失调(SCA2)是由于影响ATX2蛋白质的TNR扩展所引起。该TNR通常含有15～30个CAG重复并且扩展形式的范围在35～59三联体[29]。脊髓小脑型共济失调(SCA3)由人共济失调蛋白(ataxin)-3基因内的CAGTNR扩展所引起，其中存在超过54个重复导致共济失调而CAG重复的正常数目是在12～36范围内变化[30-32]。脊髓小脑型共济失调(SCA6)是由于在导致共济失调的CACNA1A电压依赖性钙通道内的TNR扩展所引起[33]。TNRs的正常数目是在4～18且21～27的TNRs扩展数目是疾病起因。脊髓小脑型共济失调(SCA7)是由共济失调蛋白-7蛋白质的N-末端内的人SCA7的TNR所引起，其通常含有7～35个CAG重复[34]。引起疾病的扩展范围为37～200个重复。脊髓小脑型共济失调(SCA17)是由在TATA盒结合蛋白(TBP)基因内的CAG扩展所引起并且会形成导致共济失调的SCA17表型[35]。人TNR区域是由两组被多重CAA和CAG三联体分隔的CAG重复所组成。扩展通常是从两个CAG组的较大开始。编码的多谷氨酰胺的正常串是在29～42内变化，而在SCA17患者中已证实发现在47～55变化的多谷氨酰胺的串。因此本发明的一个方面是涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与脊髓小脑型共济失调相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人PPP2R2B基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO38，SEQIDNO39)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为65，70或至少75，和/或人ATX1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO40，SEQIDNO41)，其中12CAG的重复数目至少为41，45，50，60，70或至少80，12CAG后面紧接2个CAT重复，其边侧带有一个CAG三联体。至少一种遗传定子为人ATX2基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO42，SEQIDNO43)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为35，40，45，50或至少55，和/或至少一种遗传定子为人共济失调蛋白-3基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO44，SEQIDNO45)的基因或DNA或其片段和/或RNA或其片段和/或蛋白质或部分的，其中CAG的重复数目至少为54，和/或至少一种遗传定子为人CACNA1A基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO46，SEQIDNO47)的基因或DNA或其片段和/或RNA或其片段和/或蛋白质或部分的，其中TNR扩张的数目至少为21，22，23，24，25，26或至少27或在范围21～27个重复；和/或至少一种遗传定子为编码人共济失调蛋白-7蛋白质N-末端的基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO48，SEQIDNO49)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG扩展的数目至少为37，45，55，65或至少100；和/或至少一种遗传定子为人TATA盒结合蛋白(TBP)基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的基因或DNA或其片段和/或RNA或其片段和/或蛋白质或部分，其中如上所定义的多谷氨酰胺串数目的范围是从47～55个重复。类似地，在涉及非人动物模型的实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与脊髓小脑型共济失调相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人PPP2R2B基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为65，70或至少75，和/或人ATX1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中12CAG的重复数目至少为41，45，50，60，70或至少80，12CAG后面紧接2个CAT重复，其边侧带有一个CAG三联体。至少一种遗传定子为人ATX2基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的猪同系物基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为35，40，45，50或至少55，和/或至少一种遗传定子为人共济失调蛋白-3基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的基因或DNA或其片段和/或RNA或其片段和/或蛋白质或部分，其中CAG的重复数目至少为54，和/或至少一种遗传定子为人CACNA1A基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的基因或DNA或其片段和/或RNA或其片段和/或蛋白质或部分，其中TNR扩张数目至少为21，22，23，24，25，26或至少27或在21～27范围内的重复；和/或至少一种遗传定子为编码人共济失调蛋白-7蛋白质N-末端的基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的基因或DNA或其片段和/或RNA或其片段和/或蛋白质或部分，其中CAG扩展的数目至少为37，45，55，65或至少100；和/或至少一种遗传定子为人TATA盒结合蛋白(TBP)基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的基因或DNA或其片段和/或RNA或其片段和/或蛋白质或部分，其中如上所定义的多谷氨酰胺串数目的范围是从47～55个重复。用于脊髓小脑型共济失调的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法来产生。在一个具体的实施方式中，用于脊髓小脑型共济失调的非人动物模型通过精子介导的基因转移来产生。根据本发明，在一种实施方式中，脊髓小脑型共济失调的猪模型是通过人PPP2R2B基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的精子介导的基因转移产生，其中CAG的重复数目至少为65，70或至少75，和/或人的猪同系物或人ATX1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质，其中12CAG的重复数目至少为41，45，50，60，70或至少80，12CAG后面紧接2个CAT重复，其边侧带有一个CAG三联体，和/或人ATX2基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪的同系物，其中CAG的重复数目至少为35，40，45，50或至少55，和/或人共济失调蛋白-3基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪的同系物，其中CAG的重复数目至少为54，和/或人或人CACNA1A基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪的同系物，其中TNR扩展的数目至少为21，22，23，24，25，26或至少27，或在范围为21～27的重复范围内；和/或编码人共济失调蛋白-7蛋白质N-末端的基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪的同系物，其中CAG扩展的数目至少为37，45，55，65或至少100；和/或人TATA盒结合蛋白(TBP)基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪的同系物，其中如上所定义的多谷氨酰胺串的数目范围是从47～55个重复。然而，脊髓小脑型共济失调的猪模型还可通过引入任何组合形式的PPP2R2B，ATX1，ATX2，共济失调蛋白-3，CACNA1A，共济失调蛋白-7和/或TATA盒结合蛋白(TBP)的人或猪同系物来产生。用于脊髓小脑型共济失调的非人动物模型，尤其是用于脊髓小脑型共济失调的猪模型通常会形成至少一种下列症状如小脑的萎缩，这可通过核磁共振成像观察，和/或差的运动协调性。齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩萎缩症(DRPLA)本发明的一种实施方式涉及非人动物模型，其表达至少一种与DRPLA相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与DRPLA相关的表型进行表达的猪模型。在导致齿状核红核苍白球路易体萎缩症的人萎缩蛋白-1基因内中的CAG扩展导致了DRPLA[36]。重复性的CAG重复的正常重复范围是从3～25，而在有DRPLA等位基因的的患者中数目已扩展到49～88个重复。最常见的天然的人等位基因编码17个多谷氨酰胺的串。本发明的一个方面是涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与DRPLA相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人萎缩蛋白-1/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO52，SEQIDNO53)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为49，55，60，70或至少80。类似地，一个实施方式涉及，由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与DRPLA相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人萎缩蛋白-1/cDNA、mRNA和/或蛋白质的猪同系物的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为49，55，60，70或至少80。用于DRPLA的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法来产生。在具体的实施方式中，用于DRPLA的非人动物模型通过精子介导的基因转移来产生。根据本发明，在一种实施方式中，DRPLA的猪模型是通过人萎缩蛋白-1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质、片段或部分片段的人或猪同系物的精子介导的基因转移产生，其中CAG的重复数目至少为49，55，60，70或至少80。然而，DRPLA的猪模型还可通过向靶细胞引入人萎缩蛋白-1基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质、片段或部分片段的人或猪同系物或表达的蛋白质而产生，其中CAG的重复数目至少为49，55，60，70或至少80。用于DRPLA的非人动物模型，尤其是用于ALS的猪模型通常会产生至少一种症状例如癫痫发作、肌阵挛、共济失调和痴呆。脊髓延髓肌肉萎缩(SBMA)本发明的一种实施方式涉及一种人动物模型，其表达至少一种与SBMA相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与SBMA相关的表型进行了表达的猪模型。SBMA是由导致脊髓延髓肌肉萎缩症(Kennedy病)的X-染色体上的雄激素受体(AR)基因的外显子1内的CAG重复扩展所引起[37]。人CAGTNR的正常长度是在11～33个CAG拷贝数，而在患病的个体内扩展的范围从38～62。本发明的一个方面是涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与SBMA相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人AR基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO54，SEQIDNO55)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为38，45，50，55或至少60或在38～62的重复范围内。类似地，一种实施方式涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与SBMA相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人AR/cDNA、mRNA和/或蛋白质的猪同系物的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为38，45，50，55或至少60或在38～62的重复范围内。用于SBMA的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法来产生。在一个具体的实施方式中，用于SBMA的非人动物模型通过精子介导的基因转移来产生。根据本发明，在一种实施方式中，SBMA的猪模型是通过人AR基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的精子介导的基因转移产生，其中CAG的重复数目至少为38，45，50，55或至少60或在38～62的重复范围内。然而，SBMA的猪模型还可通过向靶细胞引入人AR基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物而产生，其中CAG的重复数目至少为38，45，50，55或至少60或在38～62的重复范围内用于SBMA的非人动物模型，尤其是用于SBMA的猪模型通常会形成至少一种下列症状不可控的颤搐(肌束抽搐)后出现虚弱和肌肉消瘦，这在15岁后有时会变得明显。脸部、嘴唇、舌头、嘴、喉咙、声带、躯干以及四肢的肌肉也会受到影响。亨廷顿氏症(HD)本发明的一种实施方式涉及一种非人动物模型，其表达至少一种与HD相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与HD相关的表型进行表达的猪模型。“亨廷顿氏症”(也称为亨廷顿舞蹈症)在这里用来表示任何具有异常和/或不可控制的身体运动、精神和心理问题以及丧失思考能力(认识力)特征的遗传性症状。发作于成人的亨廷顿氏症，是该疾病最常见的形式，通常在中年时期发作。征兆和症状包括易激动、压抑、小的不随意运动、协调性差以及难学习新的知识或作决定。当疾病发展后，无意识的痉挛运动(舞蹈症)变得更为显著。得病的个体存在行走、说话和吞咽的困难。患病的人通常还出现个性的改变以及在思考和推理能力上的下降。患有这种亨廷顿氏症形式的个体一般在发作后生存约15～25年。亨廷顿氏症还存在早期发作的形式，其开始于孩童时期或青少年时期。该疾病的一些临床特征不同于那些成人期发作的形式。征兆和症状包括迟钝、笨拙、僵硬、发育重要特征的丧失(例如运动技巧)、说话慢以及流口水。颠痫在这种情况的个体中出现的几率为30％～50％。早期发作的亨廷顿氏症的过程可能短于成年期发作的亨廷顿氏症；染病的个体在发作后通常生存10～15年。人的亨廷顿氏症与亨廷顿基因(HD基因，登记号NM002111)有关系。对应的蛋白质的功能还不清楚，但有可能在神经细胞中扮演重要的作用。在亨廷顿氏症中引起突变的疾病是CAG重复，长达超过35CAG单元的长度。重复的数目可在一定的程度上与该疾病发作相关。扩张的重复导致形成亨廷顿蛋白质，其含有长串的氨基酸谷酰胺。该长的蛋白质中断了脑一定部位内的神经细胞的正常功能，并最终导致了这些细胞的死亡。神经细胞的机能障碍和丢失引起了亨廷顿氏症的征兆和症状。因此，本发明的一个方面是涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与HD相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人亨廷顿基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO56，SEQIDNO57)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为35，45，50，55或至少60。类似地，一种实施方式涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达了至少一种与HD相关的表型的非人动物模型，其中至少一种遗传定子为人亨廷顿基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的猪同系物的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其中CAG的重复数目至少为35，45，50，55或至少60。用于HD的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法来产生。在具体的实施方式中，用于HD的非人动物模型通过精子介导的基因转移来形成。根据本发明，在一种实施方式中，HD的猪模型是通过人亨廷顿基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物的精子介导的基因转移产生，其中CAG的重复数目至少为35，45，50，55或至少60。然而，HD的猪模型还可通过向靶细胞引入人亨廷顿基因/cDNA、mRNA和/或蛋白质的人或猪同系物而产生，其中CAG的重复数目至少为35，45，50，55或至少60。用于HID的非人动物模型，尤其是用于HD的猪模型通常会形成上面所描述症状例如迟钝、笨拙、僵硬、发育重要特征的丧失(例如运动技巧)、说话慢以及流口水或颠痫。软骨发育不良(X型胶原)在本发明的以一种实施方式中，非人动物模型表达至少一种与软骨发育不良相关的表型。在一具体的方面，非人动物模型是至少对一种与软骨发育不良相关的表型进行表达的猪模型。软骨发育不良是影响骨骼的一组疾病且常常与含有至少19个不同类型胶原的胶原超家族的蛋白质相关，这些胶原是整个哺乳动物中涉及钙化和骨化过程的软骨的主要成份。三分之一的胶原(I，II，III，V和IX型)是纤维胶原，这是因为它们的组织形态为长而高度组织化的纤维。剩余的三分之二胶原为非纤维的并可进一步分成两组与中断的螺旋线相关的原纤维和形成网络状的胶原[39]。X胶原属于形成网络状的胶原并被报道主要被表达在生长板软骨的肥大性区域[40]，且在关节软骨的钙化区域很少被发现[41]。X型胶原已被表明在细胞外基质中起着结构上的重要性，其对软骨内骨化提供必要的分子环境[40]。此外，已表明X型胶原存在于猪骨软骨炎和骨关节炎的关节软骨中并且也可以为修复软骨碎裂的细胞群的产物[41]。然而，在骨软骨病中，尽管生长板内X胶原的水平未改变以及在关节软骨中所述胶原增加，软骨内成骨仍受到削弱。这表明单独的X型胶原不会引起软骨的骨化[41]。此外，前面已表明，在自然形成的猪模型中，猪X胶原的非胶原域1(NC1)内的突变会引起类似于人侏儒症的Schmid干骺端软骨发育不良(SCMD)的表型[42]。所述软骨病是一种常染色体的显性疾病，其特征为矮的身高、髋内翻以及蹒跚步态且组织病理学的检查显示在长骨中生长板的极度不规则组织状态[43，44]。转基因动物作为模型生物在基础研究以及应用科学领域中成为重要的工具并且其已被使用了几年来进行例如基因功能和人疾病的研究。就转基因而言，X胶原在转基因表达的检测中提供了独特的机会，这是因为X胶原几乎是选择性地在软骨细胞中表达的，这使得在其它的组织中对转基因表达的检测简单化从而容易归因于转基因方案上。因此本发明的一个方面是涉及一种由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与软骨发育不良相关的表型的非人动物模型，其中一种遗传定子为人COL10A1基因、mRNA和/或蛋白质(SEQIDNO58，SEQIDNO59)的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，其至少以一种短暂的方式存在。类似地，在一种实施方式中，由于引入了至少一种遗传定子表达至少一种与软骨发育不良相关的表型的非人动物模型，其中遗传定子为对应于SEQIDNO60，SEQIDNO61的猪COL10A1基因、mRNA和/或蛋白质或其片段或其部分的基因或DNA或其片段，和/或RNA或其片段，和/或蛋白质或其部分，且至少以一种短暂的方式存在过。用于软骨发育不良的非人动物模型可由本领域技术人员通过任何可用的方法将所述遗传定子引入到靶细胞中，例如注射到靶细胞中或通过病毒介导的转移或本领域技术人员所知道的任何合适的方法产生。在一种具体的实施方式中，用于软骨发育不良的非人动物模型通过精子介导的基因转移来产生。根据本发明，在一种实施方式中，这里用于软骨发育不良的猪模型是通过本文其它地方描述的猪或人来源的组成型表达的猪COL10A1的精子介导的基因转移产生。然而，用于软骨发育不良的猪模型还可通过向靶细胞中引入COL10A1DNA或对其进行表达的蛋白质来产生。用于软骨发育不良的非人动物模型，尤其是用于软骨发育不良的猪模型通常会产生上面所描述症状例如涉及管状骨的疾病，其特征在于干骺端中的软骨的类似肿瘤增生，其在长度上引起畸变生长或病理性骨折。非人动物本发明涉及用作疾病模型的非人动物，其模型被在这里被用于常染色体显性疾病，例如神经变性疾病如蛋白质构象疾病，例如本文其它地方所列出的疾病。在一种实施方式中，非人动物模型可以为符合条件任意模型，即动物不是像大鼠、小鼠或仓鼠的啮齿动物。非人动物选自于猿、猴、牛、猪、绵羊、山羊、马、驴。在本发明的一种特殊的实施方式中，非人动物模型是猪。在一种实施方式中，代表猪模型的猪是野生猪。在另一种实施方式中，猪是家猪、野猪(Susscrofa)，例如家猪(S.domesticus)。而在另一种实施方式中，本发明涉及小型猪以及近亲繁殖的猪。猪可选自于由兰德瑞斯(Landrace)，约克夏(Yorkshire)，汉普夏(Hampshire)，杜洛克(Duroc)，中国梅山猪(ChineseMeishan)、贝克郡猪(Berkshire)以及皮特兰猪(Piêtrain)组成的组，如由兰德瑞斯(Landrace)，约克夏(Yorkshire)，汉普夏(Hampshire)，杜洛克(Duroc)组成的组，如由兰德瑞斯(Landrace)，杜洛克(Duroc)和中国梅山猪(ChineseMeishan)组成的组，如由贝克郡猪(Berkshire)，皮特兰猪(Piêtrain)，兰德瑞斯(Landrace)，和中国梅山猪(ChineseMeishan)组成的组，如由兰德瑞斯(Landrace)和中国梅山猪(ChineseMeishan)组成的组。在一种实施方式中，猪不是小型猪。在本发明另一种实施方式中，猪是小型猪且小型猪优选自于由戈廷根猪(Goettingen)、尤卡坦猪(Yucatan)、巴马香猪(BamaXiangZhu，)、五指山猪(Wuzhishan)和西双版纳猪(XiShuangBanna)组成的组。本发明的一方面涉及由精子介导的基因转移产生的非人动物模型。本发明的精子介导的基因转移被用来制备用于研究遗传常染色体的显性疾病的非人动物模型和/或制备用于研究肌萎缩性侧索硬化，阿尔茨海默病，帕金森病，与三核苷酸重复相关的疾病，亨廷顿舞蹈病和/或软骨发育不良的猪模型，该方法包括步骤i)提供雄性、非人动物的精子ii)提供一种遗传定子，当遗传定子在所述非人动物模型中进行表达时，其能够建立所述遗传疾病iii)将所述精子与所述遗传定子进行接触iv)将来自于雌性、非人动物的卵母细胞与精子和遗传定子进行受精以及v)将所述受精卵母细胞在允许其发育成所述非人类动物模型的条件下进行温育。用于该方法的精子来自于雄性、非人的动物，尤其是公猪。精子供体公猪的选择对于该过程的结果至关重要。选择上等的公猪从而使得初始精子的运动性≥90％。优选地，精子是新鲜的并被收集在无菌10mL试管中，且在温度不低于15℃的条件下未经稀释地运输，因为温度低于15℃则会对精细胞产生损害。精细胞的质量以及随后的精子介导的转基因过程的有效性受许多因素的影响，例如年中的季节、供体被采集的频率、品种和年龄。为了选中合适的供体细胞，来自于不同公猪的精细胞需要在光学显微镜下进行检查。在洗涤步骤后具有最高精细胞运动力的来源于公猪的精细胞将被选中。下一步，对所选择的公猪的精细胞进行计数。本发明来讲，在去除精液后精细胞的运动力得到维持是重要的。在一种实施方式中，将公猪禁欲1～10天，2～8天，1～2天或在本发明具体的实施方式中，在采集用于本过程中的精子前将供体公猪禁欲2天。外源DNA内化的机制涉及能够将DNA以CD4-类的方式结合到精子头部的特异蛋白质。30-35kDa的蛋白质已经在多种物种例如鼠、牛、猪和人中被确定。然而，在正常的条件下，精液通过拮抗DNA的结合防止精细胞被外源DNA内化。主要的拮抗剂是抑制因子1(IF-1)。相应地，拮抗剂在精子被用在精子载体转基因步骤之前需要被去除或中和。因此，在本发明的一种实施方式中是通过例如洗涤将精液从精子中去除。射出的精子在正常的条件下获得能育力，这是指精子经历生理学上的改变使得细胞能够受精。因此，在本发明的一种实施方式中，精子介导的基因转移中精子-DNA的相互作用的起始应当在去除精液(例如在该过程的洗涤步骤中)后很短时间内就发生。在另一种实施方式中，为了利于精子能育力的获得以及获得正确的精子-DNA温育时间，使用的缓冲液是不含钙的，因为钙在正常条件下会促使精子能育力的获得。另外，钙的缺失防止了核酸内切酶作用于外部DNA。因此，在本发明的一种特定的实施方式中，精子是在不含钙的缓冲液中被洗涤。在进一步具体的实施方式中，洗涤缓冲液含有的下述成份，它们是溶解于水的56.1g葡萄糖、3.5gEDTA(2H2O)、3.5g柠檬酸钠、1.1g碳酸氢钠(对于1L的缓冲液)并且溶液通过过滤器后除菌。在缓冲液被加入到精液细胞之前，加入6mg/mlBSA(牛血清清蛋白，FractionV，Sigma)。根据本发明一种优选的洗涤过程是按如下步骤尽可能快地完成将5mL的精子转移到50mL的试管中并加入预加热到37℃的5mL的洗涤缓冲液，倒转试管进行混合。将该溶液在室温下(约22℃)温育5分钟并加入40mL的缓冲液(室温)。在800g下于25℃进行离心分离10分钟，去除上清液并将沉淀重悬浮在50mL缓冲液中(室温)。将混合物在800g下于17℃进行离心分离10分钟，去除上清液。将沉淀小心地重悬浮于试管的剩余缓冲液中。当遗传定子被供给时，精子与遗传定子进行接触。精细胞在如上所述缓冲液中被稀释以洗涤精细胞。在一种实施方式中，缓冲液温度是在15℃～25℃，特别地，温度是17℃。以DNA形式存在的遗传定子被加入到稀释的精细胞中。遗传定子的浓度是每106个精细胞0.1μg～1μg。在具体的实施方式中，遗传定子是线性化的DNA，其以0.4μg线性化的DNA/106精细胞的浓度被加入。在一种特定的实施方式中，使用下面的过程将109个精细胞稀释到120mL17℃的缓冲液，加入0.4μg线性化的DNA/106精细胞(即总共400μg线性化的DNA)。在17℃下温育100分钟为避免细胞的沉淀，每20分钟翻转试管一次将试管转移到室温下，并将其(在室温下)转移到动物房或厩设备中(约10分钟)。温育的精细胞现在可用于人工授精方法中。本发明的人动物模型，尤其是猪模型可通过精子介导的基因转移以外的方法产生，例如通过前核显微注射法、体细胞核移植法或反转录病毒介导的转基因法来产生。本发明进一步涉及含有至少一种遗传定子的非人精细胞，当其表达在非人动物宿主生物中表达时会引起至少一种遗传疾病的至少一种显性表型。非人精细胞可来自于本文其它地方列出的任何动物。如本文其它地方的详细描述，遗传定子来源于哺乳动物，例如来源于人和/或猪。非人精细胞可以是引起遗传疾病例如本发明所述的任何疾病的常染色体显性表型的非人精细胞。非人宿主生物体为这里所列出的任何动物，尤其是猪。根据本发明非人精细胞可通过包括下述步骤的方法制备a)提供非人精细胞，b.提供至少一种遗传定子，其在非人动物宿主生物表达中时会引起遗传疾病的显性表型，c.将所述非人精细胞与所述至少一种遗传定子进行接触，其中所述接触会导致遗传定子被摄取到非人精细胞中。本发明进一步还涉及一种组合物，其含有精细胞和至少一种遗传定子，所述遗传定子当在非人动物宿主生物中表达时会引起至少一种遗传疾病的显性表型。在优选的实施方式中，遗传定子来源于人和/或猪。本发明还公开了一种通过精子介导的基因转移对卵母细胞进行受精的方法。该方法包括的步骤是提供携带至少一种遗传定子的非人精细胞，该遗传定子表达这里所定义的常染色体显性疾病相关的表型，以及将非人精细胞引入到卵母细胞进行受精。因此，本发明的另一方面涉及通过精子介导的基因转移对卵母细胞进行受精的方法，其中该方法包括提供这里所描述的组合物以及将组合物引入到卵母细胞进行受精的步骤。因此，本发明还涉及使用非人精细胞对卵母细胞进行受精所得到的胚胎，其中当表达在非人动物宿主生物体内时，非人精细胞含有至少一种引起本发明的至少一种遗传疾病的至少一种显性表型的遗传定子。类似地，通过使用这里所公开的组合物对卵母细胞进行受精所得到的胚胎是在本发明的范围内。此外，当胚胎被形成时，本发明还提供一种方法来对胚胎进行温育和发育，其包括在使胚胎发育成非人动物后代的条件下对胚胎进行培育的步骤，其中的后代表达所述遗传定子并引起遗传疾病的显性表型。常染色体的显性疾病的非人动物模型的存在提供机会来评价给定的药物组合物、化合物、治疗和/或药物对给定的非人动物的表型是否有效果。因此，在本发明的范围内提供一种方法来评价遗传疾病的治疗处理的反应，所述方法包括步骤a)根据本发明提供非人动物模型b)使用对所述至少一种表型产生作用的至少一种药物组合物来治疗非人动物，以及c)对所观察到的效果进行评价。此外，本方法还允许在基于评价方法过程中所观察到的效果对例如患常染色体显性疾病的人进一步提出医学治疗的建议，其中常染色体显性疾病如神经变性疾病、蛋白质构象疾病如ALS、阿尔茨海默病、HD、PD、与三核苷酸重复相关的疾病以及软骨发育不良。此外，表达特定的与常染色体显性疾病相关的表型的非人动物模型的获得使得能够提供对药物组合物的功效进行筛选的方法，其中该方法包括步骤a)提供本发明的非人动物模型b)在所述动物模型中对至少一种遗传定子进行表达并引起所述遗传疾病的所述显性表型，c)对所述非人动物模型施用一种需要评价疗效的药物组合物，以及d)评价药物组合物对由任何遗传定子表达于非人动物模型中时引起的表型的作用，如果有的话。此外，本发明还涉及一种方法用于治疗患有常染色体显性疾病的人，其中该方法包括以下初始步骤a)提供本发明的非人动物模型，b)在所述动物模型中对所述遗传定子进行表达并引起所述遗传疾病的显性表型，c)使用对所述表型起作用的药物组合物治疗非人动物，d)对观察到的效果进行评价，且e)根据在非人动物模型中所观察到的效果来对所述患有所述遗传疾病的人进行治疗。此外，还公开了一种将遗传定子与人遗传疾病的出现联系起来的方法，所述方法包括步骤a)将通过卵母细胞与非人精细胞以及一种可能构成常染色体显性疾病基因的遗传定子进行受精所获得的胚胎进行温育和发育，所述常染色体显性疾病基因，例如当表达在非人动物宿主生物体内时引起疾病如神经变性疾病的显性表型的猪基因，其中所述培育和发育过程会产生非人动物的后代；以及b)观察所述遗传定子是否在所述非人动物后代上产生所述常染色体显性疾病。实施例实施例1肌萎缩性侧索硬化(ALS)的转基因猪模型为了建立能够用作人神经变性疾病ALS的潜在猪模型的转基因猪，通过定点诱变将突变Gly93Arg引入到猪SOD1的基因中。突变的选择是根据蛋白质结构推测，因为人SOD1的晶体结构揭示了一种极度凝聚的结构，该结构表明在小的相对柔性的甘氨酸位置上来使用大的带电的精氨酸进行取代有可能引起蛋白质内部的重大改变。此外，在该位置上的几种不同取代会引起人的ALS，包括G93R突变[45，46]。为了防止SMGT步骤后DNA构建物内的重要元件被截除的可能，已含有猪SOD1cDNA的DNA片段含有额外的CMV启动子和SVpolyA片段的5’-和3’-引导核苷酸。总的来说，如图1所示，用来制备转基因动物的片段约为2100bp。RNA分离和cDNA合成将各种猪的组织从屠宰的猪(杜洛克公猪以及长白猪-约克夏种的大母猪(DXLY))上切割下来并立即冰冻在液氮中且在-80℃下保存。选取100mg的组织用于RNA分离。使用Macherey-Nagel的Midi试剂盒的Nucleospin对RNA进行分离。cDNA的合成是通过将1μg的总RNA与1μL的oligo(dT)12-18(500μg/mL)以及DEPC处理的H20进行混合至最终体积12μL完成。将混合物在70℃下温育10分钟，随后加入4μL的5x第一链缓冲液，2μL的0.1mMDTT，1μL的10mMdNTPmix以及1μL(200U/μL)的SuperscriptII(Invitrogen)并将样品在42℃下进一步温育1小时，随后在70℃下进行15分钟的失活。目的序列基因，包括猪SOD1基于在人SOD1基因和“内部”猪EST数据库之间的同源性搜索，设计出了2个引物(SOD1_CDF和SOD1_CDR)用于猪SOD1基因的cDNA扩增。PCR反应在总体积为25μL的环境中进行，其由2.5μL的10x反应缓冲液，4μL的dNTP(2.5mM)，1μL的正向和反向引物(各10pmol)，1μL1U/μL的Dynazyme聚合酶(Finnzymes)，2μL的cDNA模板，以及13.5μLH2O组成。降落PCR反应在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中在以下条件下进行每次循环在95℃下进行初始变性3分钟，在95℃变性30秒，以0.5℃的减量从63℃降落至58℃进行30秒，然后在72℃延长1分钟。进一步进行如下的35次循环在95℃变性30秒，在58℃退火30秒，在72℃延长1分钟，最后在72℃延长7分钟。用来扩增SOD1cDNA的引物是SOD1_CDF5’-ATGGCGACGAAGGCCGTGT-3’(SEQIDNO62)SOD1_CDR5’-TTACTGGGTGATCCCAATTACACCAC-3’(SEQIDNO63)使用IIGel提取试剂盒(Qiagen)从1％Seakem琼脂糖凝胶对PCR产物进行纯化。采用生产商的建议并使用标准过程将扩增子克隆到2.1-TOPO载体(Invitrogen，CA)中，随后对克隆进行测序以确保其含有SOD1扩增子。猪SOD1cDNA序列如图1所示。循环测序反应在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中完成，在该系统中初始变性步骤在95℃下进行2分钟，99次循环10秒变性和在60℃延长4分钟，该步骤被用在样品混合物上，其含有1.5μL的BigDyeTerminatormixversion3.1，1μL的引物(5pmol)，2μL的5x反应缓冲液，2μL的纯化的PCR产物以及3.5μLH20。使用2.5体积的乙醇和1/10体积的3MNaAc对测序产物进行沉淀，空气干燥并重新悬浮在10μL的甲酰胺(测序级)中。将样品在3730xlDNAAnalyzer(AppliedBiosystems)上进行测序。猪SOD1的位点定向突变为了将Gly93Arg突变引入到SOD1中，使用XL位点定向突变试剂盒(Stratagene)进行位点定向突变并根据这里所描述的生产商的建议完成该操作。PCR反应是在50μL总体积的溶液中进行，其含有5μL的10x反应缓冲液，2μL的正向引物和2μL的反向引物(各10pmol)，1μLdNTP混合物，3μLQuickSolution，1μLDNA聚合酶(2.5U/μL)，1μLTOPO-SOD1模板(10ng)以及35μLH20。用于所述PCR过程的正向引物和反向引物是SOD1G93R_F5’-GACTGCTGGCAAAGATCGTGTGGCCACTGTGTACATC-3’(SEQIDNO64)SOD1G93R_R5’-GATGTACACAGTGGCCACACGATCTTTGCCAGCAGTC-3’(SEQIDNO65)PCR反应在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中在下述条件下完成初始变性在95℃下进行1分钟，和18次循环95℃变性50秒，在60℃退火50秒，并在68℃延长6分钟，最后的步骤为在68℃延长7分钟。为了消化未突变的亲本DNA模板，随后将1μL的DpnI(10U/μL)加入到样品混合物中。反应在37℃下温育1小时。在亲本DNA模板被消化后，使用DpnI处理的DNA按照下述方式转化XL10-超级感受态细胞(Invitrogen，CA)将XL10-超级感受态细胞在冰上进行解冻并将45μL的等分试样加入到预冷却的Eppendorf管中并且加入2μL的β-巯基乙醇，随后轻轻涡旋样品。将管置于冰上10分钟。在温育后，加入2μL的DpnI处理的DNA，涡旋样品并在冰上再温育30分钟然后再暴露在42℃的热脉冲下30秒。随后，将样品置于冰上2分钟后加入0.5mL42℃NZY+培养基。将混合物置于LB-amp板上并在37℃过夜培养。为了确保目的突变被整合到猪SOD1基因中，挑选16个菌落并在液体LB-Amp培养基中隔夜生长且根据生产厂商的推荐使用SpinMiniprepkit(Qiagen)对质粒进行纯化。循环测序反应在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中完成，样品混合物进行在95℃下进行2分钟初始变性步骤，和99次循环10秒变性并在60℃延长4分钟，样品混合物含有1.5μL的BigDyeTerminatormixversion3.1，1μL的T7或SP6引物(5pmol)，2μL的5x反应缓冲液，1μL的纯化的质粒以及4.5μLH20。使用2.5体积的乙醇和1/10体积的3MNaAc对测序产物进行沉淀，空气干燥并重新悬浮在10μL的甲酰胺(测序级)中。将样品在3730x1DNAAnalyzer(AppliedBiosystems)上进行测序。对序列进行检查并将含有突变的质粒选为后续过程的模板。突变的猪SOD1cDNA序列如图2所示。将目的基因-SOD1克隆到表达载体，phCMV1中为了有助于对目的转基因进行连续的高表达，将基因克隆到phCMV1载体中(基因治疗系统)。为了释放突变的SOD1DNA，在加入了3μLEcoRI10x反应缓冲液的总体积30μL溶液中使用1.5μLEcoRI(20U/μL)对6μL质粒DNA进行消化。该反应是在37℃下温育90分钟并在1％SeakemGTG琼脂糖凝胶上进行。使用II凝胶提取试剂盒(Qiagen)将合适大小的带从琼脂糖凝胶分离出来并溶解在30μLH2O中。同样地，使用EcoRI对phCMV1进行EcoRI消化并从0.8％SeakemGTG琼脂糖凝胶中分离出来并溶解在30μLH2O中。此外，为了避免载体的自身连接，使用1.5μLCIP(10U/μL)和2.5μL10xCIP反应缓冲液将6μL被消化的phCMV1载体在总体积25μL溶液中去磷酸化。样品在37℃下温育60分钟。在80℃保持15分钟失活酶。将诱变SOD1连接到EcoRI消化的和脱磷酸的phCMV1是在加入了3μL脱磷酸的phCMV1，8μLEcoRI消化的诱变SOD1，1.5μLT4DNA连接酶(400U/μL)，1.5μL10xT4DNA连接酶缓冲液，和1μLH2O的总体积为15μL的溶液中进行。该反应在16℃隔夜培养。将XL10-超级感受态细胞在冰上进行解冻并将45μL的等分试样加入到预冷却的Eppendorf管中并且加入2μL的β-巯基乙醇，随后轻轻旋转管。将样品置于冰上10分钟。在温育后，加入3μL的连接混合物，涡旋样品并将其在冰上再温育30分钟然后再暴露在42℃的热脉冲下30秒。随后，将样品置于冰上2分钟后加入0.5mL42℃NZY+肉汤。将混合物涂在LB-amp板上并在37℃隔夜培养。为了确保插入物被正确整合到猪phCMV1载体中，挑选16个菌落并在液体LB-Amp培养基中隔夜生长且根据生产厂商的推荐使用SpinMiniprepkit(Qiagen)对质粒进行纯化。循环测序反应在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中完成，在该系统中对样品混合物进行95℃初始变性2分钟，99次10秒的变性和60℃延长4分钟，所述样品混合物含有1.5μL的BigDyeTerminatormixversion3.1，1μL的T7或SP6引物(5pmol)，2μL的5x反应缓冲液，1μL的纯化的质粒以及4.5μLH2O。使用2.5体积的乙醇和1/10体积的3MNaAc对测序产物进行沉淀，空气干燥并重新悬浮在10μL的甲酰胺(测序级)中。将样品在3730xlDNAAnalyzer(AppliedBiosystems)上进行测序。对序列进行检查并选择含有正确的方向的SOD1构建物的质粒。DNA的大量制备为了制备精细胞温育用的DNA，需采用PCR和大量的质粒制备物。在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中在终体积为25μL的溶液中进行PCR反应，所述溶液含有5μL5xPhusionHF缓冲液，2μLdNTP(各2.5mM)0.63μL正向和反向引物5pmol，0.1μLPhusionDNA聚合酶(2U/μL)，1μLSOD1-phCMV1模板以及15.6μLH2O。PCR反应包括在98℃下进行初始变性30秒，随后进行30次循环如下反应在98℃下变性10秒，在74℃下退火30秒并在72℃延长95秒，最后在72℃延长延长7分钟。下面的引物用于扩增突变的SOD1构建物加侧翼(用于vartermen匹配)的CMV启动子、内含子序列以及SVpolyA，产生1643bp的片段+诱变的SOD1片段，产生约2100bp的片段。phCMVF5’-GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGG-3’(SEQIDNO66)phCMVR5’-GGGTGATGGTTCACGTAGTGGGC-3’(SEQIDNO67)为了对产生的PCR产物进行纯化，使用了“高纯PCR产物纯化试剂盒”(Roche)。在整个纯化过程中遵循供应商的用法说明。PCR纯化片段被测序以检查如下所述序列中的错误。从1/2L的E.coli细胞培养液中完成大量质粒的制备。使用PlasmidMegaKit_(Qiagen)对质粒进行纯化。为了从载体中线性化并释放出期望的片段，使用BssSI和DraIII按下列方式对载体进行消化将1.5μLBssSI(4U/μL)，1.5μLDraIII(20U/μL)，3μL10xBSA，3μL10xNe缓冲液3以及2μL质粒DNA加入到19μLH2O中得到30μL的总体积并在37℃下保留过夜。在0.8％GTGSeakem琼脂糖凝胶上分离被消化的片段并根据生产厂商的推荐使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离和提取出适当尺寸的带。对PCR纯化片段和质粒制备片段进行测序以检查序列中的错误。循环测序反应在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中完成，在该系统中对样品混合物进行如下程序初始变性步骤95℃2分钟，99次循环的10秒变性和60℃延长4分钟，所述样品混合物含有1.5μL的BigDyeTerminatormixversion3.1，1μL的T7或SP6引物(5pmol)，2μL的5x反应缓冲液，1μL的纯化的质粒以及4.5μLH2O。使用2.5体积的乙醇和1/10体积的3MNaAc对测序产物进行沉淀，空气干燥并重新悬浮在10μL的甲酰胺(测序级)中。将样品在3730xlDNAAnalyzer(AppliedBiosystems)上进行测序。图3显示了将猪SOD1的推断的氨基酸序列与人，小鼠以及大鼠进行了对比。突变的氨基酸(G)被标记为粗体。图4显示了在SOD1中的突变在人源SOD1二聚物的晶体结构上的投影。突变存在于整个蛋白质中，表明蛋白质的全部残基对于酶发挥正常功能是重要的。精子制备和DNA摄取精子供体公猪的选取精子供体公猪的选择对于该过程的结果至关重要。因此与公猪饲养站(HattingKSViborg)进行联系并选择优选公猪使得初始精子的运动力≥90％。将精子收集在无菌10mL管中且在温度不低于15℃的条件下被未经稀释地进行运输，其中温度如低于15℃则会对精细胞产生损害。从8个不同公猪收集第一次和第二次射出的精液总共得到16个精子部分。所有的精子部分在清洗步骤前均具有90的初始运动力。精液通过离心分离被迅速除去，并在授精缓冲液(FB)中洗精子，其中授精缓冲液由溶解于1升无菌水中的56.1g葡萄糖，3.5gEDTA(2H2O)，3.5g柠檬酸钠(2H2O)，和1.1g碳酸氢钠组成。然后加入6mg/mlBSA(FractionV，Sigma)。简言之，向5mL未稀释的精液中加入预热至37℃的5mLFB/BSA，并在室温下(约22℃)放置5分钟。然后，将室温下的FB/BSA加至50ml并在室温下500g离心分离10分钟，或在25℃，800g下离心分离10分钟。除去上清液并将精液重新悬浮于室温下的50mLFB/BSA中并在17，500g进一步离心分离，然后再次除去上清液并将精子重新悬浮于15mL的FB/BSA中。然后，为了选择最佳的供体细胞，对来自不同公猪和两次不同射精的精子在光学显微镜下迅速检查。在洗涤步骤后具有最高精细胞运动力的源自两头公猪的精细胞被选作用于后续转基因步骤中的载体。并且，对精子进行了计数。转基因猪的产生将分别来自两头选出的供体公猪之一的洗涤过的精子的1x109个精细胞与线性化的SOD1DNA片段(图5)以在120mLFB/BSA的悬浮液中含0.4μgDNA/106精子的浓度下在17℃下温育100分钟。每隔20分钟将容器倒置以防止精子发生沉淀。最后，在室温下温育混合物10分钟并对自然发情的两头母猪进行人工授精。动物根据她们的自然发情期选择重约140kg的两头受体母猪(丹麦兰德瑞斯猪x约克夏(Yorkshire))并按照标准的受精步骤用于人工授精(1x109DNA处理的精子(精子)/母猪)。授精是在DIAS的当地的厩中完成。从禁欲了2天的驯养的丹麦兰德瑞斯公猪收集精液。根据前面提及的步骤对精液进行处理。在受精后24和42天检查两头母猪是否怀孕，结果显示只有1头怀孕。在孕期终结后，自然产出2头小公猪和5头小母猪。动物照料和实验步骤符合当地的，全国的和欧盟的指南。对小猪的分析用于转基因的测试115天后(20.06.2005)，产出7头看似正常的小猪，它们中的2头为小公猪，5头为小母猪。从这些小猪采集血液样品到6mLEDTA血液采集管中。另外，从野生型动物中也采集血液并与所述7个动物的一同进行处理。根据标准的血液纯化步骤在专业的清洁实验室中对DNA进行纯化，以避免任何可能的污染。PCR反应是在10μL总体积的溶液中进行，其含有1μL10x无MgCl2的反应缓冲液，0.4μL的50mMMgCl2，1μL的正向引物和逆向引物(各10pmol)，0.5dNTP混合物，0.5μLDyNazymeEXTDNA聚合酶(1U/μL)，0.5μLDNA模板(50ng)以及5.1μLH20。用于所述PCR过程的正向引物和反向引物是PhCMV_430F5’-GTCTCCACCCCATTGACGTC-3’(SEQIDNO68)PhCMV_646R5’-GGATCGGTCCCGGTGTCTTC-3’(SEQIDNO69)降落PCR反应在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中在下述条件下完成在95℃下进行初始变性3分钟，每次循环在95℃变性30秒，以0.5℃的减量从62℃降落至57℃进行20秒，然后在72℃延长1分钟。进一步进行如下的35次循环在95℃变性30秒，在57℃退火20秒，在72℃延长1分钟，最后在72℃延长7分钟。这样就产生了218bp的PCR片段，且结果示于图6中。图6示出了所有的动物(4905-4911)就转基因DNA片段而言都是阳性的。然而不能排除镶嵌现象，也不能排出不同动物具有不同拷贝数的可能。因此，杀死2只动物(猪4906和猪4909)并取出各种组织样品在液氮中速冻然后储存于-80℃下。从不同组织中纯化DNA并进行与上面相同的PCR，唯一不同之处是DNA的量没有进行归一化。来自动物4906和4909的PCR结果分别示于图7和8中。图7和8示出了用于PCR对照的几乎所有的组织都含有转基因片段。并且，应当注意的是基因组模板DNA未就浓度进行归一化。另外，图6中泳道9和图8中泳道3和5中缺乏DNA片段可由转基因动物的嵌合的特点来解释。然而，对猪4906和4909而已，转基因存在于大量不同的组织中。精细胞中的转基因为了将转基因转至下一代，重要的一点是保证转基因存在于精细胞中。因此，从两头公猪(4905和4908)的精液细胞中提取出DNA。使用两种不同的过程--标准纯化过程和小量提取纯化过程来对DNA进行纯化。标准纯化过程在1mL0.9％NaCl中对300μL精液进行洗涤，然后在3000rpm离心分离5分钟，除去上清液。重复该步骤两次并将20μL链霉蛋白酶(20mg/mL)，20μL1MDTT以及300μL缓冲液S加入到每个样品中，随后在室温下进行隔夜温育。随后，将180μL6MNaCl加入到每个样品中并剧烈摇动约20秒。现在将样品在10000rpm下离心分离15分钟，然后将上清液小心转移到eppendorf管中，在管中通过添加两倍体积的上清液对DNA并在10000rpm下离心分离10分钟沉淀。随后除去乙醇并将DNA通过空气干燥并重新悬浮在300μL不含核酸酶的水中。小量制备纯化步骤在1mL0.9％NaCl中对300μL精液进行洗涤，然后在3000rpm离心分离5分钟，除去上清液。重复该步骤两次并将20μL链霉蛋白酶(20mg/mL)，20μL1MDTT以及300μL缓冲液S加入到每个样品中，随后在室温下进行隔夜温育。为了对低分子量DNA的每个样品进行富集并获得更纯的DNA产物，使用了Qiagen的小量制备步骤。将DNA在200μL不含核酸酶的水中进行洗提。缓冲液S合成物10mMTrisHCl(pH8.0)；100mMNaCl；10mMEDTA(pH8.0)；0.5％SDS；H2O。来自于这二个步骤的DNA被用在已提及的相同PCR测试中且结果示于图9中。图9显示了转基因出现在精细胞中，而使用小量制备纯化步骤纯化得到的DNA明显比用标准步骤纯化的DNA显示出多得多的不同带。这可能是由于DNA更纯或由于DNA作为染色体外片段存在。然而，由于这二个公猪含有转基因，这些将被用于产生下一代的转基因SOD1的生产中。兽医声明下面给出就转基因动物的2006年2月9日和2006年3月9日分别作出的兽医声明的摘录。公猪4905具有弯曲的背部和非常直的跗关节。其站起来和躺下去存在困难且站着时背部紧张，看上去有轻微的共济失调。与上个月相比较出现了重大的恶化。在肢体中没有直接的疼痛迹象。不清楚起因是在猪的后部关节部分以及骨盆区域或神经系统。在猪的背部共济失调的神经学上症状通常被认为是由于骨髓中的损伤而不是由脑所引起的。共济失调可能是由于缺少本体感觉，例如感觉肢体所处的位置。实验中其余的猪都能够自由地走动。上述部分是对2006年2月9日作出的兽医声明摘录的翻译。白猪4905正常状况下的公猪且没有外部损伤的标志。其能够用前腿和后退站立，但如果需要移动或被推时会有一点不稳。这明显是由于轻微的共济失调前腿交叉且有时具有翘起的角度并且将后腿向两边分开进行站立。通过触摸背部可缓解强烈的痒反射。吃和喝正常。没有跛行迹象。白猪4908正常状况下的公猪且没有外部损伤的标志。其能够以较低的(“understillede”)的后腿站立。当转向或从边侧被推时有轻微的共济失调。没有跛行迹象。白猪4907，4911，49103个母猪能自由运动。它们在被推时会产生一些轻微的共济失调的迹象。上述部分是对2006年3月9日作出的兽医声明摘录的翻译。对转基因小猪的分析生物样品在出生3天后抽取血液样品并在小猪达到115天时每3个星期抽取血液样品，存于6mLEDTA试管和6mL血清试管中。2头母猪在5个月大时且在可观察到任何表型变化前被屠宰。一头公猪4908在14个月大时被屠宰且另一头公猪4905在15个月大时被屠宰。这两头公猪都具有严重的表型变化。对于所有被屠宰的动物，各种组织被快速冷冻在液氮中并随后存储在-80℃。此外，各种组织，包括猪的大脑都被浸泡在福尔马林中。转基因猪的DNA和RNA的研究从EDTA稳定的血液样品以及从快速冷冻的尾巴中制备DNA。RNA是从心、肾、肝、肺、脾、脊髓(M.spinalis)、额叶皮层(FCO)、顶叶皮质(PCO)、背最长肌(M.L.dorsi)、左侧的半腱肌(M.semit.l.)、右侧的半腱肌(M.semit.r.)、左侧的半膜肌(M.semb.l.)、右侧的半膜肌(M.semb.r.)的快速冷冻组织中产生。所有的DNA和RNA样品是在专门清洁的实验设备中，在高度严格的实验条件下采用标准程序制备。PCR评测使用下列的引物对来源于7头猪中每一头猪的血液样品中分离出来的50ng的基因组DNA进行扩增SOD1Exon3F5’-GCTGTACCAGTGCAGGTCCTC-3’(SEQIDNO70)和SOD1Exon4R5’-CCATTGTGCGGCCAATGATG-3’(SEQIDNO71)，当扩增内源基因组SOD1时产生约800bp的片段且当扩增外显子3～外显子4cDNA片段时产生约200bp的片段。下面的样品混合物使用了1μL10x物MgCl2反应缓冲液，0.4μL50mMMgCl2，10pmol的每种引物，5mMdNTP-mix以及0.5UDynazymeExtDNA聚合酶。反应进行的总体积是10μL且在PCR系统9700(AppliedBiosystems)中在下述条件下以降落PCR方式完成在95℃下进行初始变性3分钟，每次循环在95℃变性30秒，以每秒0.5℃的减量从62℃降落至57℃进行20秒，然后在72℃延长1分钟。进一步进行如下的35次循环在95℃变性30秒，在57℃退火20秒，在72℃延长1分钟，最后在72℃延长7分钟。表达分析用2μg的从各种组织中的总RNA进行逆转录，其使用SuperScriptIII试剂盒(Invitrogen，USA)并根据生产厂家的指导使用随机六聚体引物来进行。将RT-PCR实验重复三次。从设计成跨越外显子-外显子接合处的引物扩增基因组DNA的风险通过在逆转录前运行PCR而被排除。在ABI-PEprism7900序列检测系统(PEAppliedBiosystems)中使用分析和PCR扩增来进行定量的实时PCR。引物ssSOD1_EX4F5′-GGATCAAGAGAGGCACGTTGG-3′(SEQIDNO72)和ssSOD1_EX4R5′-GGCGATCACAGAATCTTCGATG-3′(SEQIDNO73)，以及MGB探针使用PrimerExpressSoftware2.0(PEAppliedBiosystems)设计得到，并且设计用来匹配内源性的和突变的猪SOD1的MGB探针用作为报告染料的VIC和FAM设计(SS_SOD1_WTVIC-5′-CAAAGATGGTGTGGCCAC-3′(SEQIDNO74)和SS_SOD1_MutFAM-5′-CAAAGATCGTGTGGCCAC-3′)(SEQIDNO75)。此外，使用下面的引物和探针将18S核醣体RNA基因选作内源对照物18S-F5’-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3’(SEQIDNO76)，18S-R5’-CTCAACACGGGAAACCTCAC-3’(SEQIDNO77)以及18S-探针SYBR-5’-GGTGGTGG-3’(SEQIDNO78)。制备用于突变SOD1、野生型SOD1以及18S的独立混合物并且混合物含有5μL2xUniversalPCRMasterMix，每种引物0.3μL(10μM)，0.25μL探针(5μM)，2μL的10倍稀释的cDNA模板或者在18s的情况下为含2μL的10,000倍稀释的eDNA模板，以及H2O至最终体积10μL。在下述条件下完成实时PCR在50℃时2分钟，在95℃时10分钟，40循环的在95℃15秒、在60℃时1分钟。所有的PCR重复进行三次。在软件SDS2.2(PEAppliedBiosystems)中可确定对应于PCR循环数的循环阈值(Ct)，其中PCR循环数是实时荧光发射时所达到的高于基线发射的阈值。为了对比野生型SOD1在各种组织中的表达水平，使用标准曲线方法对相对mRNA模板浓度进行计算。Southern印迹分析对来源于两头染病公猪的背最长肌进行Southern印迹分析可确定转基因整合。未消化的，PvuII-消化的以及用PvuII和BamHI进行双重消化的15μg的基因组DNA在0.9％的琼脂糖凝胶上进行分离，在尼龙膜上进行印记并用[32P]-标记的SOD1cDNA片段作探测，该SOD1cDNA片段构成了大约为450bp跨越整个猪SOD1编码区，其是由PCR扩增后进行缺口平移得到。对来自健康野生型猪的基因组DNA进行与来自两头公猪的DNA相同的处理并作为对照。在含有5xDenhardt’s溶液和6xSSC的杂交缓冲液中在68℃进行杂交16小时。SOD分析采用超氧化物歧化酶分析试剂盒(CaymanChemicals，AnnArbor，MI)依据在[47]中描述的SOD1对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶对四氮唑盐诱导的还原的抑制能力确定SOD活性，使用从两头患病猪以及一头对照猪获得的血清根据生产厂家的指导完成该过程。将需要表现将过氧化物自由基O2·-50％歧化所需的酶量定义为一个单位的SOD并且将牛红细胞SOD(Cu/Zn)的溶液用作标准物。血清样品自9个月大的猪定期提取，从公猪4905总共取得19个样品，从4908取得17个，从对照猪取得19个，所有的样品都被包含在分析中。使用酶标仪在450nm处读取吸光度。血清的蛋白质含量通过标准的蛋白质分析来确定，该分析是根据二辛可宁酸(BCA)并依照生产厂家的推荐(Pierce，Rockford，IL)使用牛血清白蛋白作为参照在562nm测定吸光度。组织病理学用于肌肉组织检查的样品是取自于两头染病公猪(4905和4908)以及二头野生型对照猪(147和3713)的最后肋骨的弯曲部分上部的背最长肌的中心部位。样品的大小约为5X5X1cm。切割时，样品冰冻在在液氮中冷却的异戊烷中以最小化内部冰冻的外来物质。横向连续切片(10μm)是在-20℃下在恒冷箱中切割并收集在赖氨酸涂层的盖玻片上。对这些切片进行慢肌球蛋白重链(MHC)同工型的免疫组织化学染色(Catalogueno.CRL-2043，AmericanTypeCultureCollection)来识别I型纤维。在Pedersen等(2001)[48]中给出了用于免疫组织化学染色的方法描述。猪肌肉中的纤维类型结构是独特的，因为I型和IIA型纤维位于纤维束中。为了进行分析，我们对纤维束内的纤维进行了计数，这些纤维的数目较少地受动物的生长或大小不同的影响，并对纤维束内的纤维分布特征进行了比较。在分析中包括了I型纤维的纤维束。为了对骨髓进行组织病理学研究，采用了大约同龄的染病了的公猪4905和4908以及两种野生型公猪147和3713。在4％多聚甲醛中沉浸固定颈骨髓后，将组织包埋于石蜡中并切成5μm的切片。使用7种抗-SOD1肽抗体对切片进行染色。然而，仅仅100-115抗SOD1肽抗体是对猪SOD1是特异的，因此在该操作中使用该抗体。使用Ventana免疫组织化学系统进行免疫组织化学分析。统计学在两头染病公猪(4905和4908)以及对照(3713和147)之间的背最长肌中I型纤维束的数目的差异采用了学生t-检验进行统计显著性检验，由于数据接近基本的正态假设，故考虑不等方差(α＝0.05)。猪表型的描述表型改变的最初迹象最初在7个月龄的一头公猪4905上出现。公猪有轻微的共济失调并表现出降低的本体感觉并喜好躺下。这些症状逐渐严重并当公猪到10个月龄时在站起和躺下时出现肌束抽搐。另外，公猪出现显著的异常瘙痒反射并在15个月龄时因公猪没有帮助不能自己站立而将其屠宰。另外一头公猪4908在大约8个月时出现与另一头公猪类似的轻微的症状，出现轻微的共济失调以及显示出降低的本体感觉。一个月后它表现出肌束抽搐，这逐渐恶化并在12个月龄时当公猪处于直立位置时，这些肌束抽搐非常严重并持续存在。并且，该公猪还表现出异常的舌头运动。在14个月龄时，将该公猪屠宰。这两头公猪始终无需帮助均能完成基本的生存活动例如独立完成吃，喝，以及尿。Southern印迹分析为了确定是否已发生转基因的整合，对来自于两头染病公猪和一头野生型对照猪的背最长肌上的组织进行Southern印迹分析。使用的探针覆盖整个SOD1编码区，构成约450bp。然而，在任何含有未消化的，PvuII消化的以及PvuII和BamHI双重消化的公猪4905和4908以及野生型猪的DNA样品中没有发现可被检测的带，表明没有发生基因组整合。此外，在相同的条件下对含有SOD1cDNA的五份片段对照进行完全检测(图10中的泳道11和12)，表明在基因组SOD1cDNA是不经常的存在的(每个染色体＜1复制)。PCR分析为了进一步确定是否存在转基因，例如作为在最近的研究中[49]已经证明的染色体外实体，对两头染病的公猪和五头同窝出生的猪进行检测转基因的存在，使用了从血液纯化的DNA作为模板。使用的引物能够扩增得到800bp的覆盖野生型基因组SOD1片段的外显子3到外显子4片段，以及扩增到约200bp的突变的SOD1DNA片段。图11显示了除阳性对照外，只有800bpDNA片段被扩增，其产生于内源性的SOD1中。这表明七个动物中没有一个含有SMGT过程中所使用到的片段。此外，对从七个动物的尾巴中提取的DNA也进行了PCR分析，在突变SOD1的产生方面给出的也是阴性结果。然而，不能排除小部分细胞含有应用于SMGT过程中的构建物，该构建物有可能以染色体外的片段存在，然而这超出了我们的检测范围。此外，也排除了在一小部分细胞的其它组织中存在转基因；然而在被屠宰猪的各种组织中PCR扩增没有产生SMGT过程中所使用的DNA片段的一致的扩增，因此全部细胞中只有一小部分含有所述片段。SOD1表达分析含有Gly93Arg取代的SOD1构建物的表达通过定量RT-PCR使用跨含有取代的DNA区域的TaqMan探针来完成，并且因此用来自野生型SOD1mRNA和诱变的SOD1mRNA分别进行RT-PCR，所述SOD1mRNA来自两头染病公猪和两头野生型对照的心，肾，肝，肺，脾，脊髓，额叶皮质，顶叶皮质，背最长肌，左侧半腱肌，右侧半腱肌，左侧半膜肌，右侧半膜肌，并且对诱变的SOD1转录物或改变的内源性SOD1水平进行了分析。此外，诱变SOD1片段被包括在表达分析中以确保与诱变片段相匹配的SOD1探针非常适合于对任何转录进行检测。图12B显示了各种浓度的诱变片段的扩增，这表明探针适合用于诱变转录的检测。然而，在表示染病公猪和对照猪的12个组织中任何一个组织的扩增曲线上没有看出差别，从而推断在染病公猪中没有出现诱变转录，图12。尽管已经包括了很多的组织，但不能排出转基因的表达有可能存在在其它的组织中或表达水平非常低而在该分析中没有被检测出来。图12A显示了使用探针检测SOD1野生型转录的扩增曲线。这显示了SOD1探针检测SOD1转录，然而在可能的SOD1突变体转录的情况下可存在一些背景扩增，因为使用SOD1诱变片段存在扩增曲线(图12A中的粉色曲线)。然而，因为没有检测到诱变转录，所以在图12C的实时分析中不会考虑。实时分析显示在两头野生型公猪和两头染病公猪的任何被分析的组织之间不存在内源性的SOD1表达水平的差异。然而，在组织内部存在有大的差异，在组织之间也是如此。在肝和肾中可观察到最高的表达水平，这也与对人体组织所进行的研究相一致[50]。血清中的SOD分析血清中的SOD1活性通过分光光度检测，测量的是SOD1对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶诱导的四唑盐的还原的抑制[47]，并没有对Mn-SOD进行校正，这意味着图13中的活性代表了血清中的总SOD活性。然而，由于Mn-SOD占血清中总SOD活性的一小部分[51]，因此它不太可能掩饰在染病公猪和对照之间的差别。两头转基因染病公猪血清中的总SOD活性水平在所记录的时间间隔内大约与对照公猪处于相同水平，且未见有随时间(从2005年10月-2006年8月)出现的显著改变，图13。并且，使用了从肝和背最长肌提取的蛋白质进行的蛋白质组分析在两头转基因公猪中没有检测到诱变SOD1(数据未示出)。组织病理学研究由于肌肉纤维的特性可用于评价ALS的进展，对含有背最长肌中I型肌肉纤维的束进行分析，分析每个束之内的纤维数目。该研究表明在两头染病公猪内I型纤维的频数与对照猪相比明显地降低了，图14。统计评价显示与对照猪147相比，4905和4908的P-值为3x10-6和2x10-5，显示出很显著的差异。此外，0.08的P-值表明两头对照猪之间没有统计上的差别，P＝0.11的两头染病猪也是这种情况。图14中的染色进一步突出了在I型纤维中束的大小和绝对数目存在很大的差别，束的大小和绝对数目在两头转基因猪中也被减少。使用各种针对人的SOD1的肽抗体对来自于两头染病公猪和相同年纪的野生型公猪的颈脊髓的切片进行染色。然而，只有100-115抗-SOD1肽抗体被证明是对猪SOD1为特异的。图15显示来自染病公猪(4908)和相同年纪的对照公猪(147)的脊髓的运动神经元。在图15A)中显示了染病公猪的运动神经元，在运动轴突中观察到SOD1染色，这极有可能是由SOD1包涵体所致。相比之下，在对照的轴突中未观察到染色。此外，在图15A中在神经毡中观察到大的荧光区，而这在对照中也不存在。实施例2用于帕金森病的转基因猪模型猪SNCAcDNA的克隆通过RT-PCR和RACE组合从小脑中分离出全长猪α-突触核(SNCA)cDNA。最初，使用人SNCAcDNA序列利用GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)以及TheDanishInstituteofAgriculturalSciences(DIAS)的猪EST数据库进行blast搜索。采用NCBIBlastall，选择blastn，最低值10-8用空位联配(gappedalignment)进行序列相似性搜索。如此确认出的猪cDNAs被用于获得克隆的寡核苷酸引物以及作为在局部基因组DIAS序列数据库中作进一步搜索的询问条件。用于RT-PCR克隆猪SNCA的猪小脑组织由成年猪中获取。切除后，将组织切成碎片并在液氮中研磨成粉。通过Rneasy法(Qiagen)分离出总RNA。RNA样品的完整性通过核醣体的RNA在1％琼脂糖凝胶上的溴化乙锭染色来确认。这里所述的猪SNCAcDNA采用RT-PCR克隆法来分离。用5μg从猪小脑分离出的总RNA使用了SuperScriptIIRNaseH-逆转录酶(Invitrogen)来进行cDNA的合成。cDNA的合成由在65℃下对总RNA，寡(dT)12-18引物，dNTP加热5分钟开始，然后加入200单位的逆转录酶并在42℃温育50分钟，接着在70℃温育15分钟.该RT-PCR反应混合物含有2.5μlcDNA，1.5mMMgCl2，0.2mMdNTP，0.5μM每一种引物SNCA-F5’-CCATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAA-3’(SEQIDNO79)和SNCA-R5’-CTTCCGGCTCATAGTCCTGATACCC-3’(SEQIDNO80)，以及1UPhusionDNA聚合酶(Finnzymes)，总体积为25μl。采用以下程序在总体积中进行PCR扩增在94℃变性2分钟，进行10次94℃下15秒，55℃下30秒，72℃下40秒的循环，然后进行25次94℃下15秒，60℃下30秒，72℃下40秒的循环。在72℃7分钟结束PCR程序。将25微升的扩增产物加载在1％的琼脂糖凝胶上，电泳后通过溴化乙锭染色观察。剪下约400bp的荧光带并使用来自于Qiagen的QiaquickGelExtraction试剂盒进行洗脱。洗脱的PCR产物被直接克隆进pCRTOPO2.1载体(Invitrogen)中并在两个方向进行测序。为获得全长的编码SNCAcDNA，在5’和3’RACE(cDNA末端的快速扩增)实验中使用了来自分离的SNCA片段的正义和反义引物。将正义SNCA特异引物和试剂盒锚定引物(RocheMolecularBiochemicals)一起使用。简言之，对于3’-RACE，在逆转录反应中使用了oligodT逆转录寡核苷酸引物5’-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’(V＝A，CorG)(SEQIDNO81)。所得的SNCAcDNA被用作PCR扩增模板，采用了校正DNA聚合酶Phusion(Finnzymes)以及试剂盒锚定引物5’-GAAAACGCGTATCGATGTTCGAC-3’(SEQIDNO82)以及基因特异性引物SNCA-F5’-CCATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAA-3’(SEQIDNO83)。如上面所述对PCR产物进行回收，并克隆进pCRTOPO2.1和测序。一个PCR的约800bp的扩增子含有的DNA片段显示出与SNCA同源且也与部分SNCAcDNA的序列匹配，在SNCAcDNA中的序列是重叠的。对于5’-RACE，在逆转录反应中使用了逆转录寡核苷酸引物SNCA5-it15’-GGATCCTACATAGAGCACACCCTC-3’(SEQIDNO84)。合成的SNCAcDNA被用作PCR扩增模板，PCR扩增采用了校正DNA聚合酶Phusion(Finnzymes)以及试剂盒锚定引物5’-GAAAACGCGTATCGATGTTCGAC-3’(SEQIDNO85)以及基因特异性引物SNCA5-it25’-TCCCGCTGCTTCTGCCACACCCTG-3’(SEQIDNO86)。如上面所述对PCR产物进行回收，并克隆进pCRTOPO2.1和测序。一个PCR产物含有的DNA片段显示出与SNCA同源且也与部分SNCAcDNA的序列匹配，在SNCAcDNA中该序列是重叠的。在原始cDNA克隆和5’-和3’RACE序列之间的相互联系通过PCR采用引物SNCA5-F5’-CAGTCTGTTAGGGGGAGGAGCTTATTTC-3’(SEQIDNO87)和SNCA-it35’-CTATAGTTAATATTTATAGGTGCATAGTTCC-3’(SEQIDNO88)而得以确认。采用以下程序在总体积中进行PCR扩增在95℃变性2分钟，进行10次95℃下20秒，60℃下30秒，72℃下45秒的降落循环(每次循环-0.5℃)，然后进行25次95℃下20秒，55℃下30秒，72℃下45秒的循环。在72℃延长5分钟而结束PCR程序。DNA测序是采用双脱氧链终止法进行，使用了BigDye终止循环测序试剂盒以及AmpliTaqDNA聚合酶FS(PEAppliedBiosystems)。序列分析是在自动DNA测序仪(ABIPRISMTMGeneticAnalyzerModel3730xl，PEAppliedBiosystems)上进行。采用用于Windows的SEQUENCHER版本4.0.5(GeneCodesCorporation)进行比对和观察。猪SNCAcDNA的表征SNCAcDNA通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)使用源自电子(insilico)序列的寡核苷酸引物来进行扩增。在DIASEST库中确认的部分猪SNCAEST序列被用于获得用于SNCAcDNA的RT-PCR扩增的引物。获得了一420bp的片段，其显示出与公开的SNCA序列具有高度的同源性。从该序列设计出正义和反义引物并用于5’和3’-RACE实验。经一轮PCR后，获得了一覆盖编码和3’UTR序列的SNCAcDNA。类似地，经一轮PCR产生了缺失5’UTR的序列。为了确认所得的猪SNCA片段为互相连接的，使用覆盖接近全长编码序列的引物进行了PCR反应。由此获得了982bp的cDNA序列，示于图16中。通过比较推导的的多肽序列和其他分离的α-突触核蛋白质建立猪SNCAcDNA的同一性。猪SNCAcDNA(GenBank登记号DQ073395)的长度为982bp，其翻译起始位点位于核苷酸104处而TAA终止密码子位于核苷酸524处。SsSNCA的开放阅读框(oRF)具有50％的G+C成份，其编码一分子量估计为14.5kDa，pI为4.6的140个氨基酸的多肽。该编码的猪α-突触核蛋白含有其他α-突触核蛋白的特征基序具有从氨基端基分布至蛋白质中心的核心一致序列KTKEGV的5个不完全的重复。对于其他的α-突触核，与同源的β-突触核和γ-突触核相比缺失了11个中心疏水氨基酸。在猪α-突触核和其他公开的哺乳动物α-突触核蛋白质之间的氨基酸序列相似性通过Clustal法来确定。来自猪，人，小鼠和大鼠，牛，鸡和爪蟾的α-突触核氨基酸序列的多重比对(图17)揭露出非常高的总体同源性。有趣的是，发现位于53位的氨基酸在人中为丙胺酸残基而在所有其他物种中为苏氨酸残基。该特定的丙胺酸残基被发现在家族性帕金森病中被取代为苏氨酸(Ala53Thr)。发现在猪α-突触核和大多数其他α-突触核之间具有非常高的同一性。编码的猪α-突触核多肽表现出显著的与人α-突触核的序列同一性(98％)，与牛α-突触核的序列同一性(96％)以及与小鼠和大鼠的序列同一性(两者均为94％)。观察到的猪α-突触核与其他α-突触核蛋白质之间的氨基酸同一性在鸡α-突触核(84％)和爪蟾序列(80％)中最低。见图18中的系统发生树。使用Prosite网站(http://www.expasy.ch/prosite/)来分析140氨基酸的猪α-突触核蛋白质序列并预测分子量为14.5kDa以及确认了潜在的翻译后修饰。这些包括一个酪蛋白激酶II磷酸化位点，一个酪氨酸激酶磷酸化位点以及5个推定的肉豆蔻酰化位点。猪SNCA的定点诱变为了将Ala30Pro突变引入到猪SCNA中，使用XL定点诱变试剂盒(Stratagene)进行定点诱变并根据生产厂家的建议使用下述引物来完成该操作SNCA-A30P-F5’-GGGTGTGGCAGAAGCACCGGGAAAGACAAAAGAG-3’(SEQIDNO89)SNCA-A30P-R5’-CTCTTTTGTCTTTCCCGGTGCTTCTGCCACACCC-3’(SEQIDNO90).PCR条件是95℃下变性1分钟，进行18次95℃下50秒，60℃下50秒以及68℃下6分钟的循环。该PCR程序在72℃延长7分钟结束。为确保目的突变整合到猪SNCA基因中，选取了若干克隆并使它们生长过夜，收集质粒并根据标准程序进行测序。选择含突变的质粒作为后续步骤的模板。然后，含突变SNCAcDNA的质粒用KpnI和EcoRV消化以释放出SNCA片段，采用标准方案而将其克隆进入KpnI和SmaI消化的phCMV1表达载体中。用phCMV1载体制剂转化XL10-超级感受态细胞(Invitrogen，CA)并确保SNCA插入物已正确整合到phCMV1载体中，菌落在液体LB-Amp中生长，纯化质粒并根据标准程序进行测序。选择含正确整合的突变SNCA片段的载体构建物用于以下步骤。SNCADNA的大规模制备为了创建用于精细胞温育的DNA，需进行大规模的PCR反应。在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中进行PCR反应，最终体积为25μL，其含有5μL5xPhusionHF缓冲液，2μLdNTP(各2.5mM)0.63μL正向和反向引物5pmol，0.1μLPhusionDNA聚合酶(2U/μL)，1μLSNCA-phCMV1模板以及15.6μLH2O。PCR反应由以下步骤组成在98℃下进行初始变性30秒，随后在进行30次的98℃下变性10秒，74℃下退火30秒和72℃延长95秒的循环，随后在72℃进行最后延长步骤7分钟。下面的引物被用来对突变SOD1结构加边侧CMV启动子、内含子序列以及SVpolyA进行扩增，产生约2100bp的片段。phCMVF5’-GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGG-3’(SEQIDNO91)phCMVR5’-GGGTGATGGTTCACGTAGTGGGC-3’(SEQIDNO92)为了对产生的PCR产物进行纯化，使用了“高纯PCR产物纯化试剂盒”(Roche)。在整个纯化过程中遵循供应商的用法说明。对PCR纯化片段进行测序以检查序列中的错误。参见图19和20。精子介导的转基因SMGT精子介导的转基因，缓冲液为了洗涤猪精细胞并因此去除精液，使用下述最佳的缓冲液对于1L缓冲液来讲56.1g葡萄糖3.5gEDTA(2H2O)3.5g柠檬酸钠1.1g碳酸氢钠将组分溶解在水中并通过过滤器对溶液进行灭菌。在缓冲液被加入到精细胞之前，加入6mg/mlBSA(BovineSerumAlbumine，FractionV，Sigma)。精子供体公猪的选取精子供体公猪的选择对于该过程的结果至关重要。因此与公猪饲养站(HattingKSViborg)进行联系并选择优良公猪使得初始精子的运动力≥90％。将精子收集在无菌10mL试管中且在温度不低于15℃的条件下被未经稀释地进行运输，其中温度如低于15℃则会对精细胞产生损害。洗涤过程下面的步骤应尽可能快地完成(缓冲液如上所示)将5mL精液转移到50mL的Falcon试管中加入5mL预热到37℃的缓冲液倒转试管进行混合将溶液在室温下(～22℃)温育5分钟加入40mL缓冲液(室温)在800g于25℃下离心分离10分钟去除上清液将沉淀重新悬浮在50mL缓冲液中(室温)在800g于17℃下离心分离10分钟去除上清液将沉淀小心地重新悬浮在Falcon试管底部的剩余缓冲液中精细胞的检查为了选中合适的供体细胞，来自于不同公猪的精细胞需要在光学显微镜下进行检查。选择在洗涤步骤后具有最高精细胞运动力的公猪精细胞。下一步，对所选择的公猪的精细胞进行计数。DNA摄取/温育将109精细胞稀释成120mL17℃的缓冲液，加入0.4μg线性化的DNA/106精细胞(即整个为400μg线性化的DNA)。在17℃下温育100分钟为避免细胞的沉淀，每20分钟翻转试管一次将试管转移到室温，并仍在室温下将其转移到厩设备中。该过程约需10分钟。温育的精细胞现在可用在人工授精中。动物根据她们的自然发情期选择重约140kg的两头受体母猪(Danish兰德瑞斯(Landrace)x约克夏(Yorkshire))并按照标准的受精步骤用于人工授精(1x109DNA处理的精子/母猪)。授精是在DIAS的当地厩地完成。从禁绝了2天的驯化的兰德瑞斯公猪收集精液。根据前面提及的步骤对精液进行处理。在受精后24和42天检查两头母猪是否怀孕，结果显示只有1头怀孕。动物饲养和实验步骤符合当地的，全国的和欧盟的指南。测试转基因的存在115天后(17.06.2005)，产出10头看似正常的小猪，它们中的5头为小公猪，5头为小母猪。一头小公猪死于下面的日子(17.06.2005)。从这些小猪采集血液样品到6mLEDTA血液采集管中。另外，从野生型动物中也采集血液并与所述9个动物的一同进行处理。在较晚的阶段从选择的动物中收集精液并分离基因组DNA。根据标准的血液纯化步骤在专业的清洁实验室中对DNA进行纯化，以避免任何可能的污染。PCR反应是在10μL总体积的溶液中进行，其含有1μL10x无MgCl2的反应缓冲液，0.4μL的50mMMgCl2，1μL的正向引物和反向引物(各10pmol)，0.5dNTP混合物，0.5μLDyNazymeEXTDNA聚合酶(1U/μL)，0.5μLDNA模板(50ng)以及5.1μLH20。用于所述PCR过程的正向引物和反向引物是PHCMV_682F5’-GATTCCCCGTGCCAAGAGTG-3’(SEQIDNO93)SNCA-4R5’-TTGCCCAGCTGATCCTTTTTGCCAAAG-3’(SEQIDNO94)降落PCR反应在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中在下述条件下完成在95℃下进行初始变性3分钟，每循环在95℃变性30秒，以5℃的减量从62℃降落至57℃进行20秒，然后在72℃延长1分钟。进一步进行如下的35次循环在95℃变性30秒，在57℃退火20秒，在72℃延长1分钟，最后在72℃延长7分钟。从有可能发生基因转移的小猪中采集血液并按如上所述对纯化的DNA进行PCR反应。图21显示出所有的动物(4363-4371)在800bp的转基因DNA片段上都是阳性的。然而，不能排除嵌合性也不能排除不同动物具有不同复制数的可能。精细胞中的转基因为了将转基因转至下一代，重要的一点是保证转基因存在于精细胞中。因此，从公猪(4905和4908)的精液细胞中提取出DNA。使用标准纯化过程来对DNA进行纯化。标准纯化过程在1mL0.9％NaCl中对300μL精液进行洗涤，然后在3000rpm离心分离5分钟，随后除去上清液。重复该步骤两次并将20μL链霉蛋白酶(20mg/mL)，20μL1MDTT以及300μL缓冲液S加入到各样品中，随后在室温下进行隔夜温育。随后，将180μL6MNaCl加入到各样品中并剧烈摇动约20秒。现在将样品在10000rpm下离心分离15分钟，然后将上清液小心转移到eppendorf管中，在管中通过添加两倍体积的乙醇对DNA进行沉淀并在10000rpm下离心分离10分钟。随后除去乙醇并将DNA通过空气干燥并重新悬浮在300μL不含核酸酶的水中。缓冲液S组成10mMTrisHCl(pH8.0)；100mMNaCl；10mMEDTA(pH8.0)；0.5％SDS；H2O。在公猪4363-4371的精细胞中纯化的DNA中检查是否存在修饰的SNCA转基因。如图22所示，所有的公猪在其精细胞中均含有转基因。在所有动物中都能观察到期望大小为800bp的PCR，但含量不同。公猪#4363的表型特征最早的症状在3头猪达到17个月龄时出现。由KnudLarsen和兽医KeldDahlWinter(丹麦肉品)对这些猪进行检查。一头公猪(#4363)的症状最为明显。当站立时，公猪的背部表现出强烈的向上弯曲(凸起)。在背最长肌左侧观察到肌肉组织的丧失，而右侧未受影响。在活动期间，观察到尾出现持久的颤动。特别是当抬头时在劲部观察到更为明显的颤动。另外在尾和耳尖也可见到颤动。颤动为间歇式的，当公猪静止时部分消失。在公猪受到来访者惊吓和抬起头时头部和颈部的颤动加重。当人们将公猪圈绕起来时，它表现出僵硬的体态，缓慢移动但不会转圈。这不是一种正常的行为。四肢的协调性完全正常。然而，运动非常缓慢。健康的总体状态未受大的影响，且公猪未表现出任何疼痛的迹象。一个月后对公猪#4363进行检查。头，颈和尾部的颤动显著增加，并部分以静止性颤动存在。这些显著的颤动症状并未在任何早先描述过的猪的综合症中观察到(pers.comm.KeldDahlWinter)。公猪的运动非常缓慢且被认为是受到抑制，因为在人接近其尾部时，其不能转向。而正常的健康猪会立刻转向接近的人。从1个月前的最近一次检测之后，肌肉萎缩加剧并扩展到背部两侧。背线变得更为可见，神经棘更为突出。16天后，公猪#4363被屠宰并解剖用于后面的分析。公猪#4363的病理检查将公猪#4363屠宰并解剖。来自不同器官如心、肾、肝、肺、脾的样品与与来自睾丸和选择肌肉(背最长肌)的样品被一起收集。另外还取出脑并分成两半，每一半均切割成分散的区域并进行快速冷冻或固定在甲醛中。固定3周后，将不同的脑样品包埋进石蜡中，用切片机切片并进行不同的染色。黑质薄层切片的NisslAMG染色显示存在神经元但大部分神经元已皱缩具有腔隙且在细胞核、核仁以及细胞质之间没有明显的分离(图23)。类似地，如图24所示，HE-染色也显示了具有许多腔隙(孔洞)的收缩的神经元，这是神经变性明显表示。也在薄层切片上进行了酪氨酸水解酶(TH)的染色过程。结果如图25中所示，1)多巴胺能细胞的数目看上去被减少了且2)剩余的多巴胺能细胞和神经毡看上去变得变得更加粗糙和无序。为了做对比，小型猪的脑样品也被用来进行TH染色检查。观察到很多的多巴胺能细胞。GFAB染色显示在公猪#4363的中脑中存在很强的染色，这是明显的发炎和神经胶质增生的体现(图26)。观察到很多的星细胞，说明存在活动性炎症以及反应性胶质增生。非常有趣的是，使用针对人α-突触核得到的Ab进行α-突触核的特异抗体染色显示出贯穿中脑的大片α-突触核集聚(图27)。α-突触核位于细胞体内和细胞外环境中。总而言之，对公猪#4363的所有病理学检查都是清楚地表现为帕金森病的症状。然而，没有观察到典型的lewy小体。lewy小体是帕金森病(PD)的根本症状，且需要lewy小体(Lb)的存在来再现PD的形成和进展。对缺失LB的简单解释可以是公猪#4363在疾病进展中过早地被屠宰。由于公猪处于18个月龄，并显示出PD的很多临床症状但没有在这一特定阶段所期望的完全的静止性颤动。图23示出了从公猪#4363分离出的黑质的Nissl染色。该图清楚地展示出这里存在的细胞数少于正常健康个体应有的细胞数。并且，黑质中的神经元看起来异常，并且细胞质小泡的出现以及细胞收缩是异常状态的象征。lewy小体在这种染色中为不可见。实施例3阿尔茨海默病的转基因猪模型动物PSEN1和PSEN2分离和测序使用TRI-试剂(Sigma)分离出猪脑、淋巴细胞以及肝RNA。对于PSEN1的RT-PCR，使用下述引物(PSEN1正向，5’-TGGAGGAGAACACATGAAAGAAAG-3’(SEQIDNO95)；PSEN1-正向-EcoR15’-GGGGAATTCTGGAGGAGAACACATGAAAGAAAG-3’(SEQIDNO96)；PSEN1反向EcoR1，5’-GGGGAATTCCCTGACTTTGTTAGATGTGGACAC-3’(SEQIDNO97)。采用反向引物在50℃温育进行RT-PCR反应60分钟，然后采用PSEN1正向-EcoR1和PSEN1反向-EcoR1引物进行PCR，反应条件为94℃下3分钟，进行35次循环的94℃下45秒、62℃下30秒、68℃下2分钟，然后在68℃进行7分钟最后的延长步骤。扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶纯化，并直接测序或EcoR1克隆进pCDNA3，然后进行DNA纯化和测序。对于PSEN2的RT-PCR，使用下述引物(PSEN2-正向，5’-GCCATGCTCACTTTCATGGC-3’；PSEN2-逆向(SEQIDNO98)，5’-CACGACTGCGTCCAGTGACC-3’(SEQIDNO99)。使用Invitrogen逆转录系统(Invitrogen)和5μg的总-RNA按生产商的用法说明来完成逆转录反应。然后在以下条件下进行PCR反应94℃下3分钟，进行35次循环的94℃下45秒；62℃下30秒；68℃下2分钟，然后在68℃进行7分钟最后的延长步骤。扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶纯化，并直接测序或克隆进2.1-载体(Invitrogen)，然后进行DNA纯化和测序。猪的pSEN1和pSEN2cDNA序列被提交到GenBank(登记号分别为DQ853416和DQ853415)。BAC-杂交使用将[α-32P]dCTP并入到PCR中产生PSEN1-外显子8片段的Invitrogen的切口平移试剂盒来产生放射性探针。使用PSEN1-外显子8探针对猪染色体的高密度菌落BAC过滤器(Dr.P.D.Jong慷慨赠与)进行筛选。根据标准方法对过滤器进行预杂交、杂交、洗涤以及放射成像。定位阳性斑点并通过Zhang等描述的方法使用碱裂解法分离出阳性克隆的BACDNA。(1996).BAC克隆388G9含有PSEN1染色体序列并被用于内含子的序列生成。内含子序列信息的产生用位于外显子5，7，8和9并指向内含子的序列的引物对BAC克隆388G9进行测序。表8显示了所使用的引物。所有的外显子和边侧内含子的序列被作为缺口提交到GenBank进行保存(登记号DQ86246)。表8引物和实时PCR探针的序列SNP筛选使用引物(在表8的SNP-筛选应用中列出的引物)对外显子5，7，8和9以及边侧内含子序列进行PCR扩增。在50ngDNA的条件下对外显子5和边侧内含子序列进行扩增；94℃下3分钟，循环35次94℃，30秒；60℃，20秒；72℃，1分钟。在50ngDNA的条件下对外显子7和边侧内含子序列进行扩增；94℃下3分钟，循环35次94℃，20秒；58℃，20秒；72℃，1分钟。在50ngDNA的条件下对外显子8和边侧内含子序列进行扩增；94℃下3分钟，循环35次94℃下45秒；64℃下30秒；72℃下1分钟。在50ngDNA的条件下对外显子9和边侧内含子序列进行扩增；94℃下3分钟，循环35次94℃下20秒；58℃下20秒；72℃下1分钟。所有的PCR产物都在37℃下与exozap温育1小时并使用正向扩增引物进行测序。使用PolyBace对序列进行分析并在Consed中手工检查。杂交细胞定位猪-啮齿动物体细胞杂交板被用于PSEN1和PSEN2的物理作图(Yerle等，1996)。对于PSEN1，外显子9正向和反向引物2被用于探针片段的扩增。对于PSEN2，PCR引物(PSEN2外显子12F；5′-GTTTGTGTCTGACCCTCCTGCTGC-3’(SEQIDNO125)和PSEN2外显子12R；5′-CAGATGTAGAGCTGGTGGGGAGG-3’(SEQIDNO126))被用于探针片段的扩增。PCR是在总体积10μL的含有10ngDNA，1xPCR缓冲液，每种dNTP为2.5mM，每种引物为5pmol以及0.5U的Taq聚合酶(Bioline)的混合物中于下列条件下进行94℃下3min；35次循环94℃下20s65℃下20s以及72℃下20s，并且在72℃下进行5分钟最后的延长步骤。免疫组织化学将猪胚胎的脑浸固在福尔马林中，从各脑区域制成石蜡包埋的组织块。然后在涂层玻璃载片上获得10微米的冠状切片。将切片脱去石蜡并用蛋白酶K预处理6分钟。用BSA(1mg/ml)对载片封闭10分钟。使用EnVision+System-HRP-DAB(DAKO)进行PSEN1和PSEN2的免疫组织化学验证。抗-PSEN1抗体是一兔多克隆抗血清520(由Dr.PoulFraser，多伦多，加拿大，馈赠)，在以1∶100稀释后使用，2小时的温育时间。抗-PSEN2抗体是一鼠单克隆抗体，APS26，以1∶33稀释后使用，温育时间2小时。核在苏木精溶液中被复染色。载片用FaramountAqueousMountingMedium(DAKO)作最后的覆盖。实时定量RT-PCR分析使用TRIReagentTM(Sigma)按照制造商的教导，从60，80，100，和115天大的猪胚胎中分离出来自额叶皮层、小脑、海马组织、基底神经节和脑干的总RNA。对每种类型的组织和各妊娠时间采用3个单独的组织，这样共产生60个样品。使用Invitrogen逆转录系统(Invitrogen)和5μg的总-RNA按生产商的用法说明来完成逆转录反应。在ABI-PEprism7900序列检测系统(PEAppliedBiosystems)中使用分析和PCR扩增来进行定量的实时PCR。引物和MGB探针使用PrimerExpressSoftware2.0(PEAppliedBiosystems)设计得到，这样正向和反向引物均跨越外显子-外显子接合处。用VIC作为报告染料合成MGB探针。在采用不同对照基因进行初步筛选后，GAPDH被选作内源性对照，并用VIC作为报告染料合成MGB探针。引物和探针的细节列于表8中。分开制备出用于PSEN1，PSEN2，和GAPDH的混合物，它们由5μL2XUniversalPCRMasterMix，0.3μL的各引物(10μM)，0.25μL探针(5μM)，2μL5-倍稀释的cDNA模板，以及使总体积达到10μL而加入的H2O组成。在下述条件下完成实时PCR在50℃时2分钟，在95℃时10分钟，40循环的95℃15秒以及在60℃1分钟。对PSEN1，PSEN2，GAPDH，PCR均重复进行三次。在软件SDS2.2(PEAppliedBiosystems)中确定对应于PCR循环数的循环阈值(Ct)，此时PCR循环数是实时荧光发射时所达到的高于基线发射的阈值。为了比较各种脑组织中在不同发育阶段的表达模式，使用标准曲线法计算出GAPDH，PSEN1，和PSEN2的mRNA模板浓度。标准曲线是用8倍稀释的第115天的额叶皮层cDNA(4，2，1，0.5，0.25，0.125，和0.0625μL)来构建的。对各标准样品和实验样品计算出各扩增子的mRNA的量。统计分析对5个样品组织中PSEN1和PSEN2表达水平在不同妊娠时间的等同性进行测试来分析统计显著性，使用了独立的软件。采用的统计模型是成对固定的再分配随机检验(PairWiseFixedReallocationRandomisationTest)。未采取数据正态分布的假设，且使用平均值通过随机的统计显著性的方法对两组间表达上的差异进行了评价。概率的水平设定为以P＜0.05作为在统计上具有显著性，并且在每次比较中进行了50000次随机选择步骤。结果PSEN1和PSEN2cDNA以及蛋白质序列为了确定猪PSEN1的cDNA序列，基于啮齿动物，牛，和人PSEN1之间的保守5’和3’未翻译区域，我们设计了一套引物。使用RT-PCR，对代表全部猪PSEN1开放阅读框的cDNA进行扩增，克隆和测序。猪cDNA的全部序列同源于人PSEN1(90％)，但仅在短的分散区域内同源于人PSEN2。猪PSEN1蛋白质的长度为467个氨基酸，其与人和鼠的对应物的467个氨基酸具有很好的可比性(图28)。PSEN1的多氨基酸序列比对揭示了在猪和人之间存在92％的序列同一性(图28)。另外，在两种序列之间还观察到34个变化，其中11个为保守的。对猪和鼠的比较揭露了它们具有89％的序列同一性，且50个氨基酸的变化中有16个为保守的。牛PSEN1的长度为478个氨基酸，且与猪存在94％的序列同一性，28个变化中有12个为保守的，因此牛PSEN1是显示出与猪的对应物具有最高程度的同一性的PSEN1变体。在人PSEN1中的突变可导致阿尔茨海默病，并且值得注意的是在猪和人之间的氨基酸的变化中没有一个是位于已知导致阿尔茨海默病的位置。(图28)(www.molgen.ua.ac.be/ADMutations)。相比之下，在人PSEN1的包含一非致病的多态E318G的318位，一Q残基存在于与猪，牛和鼠PSEN1等同的位置[53]。另外两个在人PSEN1中存在的非致病的多态R35Q和F175S分别在猪PSEN1R和F中(图28)[54，55]。人PSEN2cDNA序列被用于blastNCBI猪数据库以及作为内部猪数据库，使得能够设计对应于推测的猪PSEN2的5’-末端编码区3’-非编码区的引物。这些引物对大约1.4kb的猪cDNA片段进行扩增，且序列分析揭示出于人PSEN2具有高的序列同源性(92％)，但仅在小的分散区域内同源于人PSEN1cDNA，表明PSEN2的猪直系同源得到了确认。对猪PSEN2开放阅读框的分析表明猪PSEN2蛋白质由448个氨基酸残基组成，这与人和鼠直向同源一样(图29)。PSEN2的多氨基酸序列比对揭示了在猪和人之间存在97.8％的序列同一性，并且在观察到的10个变化中的1个是保守的(图29)。对猪和鼠的比较显示出95％的序列同一性，20个变化中的8个是保守的。牛PSEN2的长度为449个氨基酸，且具有98.2％的序列同一性，8个变化中有4个为保守的。因此，如通在PSEN1中所观察到的，牛PSEN2蛋白质也显示出与与猪的对应物具有最高程度的同一性。并且，应当注意的是在不同物种的序列之间观察到的变化中没有一个是位于被确认为在阿尔茨海默病患者中发生突变的PSEN2位置(图29)(www.molgen.ua.ac.be/ADMutations)。在一非致病的多态的位置334处，P334R被确认是在人PSEN2中[54，56]，并且脯氨酸残基在猪cDNA中为保守的。猪PSEN1的氨基酸序列显示与猪PSEN2具有64％的同一性，且尤其是在跨膜域和C-末端内的氨基酸是保守的(数据未显示)。在猪PSEN1和PSEN2中位于跨膜域6(PSEN1中的D257以及PSEN2中的D263)和跨膜域7(PSEN1中的D385以及PSEN2中的D363)的两个天冬氨酸残基，以及“PAL”序列，(PSEN1中的P433，A434，L435以及PSEN2中的P414，A415，L416)均是保守的，这与这些残基在早老素的蛋白酶催化功能中的主要作用一致[54，57，58]。猪PSEN1和PSEN2的定位使用猪-啮齿动物体细胞杂交板来进行PSEN1和PSEN2基因的染色体定位(数据未显示)[59]。采用“对PCR数据进行解释”的程序(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/pcr/pcr.htm)进行的统计学评价揭示出PSEN1基因的染色体定位到染色体7q12-q26的概率为0.4494且相关性为1，PSEN2基因的染色体定位到染色体10p11-p16的概率为0.9959且相关性为0.7255。猪染色体7和10的特定区域分别与人染色体14和1具有同线性。这与将人PSEN1基因定位到14q24.3以及人PSEN2基因定位到1q31-q42相符。猪PSEN1的单核苷酸多态筛选为检查在猪PSEN1中的基因变异，我们在大的动物材料中对外显子5，7，8和9进行重新测序，该动物材料由900头兰德瑞斯/约克夏杂种母猪以及一由55头兰德瑞斯，杜洛克，约克夏和汉普夏种组成的猪品种组构成。选用这些外显子作序列分析是因为它们构成家族性阿尔茨海默病中突变的“热点”。然而，在4个外显子区域未发现SNP’s(数据未显示)。然后，我们将多态分析扩展到包括内含子的序列，这确认了在内含子8中58位的C/TSNP(DQ86246序列中的1163位)以及在52位和92位的两个C/T多态和位于内含子10内117位的G/A多态(在DQ86246中的1535，1575，和1600位)。基因型数据总结于表9和10中。除汉普夏(Hampshire)外所有的种在内含子8中，以及在内含子10的52和92位均为多态的，而仅约克夏(Yorkshire)种在内含子10的117位均为多态的。基因型频率与Hardy-Weinberg平衡一致，表明没有与SNPs相关的选择性的劣势。在处于发育过程中的猪脑中的PSEN表达已发现PSEN1和PSEN2在胚胎发育过程中被广泛表达，且在CNS中的表达概况得到了很好的表征[60-62]。这里，我们在从孕期为60，80，100和115天的猪胚胎脑中切出的海马结构，小脑、额叶皮层、基底神经节和脑干中测量mRNA表达水平，各时间点使用3个生物样品。E115天对应于正常的出生日。PCR分析重复3次。通过将GAPDH表达水平归一来满足对适合的内对照基因的要求，补偿由于与RNA完整性和加载样品有关的PCR间的变化。尽管有报道称在不同的组织中或处理中管家基因表达发生很大的变化，我们并未在5个不同的处于不同发育阶段的猪脑组织中发现任何显著不同的GAPDH的表达。用于对照GAPDH(R2＝0.98)，PSEN1(R2＝0.98)，和PSEN2(R2＝0.98)的标准曲线通过以Ct值对cDNA的logμL作图产生。回归线的斜率用于计算cDNA的量，从而计算各样品中的mRNA。所有的GAPDHcDNA在每种类型的组织中几乎都产生相同的Ct值(数据未显示)，从而PSEN1和PSEN2的mRNA表达水平被归一化到GAPDH表达水平。在实时PCR后的溴化乙锭染色确认了对相关PCR产物的特异扩增(数据未显示)。对PSEN1和PSEN2在4个时间点在所有5种组织中的表达进行了评价。然而，应当注意的是，对PSEN1和PSEN2两者而言，平均标准偏差是显著的，从而反应出在这些动物中的高异质性。在基底神经节中，PSEN1表达水平在不同孕期没有出现显著变化(图30)。在额叶皮层、小脑、海马组织中，PSEN1表达水平在孕115天时显著低于孕60天时(分别是P＝0.001，P＝0.036，以及P＝0.003)，在所述这些组织中降低了5，2，和3倍(图30)。另外，孕80天时在额叶皮层中的PSEN1表达也比孕60天时出现显著降低(P＝0.003)。类似地，PSEN1表达水平在海马组织随孕期的推移而逐渐降低(图30)。并且，在小脑中也发现相同的趋势，但表达水平的减少仅在第100天和115天之间(P＝0.015)以及在60天和115天之间(P＝0.036)显著。对PSEN2而言，在额叶皮层中未观察到差异表达。在海马组织中，唯一显著的变化是在孕60和80天之间观察到的在表达水平上的增加(P＝0.015)(图30)。在脑干中，PSEN2在孕60和80天之间也出现向上调节(P＝0.032)(图30)。在小脑和基底神经节中，PSEN2在孕60和80天之间出现向上调节((P＝0.003，以及P＝0.03)(图30)。当比较PSEN1和PSEN2的总体表达水平时，观察到的PSEN2表达水平比PSEN1表达水平约低3倍。综上所述，实时PCR分析显示出在胚胎脑发育中在不同脑室的PSEN1和PSEN2mRNA的表达水平的改变，算然小，但显著，这有可能反应出生物学的重要性。为了原位检查PSEN1和PSEN2蛋白质的定位，我们用PSEN1和PSEN2抗体对100天胚胎的脑切片进行免疫组织化学染色。PSEN1染色比所观察到的PSEN2染色在细胞体外更为强烈和可扩散(图31)。我们注意到所有PSEN2染色区域对于PSEN1染色也是阳性的(图31)。对其它的胚胎时间点或脑区域进行分析，在PSEN1和PSEN2染色的定位或强度上没有发现明显的改变(数据未显示)。细胞内的免疫染色被限定在具有不同的细胞核缺失的细胞质上。在CNS的所有部位都观察到了免疫染色，尤其是在神经元上，在星细胞上也一定程度地观察到了免疫染色(图31和数据未显示)。在皮层中，锥体细胞和非椎体细胞均被染色(图31)。此外所有的海马状突起CA子域以及微粒细胞为PSEN阳性(图31)。免疫组织化学分析证明了PSEN蛋白质处于大部分，如果不是全部的话，的神经元中。此外，根据在PSEN1和PSEN2功能中所观察到的冗余，所有的PSEN2染色的细胞类型对于PSEN1染色来讲都是阳性的[63，64]。表9在猪育种组的PSEN1内含子8中在位置1163(DQ86246)上的C/TSNP的基因型频率表10在猪育种组的PSEN1内含子10(DQ86246)中三个SNPs的基因型频率实施例4与三核苷酸重复序列相关疾病的模型动物引起人TNR疾病区在多数情况下在灵长类和啮齿动物基因组中是相同的[65-67]。然而，在啮齿动物中TNR区域通常含有明显较少的TNR单元并且多态更少。由于TNR序列快速演化并且可能在机能上影响染病的基因，在这些区域的变化有可能涉及到机能的多样化[65，68]。为了分析鉴定的人中引起TNR的区域如何猪基因组中发展，我们对猪的TNRs进行了分析。这里我们描述，根据TNR束的长度，猪TNRs通常作为啮齿动物和人之间的中间物出现，并描述了几种TNRs是多态性的。此外，在猪的几个基因座上的TNRs长度可与灵长类中通常确认的长度相当。基因组样品根据标准过程从不相关(无共同双亲以及祖辈双亲)的杜洛克(Duroc)，兰德瑞斯(Landrace)，汉普夏(Hampshire)，约克夏(Yorkshire)以及戈廷根猪(Goettingen)雄性小型猪中制备基因组DNA。使用盐析过程从EDTA稳定的血液中分离出DNA[69]。PCR和基因组DNA的测序为了对猪基因组TNR区域进行测序，对在鼠和人之间保守的边测序列进行了识别并设计出相应的PCR引物。在PCR中使用了50ng的杜洛克(Duroc)猪基因组DNA，条件为95℃30”，58℃30”，72℃1’，35次循环。除了使用1M甜菜碱和5％DMSO外，采用的是标准的taq聚合酶PCR条件。在琼脂糖凝胶电泳分析后，对预期大小的DNA进行纯化并测序。如果条带强度或测序结果经评价不足以进行进一步分析，则根据演变法或根据确定出的序列的嵌套来设计新的PCR引物。通过这种方案，使用下述优化的引物组来扩增基因组TNR区域(所有的PCR反应均进行35次循环，使用50ng基因组DNA)SCA1SCA1+，CAGCGCTCCCAGCTGGAGG(SEQIDNO127)；SCA1-，GGAYGTACTGGTTCTGCTGG(SEQIDNO128)；95℃30”，58℃30”，72℃1’用甜菜碱和DMSO.SCA2SCA2NyTRI-，GCCACCGTAGAGGAGGAGGAAG(SEQIDNO129)；SCA2TRI(+)，CTCACCATGTCGCTGAAGC(SEQIDNO130)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，58℃30”，72℃1’。SCA3SCA3-I7+，CCATGGGAATAGTTTTTCTCATG(SEQIDNO131)；SCA3外显子10(-)，GGTTGGCTTTTCACATGGATGTG(SEQIDNO132)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，58℃30”，72℃1’。SCA6SCA6nyTRI+，CGGCCACACGTGTCCTATTC(SEQIDNO133)；SCA6NYTRI-，GGCCGCTGGGGGCCGCTCG(SEQIDNO134)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，58℃30”，72℃1’。SCA7SCA7Tri(+)，GGAGCGGAAAGAATGTCGGAG(SEQIDNO135)；SCA7Tri(-)，CCCACAGATTCCACGACTGTC(SEQIDNO136)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，58℃30”，72℃1’。SCA17pTBP-，GAAGAGCTGTGGAGTCTGG(SEQIDNO137)；pTBP+，CTATCCATTTTGGAGGAGCAG(SEQIDNO138)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，58℃30”，72℃1’。DRPLADrpla-Ny+，GGAGGCCAGTCCACTGCTCAC(SEQIDNO139)；Drpla-Ny-，GGGAGACATGGCATAAGGGTG(SEQIDNO79)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，58℃30”，72℃1’。SMBAARTri+，X；ARTri-，X，94℃45”，58℃30”，72℃2’.HD，pHUNNYRE+，CCGCCATGGCGACCCTGGAAA(SEQIDNO140)；pHUNNYRE-，GGTGGCGGCTGAGGAGGCTG(SEQIDNO141)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，65℃30”，72℃1’。FMR1FMR1(Ny+1)，CGTTTCGGTTTCACTTCCGGTG(SEQIDNO142)；FMR1Zoo-，CCGCACTTCCACCACCAGCTC(SEQIDNO143)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，60℃30”，72℃1’。FMR2FMR2-Ny-，TGCGGCGGCAGCAGCCGCTAC(SEQIDNO144)；FMR2(Ny+2)，CCCCTGTGAGTGTGTAAGTGTG(SEQIDNO145)；使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，58℃30”，72℃1’。SCA12SCA12TRI(+)，GGGAGGAGCCTCGCCTTTAATG(SEQIDNO146)；SCA12Tri(-)，CGCGACAAAATGGTGCCTTTC(SEQIDNO147)，使用甜菜碱和DMSO进行95℃30”，58℃，30”，72℃1’。DMPKgDMPKpoly+，GCCCTGCTGCCTTCTCTAGGTC(SEQIDNO148)；gDMPKpoly-，CCCCAGCTCTAGCCCTGTGATC(SEQIDNO149)，94℃30”，64℃30”，72℃2’。DNA片段通过琼脂糖凝胶使用GFX柱(AmershamBiosciences)纯化，并根据标准步骤进行测序。从杜洛克(Duroc)，兰德瑞斯(Landrace)，汉普夏(Hampshire)，约克夏(Yorkshire)和戈廷根猪(Goettingen)雄性小型猪中基因组DNA中扩增DNA片段。在人(Homosapiens)(人)，黑猩猩(Pantroglodytes)(黑猩猩)，家犬(Canisfamiliaris)(狗)，褐家鼠(Rattusnorvegicus)(大鼠)，小家鼠(Musmusculus)(小鼠)以及短尾负鼠(Monodelphisdomestica)(负鼠)中TNRs的序列信息从位于NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes)的基因组浏览器中被提取。对具有延长TNRs的大母猪以及源于公猪的后代进行微卫星分析。在含有14头杜洛克(Duroc)公猪，611头兰德瑞斯(Landrace)和兰德瑞斯(Landrace)x约克夏(Yorkshire)杂交的大母猪以及来源于4头杜洛克(Duroc)公猪和前面提及的大母猪的349头后代的猪材料中通过微卫星分析进行不同亨廷顿等位基因长度的基因型分析。下列的引物被使用；FwFAM-CCGCCATGGCGACCCTGGAAA(SEQIDNO150)，RwGGTGGCGGCTGAGGAGGCTG(SEQIDNO151).在总体积为10μL的混合物中对扩增子进行扩增，其中混合物含有50ng的基因组DNA，每种引物5pmol，2.5mMdNTPs，1μL的10x反应缓冲液，0.5μLDMSO，2.5μL4M甜菜碱以及5UTaqDNA聚合酶(AppliedBiosystems，USA)。PCR扩增如下在95℃下进行初始变性4分钟，然后进行如下的35次循环在95℃变性30秒，64℃进行30sec，72℃进行1min。在最后的循环后加上5分钟的72℃的延长步骤。通过甲酰胺对PCR产物进行变性并在3730DNAAnalyzer(AppliedBiosystems，USA)上使用推荐的方案进行电泳。使用SoftwareVer3.0(AppliedBiosystems，USA)完成对DNA片段的尺寸分析。内部大小标准物GeneScan-LIZ500(AppliedBiosystems，USA)被用于等位基因的尺寸判定。登记号确定的猪TNR区域，边侧序列被提交到GenBank并被分配下述的登记号SCA1(DQ915251，DQ915252)，SCA2(DQ915254)，SCA3(DQ915255，DQ915256)，SCA6(DQ915259，DQ915260，DQ915261)，SCA7(DQ915262)，SCA17(DQ915258)，DRPLA(DQ915263，DQ915264)，SMBA(DQ915257)，HD(DQ915274，DQ915275，DQ915276，DQ915277，DQ915278，DQ915279，DQ915280，DQ915281，DQ915282)，FMR1(DQ915269，DQ915270，DQ915271，DQ915272，DQ915273)，FMR2(DQ915268)，SCA12(DQ915265，DQ915266，DQ915267)，DMPK(DQ915253).结果为了对与引起人疾病TNR同源的猪基因组进行测序，我们首先对在鼠和人之间高度保守的边测序列进行了识别。使用该PCR方法对与引起人疾病的TNR相对应的12头猪基因组基因座进行扩增。被识别的TNRs位于编码区域和5′UTRs。根据Genbank中可用的EST序列，使用引物对DMPK3’-UTRTNR进行扩增。为了在不同猪品种中寻找TNR多态，我们使用了杜洛克(Duroc)，兰德瑞斯(Landrace)，汉普夏(Hampshire)，约克夏(Yorkshire)以及戈廷根(Goettingen)小型猪。对于每一个猪品种，为确保共同等位基因的检测(等位基因频率＞10％)，需要对多个动物进行分析。猪基因组序列同源于人未编码的TNR扩展区域。我们首先着重于同源于人未编码TNRs的基因组序列。DMPK在人强直性肌营养不良蛋白质激酶基因DMPK的3′-UTR中，存在一种CTGTNR[19-23]。该TNR的正常大小是在5～37。从高于50到几千CTG重复的扩张导致强直性肌营养不良。在所有研究的猪种群(杜洛克(Duroc)，兰德瑞斯(Landrace)，约克夏(Yorkshire)，汉普夏(Hampshire)，和小型猪(图32)中均由4个CTG重复构成CTGTNR被确认为在猪DMPK中的相同位置。未发现在DMPKTNR中有长度的不同(图32)。重复数比在人中观察到的最低CTG重复(5个CTG)低。在鼠中，DMPK的TNR序列是由2CAG重复构成，并以单个CTG重复作为边侧(图32)。在狗和大鼠中，存在单个CTG，并以另一种类型的TNRs作为边侧(图32)。SCA12在人PPP2R2B基因的5′-UTR内的SCA12CAGTNR一般在7-28个重复的大小之间变化，并形成在65-78TNRs以上的扩展形式[27]。三个由8，9，和10个CAG重复构成的等位基因被证实存在于猪种群中(图32)。在杜洛克(Duroc)中最高丰度的等位基因含有8个CAG重复，而在汉普夏(Hampshire)最高丰度的等位基因含有10个CAG重复(图32)。含有9个CAG重复的等位基因是在兰德瑞斯(Landrace)，约克夏(Yorkshire)和小型猪中观察到的唯一的等位基因(图32)。在猪SCA12基因座中存在的长的未中断的CAGTNRs不同于小鼠和大鼠SCA12基因座，其由被CAC和GAG三联体分隔的CAGTNRs(图32)组成。特别地，猪SCA12等位基因的长度相当于以及甚至高于在人中确认的SCA12等位基因的长度(图32)。FMR1/FRAXA在人FMR1基因的启动子区域，通常存在6～52CGG个重复[24，25]。在55-200重复范围内的扩展导致前突变，而在200-几千重复范围内的全突变导致脆性X综合症。在杜洛克(Duroc)中FMR1TNR区域的序列显示存在两种等位基因具有频率90％的14CGG重复等位基因以及具有频率10％的13CGG重复等位基因(图32)。在其它猪品种内的FMR1TNR的序列分析显示了高度的FMR1TNR长度多态。在杜洛克(Duroc)，汉普夏(Hampshire)以及约克夏(Yorkshire)中确认存在15CGG重复等位基因(图32)。该等位基因在约克夏(Yorkshire)中是最常见的，而在汉普夏(Hampshire)中还确认存在9CAG重复等位基因以及在杜洛克(Duroc)和小型猪中存在12CAG重复等位基因。在兰德瑞斯(Landrace)中没有观察到等位基因多态。所有的猪FMR1等位基因长于同源的鼠TNR序列，其是由被CGA分隔的6CGG重复和2CGG重复所组成(图32)。狗FMR1TNR具有的尺寸类似于猪TNR(图32)。在最常见的人FMR1TNR等位基因中，两组CGG重复被AGG三联体所分隔(图32)。此外黑猩猩的FMR1TNR为高度多态并包括AGG三联体中断[70]。有趣的是，猪FMR1TNR长度超过倾向于扩展的人FMR1CGGTNR中存在的最小长度。FMR2/FRAXE在人FMR2基因的5′末端的TNR中CCG重复的数目在6～35内变化[26]。含有61～200重复的扩展导致前突变，超过200重复的扩展导致完全突变和脆性X综合症。发现在所有被分析的品种中的猪FMR2基因中的同源区域含有7CCG重复(图32)。猪TNR长度超过了由4CCG重复组成的同源鼠TNR的长度(图32)。此外，猪CCGTNR的长度要长于在人中确认的最小CCG等位基因长度(图32)。猪基因组序列同源于编码人多谷氨酰胺的TNR扩展区域。下面我们着重于九个猪基因座上的编码多谷氨酰胺的TNR序列。SCA1在人SCA1基因座中，ATX1蛋白质中的CAGTNR扩展引起了脊髓小脑型共济失调[71，73]。人SCA1TNR区域的特征是存在12个CAG重复后面紧接2个CAT重复，其边侧带有一个CAG三联体[28]。易于扩展的CAGTNR通常是由6～39个重复组成并且扩展形式由41～81个重复组成。猪SCA1TNR是由两个CAG个重复组成，这两个重复被八个编码脯氨酸的三联体分隔(图33)。然而，在小型猪中检测到变体；最常见的等位基因具有2个CAGTNR(图33)。狗SCA1区域包括6个CAG重复(图33)。小鼠和大鼠同源区域是由两个CAG个重复和编码三个脯氨酸的三联体组成(图33)。因此，就CAG重复数目，猪和啮齿动物的SCA1TNRs是类似的，但是不同于同源的人TNR(图33)。然而，由于存在许多脯氨酸密码子(CCX)，与啮齿动物中的TNR相比猪的SCA1TNR复杂度被提高了。SCA2影响ATX2蛋白质的SCA2TNR扩展导致了脊髓小脑型共济失调[73]。该TNR通常含有15～30个CAG重复并且扩展形式的范围在35～59三联体[29]。猪基因座是由被两个CAA分隔的7CAG重复所组成(图33)。相应地，该区域编码一串九个多谷氨酰胺。在猪SCA2TNR区域未观察到任何形式的多态。狗SCA2TNR在多谷氨酰胺串中具有脯氨酸中断(图33)。同源啮齿动物SCA2TNR是由两个CAG重复组成，这两个重复被一个编码脯氨酸的三联体分隔(图33)。SCA3在人SCA3基因座中，在共济失调蛋白-3基因中超过54个重复的CAGTNR扩增导致共济失调，而CAG重复的正常数目是在12～36之间[30-32]。在猪中，在杜洛克(Duroc)，汉普夏(Hampshire)和兰德瑞斯(Landrace)中确认存在五个CAGTNR等位基因，而在约克夏(Yorkshire)和小型猪中确认存在六个CAGTNR等位基因(图33)。就编码的多谷氨酰胺数目，猪SCA3TNR区域与鼠SCA3TNR区域是同源的(图33)并且低于其人中的对应物中的临界数目。狗SCA3TNR对12谷酰胺编码但包括几个CAA分隔的三联体(图33)。SCA6在CACNA1A电压依赖性钙通道内的SCA6TNR扩展导致共济失调[33]。TNRs的正常数目是在4～18且21～27的TNRs扩展数目是疾病起因。在猪中，确认了一个由5和4个CAG重复构成的等位基因，其通过三联体分隔，从而编码由10个多谷氨酰胺组成的串(图33)。在小型猪中，确认了由7或9个CAG重复其后有CAA三联体和4个CAG重复构成的较长的SCA6等位基因(图33)。这些等位基因分别编码12多谷氨酰胺串和14多谷氨酰胺串。由猪SCA6TNR区域编码的多谷氨酰胺串在长度上与由人SCA6序列编码的正常范围具可比性，而在小型猪中确认的14多谷氨酰胺串与更为常见的人等位基因的上端范围相符。在狗中，存在10个CAGSCA6TNR(图33)。我们注意到在啮齿动物中无SCA6TNR，而在啮齿动物与猪，狗，和灵长类之间的在特定的基因组位置存在CACNA1A序列中的高度趋异。SCA7在共济失调蛋白-7蛋白质的N-末端内的人SCA7的TNR通常含有7～35个CAG重复[54]。引起疾病的扩展含37～200重复。猪SCA7位点的TNR含有5个CAG重复，但在种群中未观察到多态现象(图33)。类似地，鼠SCA7基因座的TNR含有5个CAG重复(图33)。有趣的是，具有5个CAG重复的SCA7等位基因也在人中被确认。需注意的是，SCA7CAG重复侧翼为聚丙胺酸的串以及富谷酰胺和脯氨酸串，其在检验的哺乳动物基因组之间高度可变(数据未显示)。DRPLA在人萎缩蛋白-1基因内中的CAG扩展导致了齿状核红核苍白球丘脑下部萎缩(DRPLA)[36]。重复性的CAG重复的正常重复范围是从3～25，而在有DRPLA的患者中等位基因的数目已扩展到49～88个重复数目。最常见的天然的人等位基因编码17个多谷氨酰胺串。在猪萎缩蛋白-1TNR中，确认出了以多个CAG和CAA三联体为边侧的6个CAG重复，这产生一编码14个多谷氨酰胺的等位基因(图33)。并且，在小型猪中，观察到了具有7个CAG的等位基因，这产生一编码15个多谷氨酰胺的等位基因(图33)。这意味着猪萎缩蛋白-1多谷氨酰胺串的长度高于在人中观察到的最短长度。小鼠萎缩蛋白-1基因的TNR编码六个谷酰胺，其具有一个中断脯氨酸，大鼠基因萎缩蛋白-1基因的TNR编码被脯氨酸残基高度中断的11谷酰胺(图33)。狗萎缩蛋白-1TNR对12多谷氨酰胺串进行了编码(图33)。在哺乳动物中，在检验的哺乳动物基因组之间，萎缩蛋白-1TNR的边侧富组氨酸串(数据未显示)。SCA17在TATA盒结合蛋白(TBP)基因中的CAG扩展是导致共济失调的SCA17基因型的原因[35]。人TNR区域是由两组被多重CAA和CAG三联体分隔的CAG重复所组成。扩展通常是从两个CAG组中的较大开始。编码的多谷氨酰胺的正常串是在29～42内变化，而在SCA17患者中已证实发现在47～55变化的多谷氨酰胺串。猪SCA17TNR区域编码26个多谷氨酰胺，从而是在猪中识别的最大的编码多谷氨酰胺的TNR(图33)。猪SCA17序列是由四组CAGTNRs构成，其中间插入有CAA三联体(图33)。最长的CAG组含有10个CAGs。在猪SCA17中未识别出等位基因多态。相对比的是，鼠SCA17TNR编码13个多谷氨酰胺并且在一个串中最多含三个三联体(图33)。狗SCA17TNR对22谷酰胺编码但包括几个丙胺酸中断(图33)。SBMA脊髓延髓肌肉萎缩症(Kennedy病)是由X-染色体上的雄激素受体(AR)基因的外显子1内的CAG重复扩展所导致的[37]。人CAGTNR的正常长度是在11～33CAG拷贝并且在生病的个体中，扩展范围从38～62。在猪中识别了被单个CTG亮氨酸三联体中断的编码7多谷氨酰胺的AR等位基因(图33)。在不同的猪品种中未观察到TNR变化。在小鼠和大鼠中，ARTNR序列编码3谷酰胺，其分别被单个AGG精氨酸三联体或CGG精氨酸三联体中断(图33)。狗ARTNR是由10CAG重复组成(图33)。需要注意的是，在哺乳动物中，在检验的哺乳动物基因组之间TNR侧翼为高多态的富组氨酸和谷酰胺串(数据未显示)。HD在亨廷顿基因中的CAGTNR处于编码区域的5′-末端。通常，该基因含有6～35个CAG重复且在亨廷顿氏症患者中，存在超过35个CAG重复单元[74]。在猪的亨廷顿TNR区域中观察到大程度的变化(图33)。该差异不仅是由于可变的CAG重复单元数目，而且是由于缺少或存在CAA三联体，其可将连续的CAG群分隔成两组(图33)。编码13～24多谷氨酰胺大小的等位基因被识别。非常有趣的是，在杜洛克(Duroc)中，由21个未中断CAGs，一个CAA三联体以及两个CAGs形成的串编码总共24个多谷氨酰胺(图33)的等位基因被识别。该等位基因代表了在猪TNRs分析中所识别的最大数目的未中断CAGs。在杜洛克(Duroc)中明确识别出长的等位基因并且其具有20％的等位基因频率。小型猪亨廷顿基因以及其多态在前面进行了描述[75]。由猪的亨廷顿TNR编码的多谷氨酰胺数目的确可与人的重复数目相当并且对于24个多谷氨酰胺等位基因来讲，该数目甚至高于在人亨廷顿等位基因中最常发现的多谷氨酰胺数目。相比之下，小鼠亨廷顿TNR区域编码被一个CAA三联体中断的七个多谷氨酰胺并且狗的TNR区域编码10个多谷氨酰胺(图33)。在检验的哺乳动物基因组之间TNR的边侧为多态的富组氨酸和谷酰胺串(数据未显示)。猪的亨廷顿TNR长度是减数分裂稳定的。因为长的未中断的CAGTNR序列存在于杜洛克(Duroc)猪的亨廷顿基因中，所有我们下一步检查是否该序列被稳定遗传或易于回缩或扩展。处于此目的，我们使用由与兰德瑞斯(Landrace)杂交的杜洛克(Duroc)公猪和兰德瑞斯(Landrace)/约克夏(Yorkshire)杂交的母猪的猪材料。不同亨廷顿的等位基因长度的基因型通过微卫星分析测得。从公猪组中，四头杂交公猪被识别分别具有对应于24和17谷酰胺的161bp片段和140bp片段。4头杂交公猪的基因型结果通过DNA测序被验证。来自于育种方案中的611母猪群的基因型数据表明等位基因也存在于纯的兰德瑞斯(Landrace)和约克夏(Yorkshire)品种。此外，在纯品种中不存在的对14和15个谷酰胺编码的两种新亨廷顿等位基因在母猪群中也被识别(表11)。此外编码24多谷氨酰胺的等位基因也存在于母猪种群中，然而仅以较低的频率存在(0.3％，表11)。有趣的是，未确认有尺寸小于13个多谷氨酰胺或多谷氨酰胺数为19，20，21，22，或23的等位基因(表1，数据未显示)。然而，由于母猪种群并不是完全无关的，因此等位基因频率的计算仅仅是指示性的。基因型后代组由349头猪组成。所有的349只动物具有的基因型均与母本和父本亨廷顿等位基因一致而无任何TNR收缩或扩展(表12)。因此，我们未能发现亨廷顿TNR不能稳定传递的任何证据。表11.猪亨廷顿(CAG)24和(CAG)17等位基因的减数分裂稳定性。雌性单倍型父本基因型为140/161。母猪单倍型与频率(F)一起在育种群内被显示。对于所有的后代而言，基因型可根据父本和母本的未受到扩展或收缩的等位基因的传递而指定。对总共349个后代基因定型。基因型可根据被分析片段的长度看出。Q表示从TNR等位基因编码的谷酰胺数目。N表示具有所示的等位基因的后代数目。实施例5软骨发育异常的动物模型与生长板软骨相比，只有非常有限的知识是关于在永久性软骨，如气管中胶原X的存在。我们将编码胶原X全长cDNA从猪气管中分离出来，这表明胶原X不是只存在于通常存在于长骨中的钙化基质的发育障碍的软骨细胞中。然而，如先前所述，在气管中特别是在老年个体的气管中存在人胶原X，在老年个体中，随着年龄的增长发生气管软骨骨化。此外，在发育的鼠气管软骨中，胶原X被限定在软骨的周边未钙化的区域[76]，这表明胶原X除提供软骨骨化相关的分子结构环境外还扮演重要的作用，然而这在人中没有得到证实[77]。材料和方法RNA分离用于COLA的RT-PCR克隆的猪气管组织由成年猪中获取。转移组织后将其切成碎片并在液氮中研磨成粉。通过Rneasy法(Qiagen)分离出总RNA。RNA样品的完整性通过核醣体的RNA在1.5％琼脂糖凝胶上的溴化乙锭染色来确认。DNA构建物猪COL10A1的生成通过下面的方式完成将来源于成年猪气管的RNA用于cDNA合成，其使用的条件是将5μg的总RNA与1μL的oligo(dT)12-18(500μg/mL)以及DEPC处理的H2O混合至最终体积12μL。将混合物在70℃下温育10分钟，随后加入4μL的5x第一链缓冲液，2μL的0.1mMDTT，1μL的10mMdNTPmix以及1μL(200U/μL)的SuperscriptII(Invitrogen)并将样品在42℃下进一步温育1小时，随后在70℃下进行15分钟的失活。用于RT-PCR克隆的寡核苷酸是来源于基因组COL10A1序列(登记号AF222861)并且还含有用于随后克隆的接头(正义引物中的Bgl和反义引物中的EcoRI)。RT-PCR反应混合物含有2.5μLcDNA，1.5mMMgCl2，0.2mMdNTP，每种引物10pmol(COL-F5’-AACAGATCTATGCTGCCACAAACAGCCCTTTTGCT-3’(SEQIDNO152)以及COL-R5’-GCAGAATTCTCACATTGGAGCCACTAGGAATCCT-3’(SEQIDNO153)，以及1UPhusionFidelityDNA聚合酶(Finnzymes)，总体积为25μl，其使用下述条件在98℃下变性2分钟，随后30次循环在98℃变性10sec，60℃进行30sec并且在72℃进行1min。在72℃最终延长5分钟而结束PCR程序。PCR是在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中完成。将扩增的产物涂加载在1％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上分离出约2000bp的荧光带并且使用标准过程克隆到2.1-TOPO载体(Invitrogen，CA)中，并使用标准过程进行正向和逆向测序以确保其含有CoL10A1扩增子。COL10A1质粒DNA使用EcoRI进行消化并连接到使用EcoRI预消化的phCMV1(GeneTherapySystemsInc.)表达载体中。通过测序以确定COL10A1被成功克隆到phCMV1载体中。为了创建用于精细胞温育的DNA，需进行大规模的PCR反应。在最终体积为25μL中在PCRSystem9700(AppliedBiosystems)中进行PCR反应，25μL中含有5μL5xPhusionHF缓冲液，2μLdNTP(各2.5mM)0.63μL正向和反向引物5pmol，0.1μLPhusionDNA聚合酶(2U/μL)，1μLCOL10A1-CMV1模板以及15.6μLH2O。PCR反应包括在98℃下进行初始变性30秒，随后进行30循环在98℃下变性10秒，在74℃下退火30秒并在72℃延长95秒，最后延长步骤在72℃进行7分钟。下面的引物用于扩增COL10A1构建物加上侧翼CMV启动子、内含子/增强序列以及SVpolyA，产生约3600bp的片段。phCMVF5’-GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGG-3’(SEQIDNO154)。phCMVR5’-GGGTGATGGTTCACGTAGTGGGC-3’(SEQIDNO155)为了对产生的PCR产物进行纯化，使用了“高纯PCR产物纯化试剂盒”(Roche)。在整个纯化过程中遵循供应商的用法说明。对PCR纯化片段进行测序以检查序列中的错误。精子制备和DNA摄取从8个不同公猪收集第一次和第二次射出的精液总共得到16个精液部分。所有的精子的部分在清洗步骤前均具有90的初始运动力。通过在授精缓冲液(FB)中洗精子而快速去除精液，其中授精缓冲液由溶解于1升无菌水中的56.1g葡萄糖，3.5gEDTA(2H2O)，3.5g柠檬酸钠(2H2O)，和1.1g碳酸氢钠组成。然后加入6mg/mlBSA(FractionV，Sigma)。简言之，向5mL未稀释的精液中加入预热至37℃的5mLFB/BSA，并在室温下放置5分钟。其次，在室温下将FB/BSA加入到50ml并在500g于室温下离心分离10分钟。去除上清液并将精子再悬浮于室温的50mLFB/BSA中并在500g于17℃下进一步离心分离，此后再次去除上清液并将精子再悬浮在15mL的FB/BSA中。然后，为了选择最佳的供体细胞，对来自不同公猪的精子在光学显微镜下迅速检查。在洗涤步骤后具有最高精细胞运动力的源自公猪的精细胞被选作用于后续转基因步骤中的载体。并且，对精子进行了计数。将来自供体公猪的1x109个精细胞与线性化的CoL10A1DNA片段以0.4μgDNA/106精子的浓度下在120mLFB/BSA的悬浮液中在17℃下温育100分钟。每20分钟将容器倒置以防止精子发生沉淀。最后，在室温下温育混合物10分钟并用于对一头自然发情的母猪进行人工授精。动物从禁绝了2天的驯化的丹麦兰德瑞斯(Landrace)公猪收集精液。根据其自然发情期选择重约140kg的一头受体母猪(DanishLandracexYorkshire)并按照标准的受精步骤用于人工授精(1x109DNA处理的精子/母猪)。授精是在DIAS的当地厩完成。在受精后24和42天检查这头母猪是否怀孕，结果显示其成功受孕。在孕期终结后，自然产出6头小公猪和6头小母猪并从出生3天后的小猪上取得血液样品到EDTA和血清试管中。由于经济原因，9头动物被屠宰并保留2头小公猪和1头小母猪供后续研究。在7个月时将母猪屠宰掉，因为出现了严重的表型改变。动物照料和实验步骤符合当地的，全国的和欧盟的指南。DNA和RNA研究从12头小型猪的EDTA稳定的血液样品中产生DNA。RNA是从被屠宰母猪的快速冷冻组织(心、肾、肝、肺、皮肤、卵巢、背最长肌、半膜肌以及肱三头肌)中产生。为了避免任何污染，所有的DNA和RNA样品是在特别清洁的实验设备中，在高度严格的实验条件下采用标准程序取得。PCR以及RT-PCR为了确保转基因的存在，从每个动物的血液样品中分离出的50ng的基因组DNA使用下面的引物进行扩增phCMV_430F5’-GTCTCCACCCCATTGACGTC-3’(SEQIDNO156)以及phCMV_646R5’-GGATCGGTCCCGGTGTCTTC-3’(SEQIDNO157)，其使用下面的样品混合物产生217bp的片段1μL10x不含MgCl2的缓冲液，0.4μL50mMMgCl2，每种引物10pmol，5mMdNTP-mix以及0.5UDynazymeExtDNA聚合酶。反应进行的总体积是10μL且在PCR系统9700(AppliedBiosystems)中在下述条件下以降落PCR方式完成在95℃下进行初始变性3分钟，每次循环在在95℃变性30秒，以0.5℃的减量从62℃降落至57℃进行20秒，然后72℃延长1分钟。进一步进行如下的35次循环在95℃变性30秒，在57℃退火20秒，在72℃延长1分钟，最后在72℃延长7分钟结束。Southern印迹分析对来源于染病母猪的背最长肌的DNA进行Southern印迹分析可确定转基因整合。来源于染病母猪和野生型猪的10μg基因组DNA分别采用BglII消化和BglII及BamHI进行双重消化，并在0.9％的琼脂糖凝胶上进行分离，在尼龙膜上进行印记并用[32P]-标记的来源于用下面的引物PCR扩增的胶原XNC1片段检测NC1_F5′-GCTCTAGAGGTCCCACCCACCCGAAGG-3’(SEQIDNO158)和NC1_R5’-TCTCTAGATCACATTGGAGCCACTACGAA-3’(SEQIDNO159)。组织病理学从从生长板(骺端)的右前腿组织，和大腿骨的干骺端尺骨和桡骨以及关节区域，包括肩，肘，和腕关节-骺软骨复合物一起取样。从两个后腿从髋和膝关节，即从股骨和胫骨采集类似的组织样品。另外也从3根肋骨的骨-软骨结合处取样进行组织学研究。所有的组织均固定在10％的中性缓冲福尔马林中，然后在含3.3％甲醛和17％甲酸的溶液中脱钙2周。通过梯度浓度的乙醇和二甲苯处理组织，并包埋在固体石腊块中。用苏木精和曙红(HE)对4-5μ的组织切片进行染色，以及在选择的情况下用VanGieson对胶原进行染色和用番红O对软骨基质进行染色[78，79]。结果精子介导的基因转移以及基因修饰的猪为了建立可使胶原X的功能作用得以清楚明白地显示出来的转基因猪，创建了一COL10A1cDNA野生型构建物。有趣的是，猪COL10A1cDNA是采用从早先已知的COL10A1序列产生的引物从气管分离出来的[80]。cDNA片段首先被克隆进2.1-TOPO载体中，随后顺利地移至phCMV1表达载体促进从CMV启动子组成型表达。为了阻止在SMGT后可能发生的重要元件的切断，在转基因过程中采用的COL10A1DNA片段，包括在CMV启动子5’和3’引导端的另外的核苷酸和polyA片段，它们构成了总长约3600bp的片段，图34。开始时，使用了8头丹麦兰德瑞斯(Landrace)公猪作为精子供体，且选用在用于除去精液而进行的最初清洗步骤后表现出最高的运动力精液部分用于后续的DNA温育步骤。在孕期结束后，自然生产出12头看起来正常的小猪，且自血液分离的DNA的PCR分析，扩增了217bp的DNA片段，其位于构建物的5’-末端phCMV片段处，表明所有的12头小猪均含有转基因，见图35。然而，由于经济因素，仅保留了3头小猪进行表型研究。表型描述在大约51/2个月龄时，3只转基因动物中的一只母猪发育出了跛的临床表现。该母猪的运动受到抑制，这主要由前腿运动困难产生，其步态蹒跚，背弯，然而这可能是出于对前腿异常的补偿。这一迹象在大约7个月龄时有轻度加重，此时，该母猪仅在受迫下才行走，而它会立即弯下肘，并用肘进行行走。然而，出于伦理方面的原因，在此时将该母猪进行屠宰。Southern印迹分析如图36中所示，在取自染病母猪和一正常野生型猪的背最长肌的组织上进行的Southern印迹分析揭示出当用BglII和BamHI消化时，使用全部胶原NCl区域作为放射标记探针，相比于对照，在染病猪中出现了额外的条带。因此，这引导我们得出转基因已整合到染病猪的基因组中的结论。不幸的是，BglII仅在有限程度下消化基因组DNA，因此单独使用该酶进行的单一消化中看不出差别额外条带的差异(泳道1和2)。表达分析COL10A1构建物的表达使用位于COL10A1外显子2和COL10A1外显子3的引物通过对总RNA进行RT-PCR完成，所述总RNA从肱三头肌，卵巢，肾，皮肤，肝，肺，背最长肌，半膜肌，心脏，以及野生型对照的肝，脾，肾，肺，和心脏分离。RT-PCR分析揭示出胶原X在染病母猪的肾，肺，和心脏中的表达，尽管在肾中仅存在非常有限量的转录，图37。然而，由于PCR仅为定性的，尽管相同量的总RNA被用于cDNA的合成，但对样品中表达水平的判断应当当心。并且，在野生型对照组织中不存在CoL10A1的表达。组织病理学构成肘关节近端部分的肱骨滑车的关节-骺区域显示出很大的改变，见图38。软骨保留了肥大的软骨细胞。在保留的软骨区域内，常见有形成裂缝，并存在深度不规则的填充有纤维蛋白的腔，和嗜曙红细胞条纹。然而，尺骨和桡骨两者的远端生长板为不规则地含有保留有软骨的局部区域。在肋骨，后腿的关节-骺区域或生长板的切片内不存在病变。因此，综上所述，COL10A1转基因的整合和表达导致软骨发育不良的表型，其尤其影响母猪的两前肢。在转基因母猪中存在的改变与骨软骨病类似，这种病已知对较年轻的动物产生影响，其具有的特征是具有与在该母猪前腿中观察到的类似的关节-骺软骨复合体的损伤[41]。参考文献1.BelshJMALSdiagnosticcriteriaofElEscorialRevisiteddotheymeettheneedsofcliniciansaswellasresearchers？AmyotrophLateralSclerOtherMotorNeuronDisord2000，1Suppl1S57-S60.2.Everett，C.M.andN.W.Wood，Trinucleotiderepeatsandneurodegenerativedisease.Brain，2004.127(Pt11)p.2385-405.3.Pearson，C.E.，K.NicholEdamura，andJ.D.Cleary，Repeatinstabilitymechanismsofdynamicmutations.NatRevGenet，2005.6(10)p.729-42.4.Jin，P.，etal.，RNA-mediatedneurodegenerationcausedbythefragileXpremutationrCGGrepeatsinDrosophila.Neuron，2003.39(5)p.739-47.5.Saveliev，A.，etal.，DNAtripletrepeatsmediateheterochromatin-protein-1-sensitivevariegatedgenesilencing.Nature，2003.422(6934)p.909-13.6.Cho，D.H.，etal.，AntisensetranscriptionandheterochromatinattheDM1CTGrepeatsareconstrainedbyCTCF.MolCell，2005.20(3)p.483-9.7.Galvao，R.，etal.，Tripletrepeats，RNAsecondarystructureandtoxicgain-of-functionmodelsforpathogenesis.BrainResBull，2001.56(3-4)p.191-201.8.Wells，R.D.，Molecularbasisofgeneticinstabilityoftripletrepeats.JBiolChem，1996.271(6)p.2875-8.9.Mirkin，S.M.andE.V.Smirnova，Positionedtoexpand.NatGenet，2002.31(1)p.5-6.10.Cleary，J.D.，etal.，Evidenceofcis-actingfactorsinreplication-mediatedtrinucleotiderepeatinstabilityinprimatecells.NatGenet，2002.31(1)p.37-46.11.Nenguke，T.，etal.，CandidateDNAreplicationinitiationregionsathumantrinucleotiderepeatdiseaseloci.HumMolGenet，2003.12(9)p.1021-8.12.Michlewski，G.andW.J.Krzyzosiak，MoleculararchitectureofCAGrepeatsinhumandiseaserelatedtranscripts.JMolBiol，2004.340(4)p.665-79.13.Andres，A.M.，etal.，DynamicsofCAGrepeatlocirevealedbytheanalysisoftheirvariability.HumMutat，2003.21(1)p.61-70.14.Brinkmann，B.，etal.，Mutationrateinhumanmicrosatellitesinfluenceofthestructureandlengthofthetandemrepeat.AmJHumGenet，1998.62(6)p.1408-15.15.Mulvihill，D.J.，etal.，EffectofCATorAGGinterruptionsandCpGmethylationonnucleosomeassemblyupontrinucleotiderepeatsonspinocerebellarataxia，type1andfragileXsyndrome.JBiolChem，2005.280(6)p.4498-503.16.Lin，Y.，V.Dion，andJ.H.Wilson，TranscriptionpromotescontractionofCAGrepeattractsinhumancells.NatStructMolBiol，2006.13(2)p.179-80.17.Lavedan，C.N.，L.Garrett，andR.L.Nussbaum，Trinucleotiderepeats(CGG)22TGG(CGG)43TGG(CGG)21fromthefragileXgeneremainstableintransgenicmice.HumGenet，1997.100(3-4)p.407-14.18.Libby，R.T.，etal.，GenomiccontextdrivesSCA7CAGrepeatinstability，whileexpressedSCA7cDNAsareintergenerationallyandsomaticallystableintransgenicmice.HumMolGenet，2003.12(1)p.41-50.19.Brook，J.D.，etal.，Molecularbasisofmyotonicdystrophyexpansionofatrinucleotide(CTG)repeatatthe3′endofatranscriptencodingaproteinkinasefamilymember.Cell，1992.69(2)p.385.20.Harley，H.G.，etal.，ExpansionofanunstableDNAregionandphenotypicvariationinmyotonicdystrophy.Nature，1992.355(6360)p.545-6.21.Mahadevan，M.，etal.，MyotonicdystrophymutationanunstableCTGrepeatinthe3′untranslatedregionofthegene.Science，1992.255(5049)p.1253-5.22.Fu，Y.H.，etal.，Anunstabletripletrepeatinagenerelatedtomyotonicmusculardystrophy.Science，1992.255(5049)p.1256-8.23.Tsilfidis，C.，etal.，CorrelationbetweenCTGtrinucleotiderepeatlengthandfrequencyofseverecongenitalmyotonicdystrophyNatGenet，1992.1(3)p.192-5.24.Fu，Y.H.，etal.，VariationoftheCGGrepeatatthefragileXsiteresultsingeneticinstabilityresolutionoftheShermanparadox.Cell，1991.67(6)p.1047-58.25.Verkerk，A.J.，etal.，Identificationofagene(FMR-1)containingaCGGrepeatcoincidentwithabreakpointclusterregionexhibitinglengthvariationinfragileXsyndrome.Cell，1991.65(5)p.905-14.26.Knight，S.J.，etal.，TrinucleotiderepeatamplificationandhypermethylationofaCpGislandinFRAXEmentalretardation.Cell，1993.74(1)p.127-34.27.Holmes，S.E.，etal.，ExpansionofanovelCAGtrinucleotiderepeatinthe5′regionofPPP2R2BisassociatedwithSCA12NatGenet，1999.23(4)p.391-2.28.Limprasert，P.，etal.，ComparativestudiesoftheCAGrepeatsinthespinocerebellarataxiatype1(S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TCGCCCTCTCGGGAGACCATTCCATCATTGGCCGCACAATGGTGGTCCATGAAAAACCAGATGACTTGGGCAGAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACGGGAAATGCTGGAAGTCGTTTGGCCTGTGGTGTAATTGGGATCACCCAGTAASEQIDNO6突变的猪SOD1蛋白质的氨基酸序列.取代用粗体表示MATKAVCVLKGDGPVQGTIYFELKGEKTVLVTGTIKGLAEGDHGFHVHQFGDNTQGCTSAGPHFNPESKKHGGPKDQERHVGDLGNVTAGKDVATVYIEDSVIALSGDHSIIGRTMVVHEKPDDLGRGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGITQ阿尔茨海默病PSEN1SEQIDNO7人mRNA(PSEN1)TGGGACAGGCAGCTCCGGGGTCCGCGGTTTCACATCGGAAACAAAACAGCGGCTGGTCTGGAAGGAACCTGAGCTACGAGCCGCGGCGGCAGCGGGGCGGCGGGGAAGCGTATACCTAATCTGGGAGCCTGCAAGTGACAACAGCCTTTGCGGTCCTTAGACAGCTTGGCCTGGAGGAGAACACATGAAAGAAAGAACCTCAAGAGGCTTTGTTTTCTGTGAAACAGTATTTCTATACAGTTGCTCCAATGACAGAGTTACCTGCACCGTTGTCCTACTTCCAGAATGCACAGATGTCTGAGGACAACCACCTGAGCAATACTGTACGTAGCCAGAATGACAATAGAGAACGGCAGGAGCACAACGACAGACGGAGCCTTGGCCACCCTGAGCCATTATCTAATGGACGACCCCAGGGTAACTCCCGGCAGGTGGTGGAGCAAGATGAGGAAGAAGATGAGGAGCTGACATTGAAATATGGCGCCAAGCATGTGATCATGCTCTTTGTCCCTGTGACTCTCTGCATGGTGGTGGTCGTGGCTACCATTAAGTCAGTCAGCTTTTATACCCGGAAGGATGGGCAGCTAATCTATACCCCATTCACAGAAGATACCGAGACTGTGGGCCAGAGAGCCCTGCACTCAATTCTGAATGCTGCCATCATGATCAGTGTCATTGTTGTCATGACTATCCTCCTGGTGGTTCTGTATAAATACAGGTGCTATAAGGTCATCCATGCCTGGCTTATTATATCATCTCTATTGTTGCTGTTCTTTTTTTCATTCATTTACTTGGGGGAAGTGTTTAAAACCTATAACGTTGCTGTGGACTACATTACTGTTGCACTCCTGATCTGGAATTTTGGTGTGGTGGGAATGATTTCCATTCACTGGAAAGGTCCACTTCGACTCCAGCAGGCATATCTCATTATGATTAGTGCCCTCATGGCCCTGGTGTTTATCAAGTACCTCCCTGAATGGACTGCGTGGCTCATCTTGGCTGTGATTTCAGTATATGATTTAGTGGCTGTTTTGTGTCCGAAAGGTCCACTTCGTATGCTGGTTGAAACAGCTCAGGAGAGAAATGAAACGCTTTTTCCAGCTCTCATTTACTCCTCAACAATGGTGTGGTTGGTGAATATGGCAGAAGGAGACCCGGAAGCTCAAAGGAGAGTATCCAAAAATTCCAAGTATAATGCAGAAAGCACAGAAAGGGAGTCACAAGACACTGTTGCAGAGAATGATGATGGCGGGTTCAGTGAGGAATGGGAAGCCCAGAGGGACAGTCATCTAGGGCCTCATCGCTCTACACCTGAGTCACGAGCTGCTGTCCAGGAACTTTCCAGCAGTATCCTCGCTGGTGAAGACCCAGAGGAAAGGGGAGTAAAACTTGGATTGGGAGATTTCATTTTCTACAGTGTTCTGGTTGGTAAAGCCTCAGCAACAGCCAGTGGAGACTGGAACACAACCATAGCCTGTTTCGTAGCCATATTAATTGGTTTGTGCCTTACATTATTACTCCTTGCCATTTTCAAGAAAGCATTGCCAGCTCTTCCAATCTCCATCACCTTTGGGCTTGTTTTCTACTTTGCCACAGATTATCTTGTACAGCCTTTTATGGACCAATTAGCATTCCATCAATTTTATATCTAGCATATTTGCGGTTAGAATCCCATGGATGTTTCTTCTTTGACTATAACAAAATCTGGGGAGGACAAAGGTGATTTTCCTGTGTCCACATCTAACAAAGTCAAGATTCCCGGCTGGACTTTTGCAGCTTCCTTCCAAGTCTTCCTGACCACCTTGCACTATTGGACTTTGGAAGGAGGTGCCTATAGAAAACGATTTTGAACATACTTCATCGCAGTGGACTGTGTCCCTCGGTGCAGAAACTACCAGATTTGAGGGACGAGGTCAAGGAGATATGATAGGCCCGGAAGTTGCTGTGCCCCATCAGCAGCTTGACGCGTGGTCACAGGACGATTTCACTGACACTGCGAACTCTCAGGACTACCGTTACCAAGAGGTTAGGTGAAGTGGTTTAAACCAAACGGAACTCTTCATCTTAAACTACACGTTGAAAATCAACCCAATAATTCTGTATTAACTGAATTCTGAACTTTTCAGGAGGTACTGTGAGGAAGAGCAGGCACCAGCAGCAGAATGGGGAATGGAGAGGTGGGCAGGGGTTCCAGCTTCCCTTTGATTTTTTGCTGCAGACTCATCCTTTTTAAATGAGACTTGTTTTCCCCTCTCTTTGAGTCAAGTCAAATATGTAGATTGCCTTTGGCAATTCTTCTTCTCAAGCACTGACACTCATTACCGTCTGTGATTGCCATTTCTTCCCAAGGCCAGTCTGAACCTGAGGTTGCTTTATCCTAAAAGTTTTAACCTCAGGTTCCAAATTCAGTAAATTTTGGAAACAGTACAGCTATTTCTCATCAATTCTCTATCATGTTGAAGTCAAATTTGGATTTTCCACCAAATTCTGAATTTGTAGACATACTTGTACGCTCACTTGCCCCAGATGCCTCCTCTGTCCTCATTCTTCTCTCCCACACAAGCAGTCTTTTTCTACAGCCAGTAAGGCAGCTCTGTCGTGGTAGCAGATGGTCCCATTATTCTAGGGTCTTACTCTTTGTATGATGAAAAGAATGTGTTATGAATCGGTGCTGTCAGCCCTGCTGTCAGACCTTCTTCCACAGCAAATGAGATGTATGCCCAAAGCGGTAGAATTAAAGAAGAGTAAAATGGCTGTTGAAGCSEQIDNO8，人蛋白质(PSEN1)MTELPAPLSYFQNAQMSEDNHLSNTVRSQNDNRERQEHNDRRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMVVVVATIKSVSFYTRKDGQLIYTPFTEDTETVGQRALHSILNAAIMISVIVVMTILLVVLYKYRCYKVIHAWLIISSLLLLFFFSFIYLGEVFKTYNVAVDYITVALLIWNFGVVGMISIHWKGPLRLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPKGPLRMLVETAQERNETLFPALIYSSTMVWLVNMAEGDPEAQRRVSKNSKYNAESTERESQDTVAENDDGGFSEEWEAQRDSHLGPHRSTPESRAAVQELSSSILAGEDPEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKASATASGDWNTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKALPALPISITFGLVFYFATDYLVQPFMDQLAFHQFYISEQIDNO9猪mRNA，(PSEN1)AATCGGAAACAAAACAGCGGCTGCTGGGGAAGGGACCTGGGCTGCGAGAGGTGGCGGCTGCGACGAGAAAGAACCTAATCCGGGAGCCTGCAACCTGTGAAGTTCTTAGAAAGCTTGGCCTGGAGGAGAACACATGAAAGAAAGAACCCCAGGAGGCTCTGATTTCTGTGAAAAAGTATTTCTATACGGTTGTTCCAATGACAGAGTTACCTGCACCCTTGTCCTACTTCCAGAATGCCCAGATGTCCGAGGACAACCACGTGAGCAATAACGTAAGTAGCCAGAATGACAGTAGAGAGCGGCATGAGCACAGCATCGAGAGGCGGAGGCGTGGCAACTCTGAGTCGTTATCCAATGGCGGAGCCCAGGGAAACTCACGCCAGGTGGTGGAACAAGAAGAAGAGGAAGACGAGGAGCTGACGTTGAAATATGGCGCCAAACATGTGATCATGCTCTTTGTCCCTGTGACTCTATGTATGGTGGTGGTTGTGGCCACCATCAAATCAGTCAGCTTTTATACCCGGAAGGATGGGCAGCTGATCTATACTCCATTTACAGAAGACACTGAGACTGTAGGGCAGAGAGCCCTGCACTCAATTCTGAATGCTGCTATCATGATTAGTGTCATTGTCGTCATGACTATTCTCCTGGTGGTTCTCTATAAATACAGGTGCTATAAGGTCATCCATGCCTGGCTTATTATTTCATCCCTATTGTTGCTGTTCTTTTTCTCATTCATTTACTTGGGGGAAGTGTTTAAAACCTATAACGTTGCCATGGATTACATTACGGTGGCACTCCTGATCTGGAATTTTGGTGTGGTAGGAATGATTGCCATTCACTGGAAAGGCCCATTGCGACTCCAGCAGGCATATCTCATTATGATCAGTGCCCTCATGGCCCTGGTGTTTATCAAGTACCTCCCGGAATGGACCGCGTGGCTCATCTTGGCTGTGATTTCAGTATACGATTTAGTGGCTGTTTTGTGTCCAAATGGCCCACTTCGTTTGCTGGTTGAAACAGCTCAGGAGAGAAATGAAACTCTCTTTCCAGCTCTTATTTACTCGTCAACAATGGTGTGGTTGGTGAATATGGCAGAAGGAGACCCAGAAGCCCAAAGGAAGGTATCCAAAAACTCCAATTATAATGCACAAAGCACAGGTGAATCACAAGACTCTGTGACAGAGAGTGATGATGGTGGCTTCAGTGAAGAGTGGGAAGCCCAGAGGGACAGTCGCCTGGGACCTCATCACTCTACAGCTGAGTCACGATCTGCTGTACAGGATCTTTCCAGAAGCATCCCAGCCACTGAGGACCCAGAAGAAAGGGGAGTAAAACTTGGATTAGGAGATTTCATTTTCTACAGTGTTCTGGTTGGTAAAGCTTCTGCAACAGCCAGTGGAGACTGGAACACAACCATTGCCTGTTTTGTAGCCATATTAATTGGTTTGTGCCTTACATTACTGCTCCTCGCCATTTTCAAGAAAGCGTTGCCAGCTCTTCCAATCTCTATCACCTTTGGGCTTGTTTTCTACTTTGCCACAGATTATCTTGTGCAACCCTTTATGGACCAATTAGCATTCCATCAATTTTATATCTAGCATATTTCCAGTTAGAATCTCATGGATTTTTTCTCCTTTGGCTATAATAAAATCTGGGGAAAGCAAAGGTGATTTTGCTGTGTCCACATCTAACAAAGTCAGGATTCCCAGCTGGACCTSEQIDNO10猪蛋白质，(PSEN1)MTELPAPLSYFQNAQMSEDNHVSNNVSSQNDSRERHEHSIERRRRGNSESLSNGGAQGNSRQVVEQEEEEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMVVVVATIKSVSFYTRKDGQLIYTPFTEDTETVGQRALHSILNAAIMISVIVVMTILLVVLYKYRCYKVIHAWLIISSLLLLFFFSFIYLGEVFKTYNVAMDYITVALLIWNFGVVGMIAIHWKGPLRLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPNGPLRLLVETAQERNETLFPALIYSSTMVWLVNMAEGDPEAQRKVSKNSNYNAQSTGESQDSVTESDDGGFSEEWEAQRDSRLGPHHSTAESRSAVQDLSRSIPATEDPEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKASATASGDWNTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKALPALPISITFGLVFYFATDYLVQPFMDQLAFHQFYISEQIDNO11突变猪的PSEN1的氨基酸序列为了建立用于阿尔茨海默病的猪模型，选择的相关突变是Ile143Thr取代。在以下改变的猪蛋白质序列中，该取代用高亮表示MTELPAPLSYFQNAQMSEDNHVSNNVSSQNDSRERHEHSIERRRRGNSESLSNGGAQGNSRQVVEQEEEEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMVVVVATIKSVSFYTRKDGQLIYTPFTEDTETVGQRALHSILNAAIMSVIVVMTILLVVLYKYRCYKVIHAWLIISSLLLLFFFSFIYLGEVFKTYNVAMDYITVALLIWNFGVVGMIAIHWKGPLRLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPNGPLRLLVETAQERNETLFPALIYSSTMVWLVNMAEGDPEAQRKVSKNSNYNAQSTGESQDSVTESDDGGFSEEWEAQRDSRLGPHHSTAESRSAVQDLSRSIPATEDPEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKASATASGDWNITIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKALPALPISITFGLVFYFATDYLVQPFMDQLAFHQFYIPSEN2SEQIDNO12人mRNA(PSEN2)CGAGCGGCGGCGGAGCAGGCATTTCCAGCAGTGAGGAGACAGCCAGAAGCAAGCTATTGGAGCTGAAGGAACCTGAGACAGAAGCTAGTCCCCCCTCTGAATTTTACTGATGAAGAAACTGAGGCCACAGAGCTAAAGTGACTTTTCCCAAGGTCGCCCAGCGAGGACGTGGGACTTCTCAGACGTCAGGAGAGTGATGTGAGGGAGCTGTGTGACCATAGAAAGTGACGTGTTAAAAACCAGCGCTGCCCTCTTTGAAAGCCAGGGAGCATCATTCATTTAGCCTGCTGAGAAGAAGAAACCAAGTGTCCGGGATTCAGACCTCTCTGCGGCCCCAAGTGTTCGTGGTGCTTCCAGAGGCAGGGCTATGCTCACATTCATGGCCTCTGACAGCGAGGAAGAAGTGTGTGATGAGCGGACGTCCCTAATGTCGGCCGAGAGCCCCACGCCGCGCTCCTGCCAGGAGGGCAGGCAGGGCCCAGAGGATGGAGAGAACACTGCCCAGTGGAGAAGCCAGGAGAACGAGGAGGACGGTGAGGAGGACCCTGACCGCTATGTCTGTAGTGGGGTTCCCGGGCGGCCGCCAGGCCTGGAGGAAGAGCTGACCCTCAAATACGGAGCGAAGCACGTGATCATGCTGTTTGTGCCTGTCACTCTGTGCATGATCGTGGTGGTAGCCACCATCAAGTCTGTGCGCTTCTACACAGAGAAGAATGGACAGCTCATCTACACGACATTCACTGAGGACACACCCTCGGTGGGCCAGCGCCTCCTCAACTCCGTGCTGAACACCCTCATCATGATCAGCGTCATCGTGGTTATGACCATCTTCTTGGTGGTGCTCTACAAGTACCGCTGCTACAAGTTCATCCATGGCTGGTTGATCATGTCTTCACTGATGCTGCTGTTCCTCTTCACCTATATCTACCTTGGGGAAGTGCTCAAGACCTACAATGTGGCCATGGACTACCCCACCCTCTTGCTGACTGTCTGGAACTTCGGGGCAGTGGGCATGGTGTGCATCCACTGGAAGGGCCCTCTGGTGCTGCAGCAGGCCTACCTCATCATGATCAGTGCGCTCATGGCCCTAGTGTTCATCAAGTACCTCCCAGAGTGGTCCGCGTGGGTCATCCTGGGCGCCATCTCTGTGTATGATCTCGTGGCTGTGCTGTGTCCCAAAGGGCCTCTGAGAATGCTGGTAGAAACTGCCCAGGAGAGAAATGAGCCCATATTCCCTGCCCTGATATACTCATCTGCCATGGTGTGGACGGTTGGCATGGCGAAGCTGGACCCCTCCTCTCAGGGTGCCCTCCAGCTCCCCTACGACCCGGAGATGGAAGAAGACTCCTATGACAGTTTTGGGGAGCCTTCATACCCCGAAGTCTTTGAGCCTCCCTTGACTGGCTACCCAGGGGAGGAGCTGGAGGAAGAGGAGGAAAGGGGCGTGAAGCTTGGCCTCGGGGACTTCATCTTCTACAGTGTGCTGGTGGGCAAGGCGGCTGCCACGGGCAGCGGGGACTGGAATACCACGCTGGCCTGCTTCGTGGCCATCCTCATTGGCTTGTGTCTGACCCTCCTGCTGCTTGCTGTGTTCAAGAAGGCGCTGCCCGCCCTCCCCATCTCCATCACGTTCGGGCTCATCTTTTACTTCTCCACGGACAACCTGGTGCGGCCGTTCATGGACACCCTGGCCTCCCATCAGCTCTACATCTGAGGGACATGGTGTGCCACAGGCTGCAAGCTGCAGGGAATTTTCATTGGATGCAGTTGTATAGTTTTACACTCTAGTGCCATATATTTTTAAGACTTTTCTTTCCTTAAAAAATAAAGTACGTGTTTACTTGGTGAGGAGGAGGCAGAACCAGCTCTTTGGTGCCAGCTGTTTCATCACCAGACTTTGGCTCCCGGTTTGGGGAGCGCCTCGCTTCACGGACAGGAAGCACAGCAGGTTTATCCAGATGAACTGAGAAGGTCAGATTAGGGCGGGGAGAAGAGCATCCGGCATGAGGGCTGAGATGCGCAAAGAGTGTGCTCGGGAGTGGCCCCTGGCACCTGGGTGCTCTGGCTGGAGAGGAAAAGCCAGTTCCCTACGAGGAGTGTTCCCAATGCTTTGTCCATGATGTCCTTGTTATTTTATTGCCTTTAGAAACTGAGTCCTGTTCTTGTTACGGCAGTCACACTGCTGGGAAGTGGCTTAATAGTAATATCAATAAATAGATGAGTCCTGTTAGAAAAASEQIDNO13人蛋白质(PSEN2)MLTFMASDSEEEVCDERTSLMSAESPTPRSCQEGRQGPEDGENTAQWRSQENEEDGEEDPDRYVCSGVPGRPPGLEEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMIVVVATIKSVRFYTEKNGQLIYTTFTEDTPSVGQRLLNSVLNTLIMISVIVVMTIFLVVLYKYRCYKFIHGWLIMSSLMLLFLFTYIYLGEVLKTYNVAMDYPTLLLTVWNFGAVGMVCIHWKGPLVLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWSAWVILGAISVYDLVAVLCPKGPLRMLVETAQERNEPIFPALIYSSAMVWTVGMAKLDPSSQGALQLPYDPEMEEDSYDSFGEPSYPEVFEPPLTGYPGEELEEEEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKAAATGSGDWNTTLACFVAILIGLCLTLLLLAVFKKALPALPISITFGLIFYFSTDNLVRPFMDTLASHQLYISEQIDNO14猪mRNA(PSEN2)ATGCTCACTTTCATGGCCTCTGACAGCGAGGAAGAAGTGTGTGACGAGCGGACGTCCCTGATGTCGGCCGAGAGCCCCACGCCTCGCTCCTGCCAGGAAGGCAGGCAGGGCCTGGAGGATGGAGAGAGTGCTGCTCAGTGGAGAAGCCAGGACAGCGAGGAGGACCACGAGGAAGACCCTGACCGCTATGTCTGCAGTGGGGTTCCTGGCCGGCCACCAGGCCTGGAGGAGGAGCTGACCCTCAAATATGGGGCAAAGCACGTGATCATGCTCTTTGTGCCTGTCACGCTGTGTATGATCGTGGTAGTGGCCACCATCAAGTCCGTGCGCTTCTACACAGAGAAGAATGGACAGCTCATCTACACGCCGTTCACCGAGGACACGCCCTCCGTGGGCCAGCGCCTCCTCAACTCCGTGCTCAACACCCTCATCATGATCAGCGTCATTGTCGTCATGACCATCTTCCTGGTCGTGCTCTACAAGTACCGCTGCTACAAGTTCATCCACGGCTGGCTGATCACATCCTCCCTGATGCTGCTCTTCCTCTTCACCTACATCTACCTCGGGGAAGTGCTCAAGACCTACAACGTGGCCATGGACTACCCCACCCTGTTCCTGACCGTCTGGAACTTCGGGGCGGTGGGCATGGTGTGCATCCACTGGAAGGGCCCCCTGGTGCTGCAGCAGGCCTACCTCATCATGATCAGCGCGCTCATGGCCTTGGTGTTCATCAAGTACCTCCCGGAGTGGTCCGCCTGGGTCATCCTGGGCGCCATCTCTGTGTACGATCTCGTGGCTGTGCTGTGCCCCAAAGGGCCGCTGAGAATGTTGGTAGAAACTGCCCAGGAGAGAAACGAGCCCATATTTCCTGCCCTGATATACTCATCTGCCATGGTGTGGACGGTAGGCATGGCCAAGCTGGACCCCTCCTCTCAGGGAGCCCTTCAGCTCCCCTACGACCCAGAGATGGAAGAGGACTCCTATGACAGTTTTGGGGAGCCTTCGTACCCTGAAGTCTTTGAACCCCCGCTGCCTGGCTACCCGGGCGAGGAGCTGGAGGAAGAGGAGGAAAGGGGCGTGAAGCTGGGCCTCGGAGACTTCATCTTCTACAGCGTGCTGGTGGGCAAGGCAGCGGCCACGGGCAGCGGGGACTGGAACACCACGCTGGCCTGCTTCGTGGCCATCCTCATCGGTTTGTGTCTGACCCTCCTGCTGCTCGCGGTGTTCAAGAAAGCGCTACCCGCCCTTCCCATCTCCATCACGTTCGGCCTCATCTTCTATTTCTCCACCGACAACCTGGTACGGCCTTTCATGGACACGCTGGCCTCCCACCAGCTCTACATCTGASEQIDNO15猪蛋白质，(PSEN2)MLTFMASDSEEEVCDERTSLMSAESPTPRSCQEGRQGLEDGESAAQWRSQDSEEDHEEDPDRYVCSGVPGRPPGLEEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMIVVVATIKSVRFYTEKNGQLIYTPFTEDTPSVGQRLLNSVLNTLIMISVIVVMTIFLVVLYKYRCYKFIHGWLITSSLMLLFLFTYIYLGEVLKTYNVAMDYPTLFLTVWNFGAVGMVCIHWKGPLVLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWSAWVILGAISVYDLVAVLCPKGPLRMLVETAQERNEPIFPALIYSSAMVWTVGMAKLDPSSQGALQLPYDPEMEEDSYDSFGEPSYPEVFEPPLPGYPGEELEEEEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKAAATGSGDWNTTLACFVAILIGLCLTLLLLAVFKKALPALPISITFGLIFYFSTDNLVRPFMDTLASHQLYISEQIDNO16突变猪的蛋白质，(PSEN2)InordertomakeaporcinemodelforAlzheimer′sdiseasearelevantchoiceofmutationistheThr122Prosubstitution.ThissubstitutionishighlightedinthefollowingalteredporcineproteinsequenceMLTFMASDSEEEVCDERTSLMSAESPTPRSCQEGRQGLEDGESAAQWRSQDSEEDHEEDPDRYVCSGVPGRPPGLEEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMIVVVATIKSVRFYTEKNGQLIYPFTEDTPSVGQRLLNSVLNTLIMISVIVVMTIFLVVLYKYRCYKFIHGWLITSSLMLLFLFTYIYLGEVLKTYNVAMDYPTLFLTVWNFGAVGMVCIHWKGPLVLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWSAWVILGAISVYDLVAVLCPKGPLRMLVETAQERNEPIFPALIYSSAMVWTVGMAKLDPSSQGALQLPYDPEMEEDSYDSFGEPSYPEVFEPPLPGYPGEELEEEEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKAAATGSGDWNTTLACFVAILIGLCLTLLLLAVFKKALPALPISITFGLIFYFSTDNLVRPFMDTLASHQLYIAPPSEQIDNO17人mRNA(APP)GCTGACTCGCCTGGCTCTGAGCCCCGCCGCCGCGCTCGGGCTCCGTCAGTTTCCTCGGCAGCGGTAGGCGAGAGCACGCGGAGGAGCGTGCGCGGGGGCCCCGGGAGACGGCGGCGGTGGCGGCGCGGGCAGAGCAAGGACGCGGCGGATCCCACTCGCACAGCAGCGCACTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGAGGTACCCACTGATGGTAATGCTGGCCTGCTGGCTGAACCCCAGATTGCCATGTTCTGTGGCAGACTGAACATGCACATGAATGTCCAGAATGGGAAGTGGGATTCAGATCCATCAGGGACCAAACCTGCATTGATACCAAGGAAGGCATCCTGCAGTATTGCCAAGAAGTCTACCCTGAACTGCAGATCACCAATGTGGTAGAAGCCAACCAACCAGTGACCATCCAGAACTGGTGCAAGCGGGGCCGCAAGCAGTGCAAGACCCATCCCCACTTTGTGATTCCCTACCGCTGCTTAGTTGGTGAGTTTGTAAGTGATGCCCTTCTCGTTCCTGACAAGTGCAAATTCTTACACCAGGAGAGGATGGATGTTTGCGAAACTCATCTTCACTGGCACACCGTCGCCAAAGAGACATGCAGTGAGAAGAGTACCAACTTGCATGACTACGGCATGTTGCTGCCCTGCGGAATTGACAAGTTCCGAGGGGTAGAGTTTGTGTGTTGCCCACTGGCTGAAGAAAGTGACAATGTGGATTCTGCTGATGCGGAGGAGGATGACTCGGATGTCTGGTGGGGCGGAGCAGACACAGACTATGCAGATGGGAGTGAAGACAAAGTAGTAGAAGTAGCAGAGGAGGAAGAAGTGGCTGAGGTGGAAGAAGAAGAAGCCGATGATGACGAGGACGATGAGGATGGTGATGAGGTAGAGGAAGAGGCTGAGGAACCCTACGAAGAAGCCACAGAGAGAACCACCAGCATTGCCACCACCACCACCACCACCACAGAGTCTGTGGAAGAGGTGGTTCGAGAGGTGTGCTCTGAACAAGCCGAGACGGGGCCGTGCCGAGCAATGATCTCCCGCTGGTACTTTGATGTGACTGAAGGGAAGTGTGCCCCATTCTTTTACGGCGGATGTGGCGGCAACCGGAACAACTTTGACACAGAAGAGTACTGCATGGCCGTGTGTGGCAGCGCCATGTCCCAAAGTTTACTCAAGACTACCCAGGAACCTCTTGCCCGAGATCCTGTTAAACTTCCTACAACAGCAGCCAGTACCCCTGATGCCGTTGACAAGTATCTCGAGACACCTGGGGATGAGAATGAACATGCCCATTTCCAGAAAGCCAAAGAGAGGCTTGAGGCCAAGCACCGAGAGAGAATGTCCCAGGTCATGAGAGAATGGGAAGAGGCAGAACGTCAAGCAAAGAACTTGCCTAAAGCTGATAAGAAGGCAGTTATCCAGCATTTCCAGGAGAAAGTGGAATCTTTGGAACAGGAAGCAGCCAACGAGAGACAGCAGCTGGTGGAGACACACATGGCCAGAGTGGAAGCCATGCTCAATGACCGCCGCCGCCTGGCCCTGGAGAACTACATCACCGCTCTGCAGGCTGTTCCTCCTCGGCCTCGTCACGTGTTCAATATGCTAAAGAAGTATGTCCGCGCAGAACAGAAGGACAGACAGCACACCCTAAAGCATTTCGAGCATGTGCGCATGGTGGATCCCAAGAAAGCCGCTCAGATCCGGTCCCAGGTTATGACACACCTCCGTGTGATTTATGAGCGCATGAATCAGTCTCTCTCCCTGCTCTACAACGTGCCTGCAGTGGCCGAGGAGATTCAGGATGAAGTTGATGAGCTGCTTCAGAAAGAGCAAAACTATTCAGATGACGTCTTGGCCAACATGATTAGTGAACCAAGGATCAGTTACGGAAACGATGCTCTCATGCCATCTTTGACCGAAACGAAAACCACCGTGGAGCTCCTTCCCGTGAATGGAGAGTTCAGCCTGGACGATCTCCAGCCGTGGCATTCTTTTGGGGCTGACTCTGTGCCAGCCAACACAGAAAACGAAGTTGAGCCTGTTGATGCCCGCCCTGCTGCCGACCGAGGACTGACCACTCGACCAGGTTCTGGGTTGACAAATATCAAGACGGAGGAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACTAGACCCCCGCCACAGCAGCCTCTGAAGTTGGACAGCAAAACCATTGCTTCACTACCCATCGGTGTCCATTTATAGAATAATGTGGGAAGAAACAAACCCGTTTTATGATTTACTCATTATCGCCTTTTGACAGCTGTGCTGTAACACAAGTAGATGCCTGAACTTGAATTAATCCACACATCAGTAATGTATTCTATCTCTCTTTACATTTTGGTCTCTATACTACATTATTAATGGGTTTTGTGTACTGTAAAGAATTTAGCTGTATCAAACTAGTGCATGAATAGATTCTCTCCTGATTATTTATCACATAGCCCCTTAGCCAGTTGTATATTATTCTTGTGGTTTGTGACCCAATTAAGTCCTACTTTACATATGCTTTAAGAATCGATGGGGGATGCTTCATGTGAACGTGGGAGTTCAGCTGCTTCTCTTGCCTAAGTATTCCTTTCCTGATCACTATGCATTTTAAAGTTAAACATTTTTAAGTATTTCAGATGCTTTAGAGAGATTTTTTTTCCATGACTGCATTTTACTGTACAGATTGCTGCTTCTGCTATATTTGTGATATAGGAATTAAGAGGATACACACGTTTGTTTCTTCGTGCCTGTTTTATGTGCACACATTAGGCATTGAGACTTCAAGCTTTTCTTTTTTTGTCCACGTATCTTTGGGTCTTTGATAAAGAAAAGAATCCCTGTTCATTGTAAGCACTTTTACGGGGCGGGTGGGGAGGGGTGCTCTGCTGGTCTTCAATTACCAAGAATTCTCCAAAACAATTTTCTGCAGGATGATTGTACAGAATCATTGCTTATGACATGATCGCTTTCTACACTGTATTACATAAATAAATTAAATAAAATAACCCCGGGCAAGACTTTTCTTTGAAGGATGACTACAGACATTAAATAATCGAAGTAATTTTGGGTGGGGAGAAGAGGCAGATTCAATTTTCTTTAACCAGTCTGAAGTTTCATTTATGATACAAAAGAAGATGAAAATGGAAGTGGCAATATAAGGGGATGAGGAAGGCATGCCTGGACAAACCCTTCTTTTAAGATGTGTCTTCAATTTGTATAAAATGGTGTTTTCATGTAAATAAATACATTCTTGGAGGAGCAAAAAAAAAAAAAAASEQIDNO18人蛋白质(APP)MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAMSQSLLKTTQEPLARDPVKLPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQNSEQIDNO19猪mRNA(APP)ATGCTGCCCGGTTTGGCACTGGTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGAGGTGCCCACTGATGGCAATGCCGGCCTGCTTGCAGAACCCCAGGTTGCCATGTTCTGTGGCAAACTCAACATGCACATGAATGTGCAGAATGGGAAGTGGGAGTCAGATCCGTCGGGGACCAAAACCTGCATTGGCACCAAGGAAGGCATCTTGCAGTACTGCCAAGAAGTCTACCCTGAACTGCAGATCACCAATGTGGTAGAAGCCAACCAACCAGTGACCATCCAGAACTGGTGCAAGAGGAGCCGGAAGCAGTGCAAGACCCACACTCACATTGTGATTCCGTACCGCTGCTTAGTTGGCGAGTTTGTAAGCGATGCCCTCCTTGTTCCGGACAAGTGCAAGTTCTTACACCAGGAGAGGATGGATGTTTGCGAAACCCACCTTCACTGGCACACTGTGGCCAAAGAGACCTGTAGTGAGAAGAGTACGAACTTGCATGACTATGGCATGTTGCTGCCCTGTGGAATTGACAAGTTCCGAGGGGTGGAGTTTGTGTGTTGCCCACTGGCCGAGGAAAGTGACAATATCGACTCAGCAGATGCAGAAGAGGATGACTCGGACGTCTGGTGGGGTGGAGCAGATACAGACTATGCAGATGGCAGTGAAGACAAAGTCGTGGAGGTCGCAGAGGAGGAGGAAGTGGCTGATGTCGAGGAAGAAGAAGCTGAGGATGATGAGGATGATGAGGATGGTGATGAGGTAGAAGAAGAGGCTGAGGAACCCTATGAAGAGGCCACGGAGAGAACCACCAGCATCGCCACAACCACCACCACCACCACGGAGTCTGTGGAAGAGGTAGTCCGAGTTCCTACAACAGCAGCCAGCACCCCGGATGCCGTTGACAAGTATCTTGAGACACCTGGAGATGAGAACGAACATGCGCATTTCCAGAAAGCCAAAGAGAGGCTGGAGGCCAAGCACCGCGAGAGAATGTCCCAGGTCATGAGAGAGTGGGAAGAGGCAGAACGTCAAGCAAAGAACTTGCCTAAAGCTGATAAGAAAGCAGTGATCCAGCATTTCCAGGAGAAAGTGGAGTCTCTGGAGCAGGAAGCAGCCAACGAGAGGCAGCAGTTGGTGGAGACGCACATGGCCAGAGTGGAGGCCATGCTTAACGACCGCCGGCGCCTGGCCCTGGAGAATTACATCACGGCTCTTCAGGCTGTTCCTCCTCGGCCTCGTCATGTGTTCAACATGCTCAAGAAGTATGTCCGTGCTGAACAGAAAGACAGACAGCACACCCTAAAGCATTTTGAACACGTTCGCATGGTAGATCCAAAGAAAGCTGCTCAGATCCGATCCCAGGTTATGACACACCTCCGTGTGATTTACGAGCGCATGAACCAGTCTCTCTCCCTGCTCTACAACGTTCCTGCTGTGGCCGAGGAAATTCAGGATGAAGTTGATGAGCTGCTGCAGAAAGAGCAAAACTACTCGGATGATGTCTTGGCCAACATGATCAGCGAACCGAGGATCAGTTATGGAAACGATGCTCTCATGCCGTCTCTGACTGAAACCAAAACCACCGTGGAGCTTCTTCCTGTGAATGGAGAGTTCAGCCTGGATGATCTCCAGCCCTGGCATCCTTTTGGGGTAGACTCTGTGCCTGCCAACACAGAAAATGAAGTCGAGCCTGTTGACGCCCGCCCTGCAGCCGACCGAGGACTGACCACTCGACCAGGTTCCGGGTTGACCAACATCAAGACGGAAGAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATGCGGAGTTCCGACACGATTCGGGCTATGAGGTTCATCACCAAAAACTGGTGTTCTTCGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCCATCATTGGACTCATGGTGGGTGGTGTTGTCATAGCAACCGTGATTGTCATCACCTTAGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCTATCCATCACGGTGTGGTGGAGGTTGACGCAGCTGTGACCCCGGAGGAGCGCCACCTCTCCAAGATGCAGCAGAATGGCTATGAAAACCCAACTTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACTAGSEQIDNO20猪蛋白质，(APP)MLPGLALVLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQVAMFCGKLNMHMNVQNGKWESDPSGTKTCIGTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRSRKQCKTHTHIVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNIDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVADVEEEEAEDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVRVPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHPFGVDSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQNSEQIDNO21突变猪的蛋白质，(APP)InordertomakeaporcinemodelforAlzheimer′sdiseasearelevantchoiceofmutationistheSwedishmutationK670N，M671L.ThedoublesubstitutionishighlightedinthefollowingalteredporcineproteinsequenceMLPGLALVLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQVAMFCGKLNMHMNVQNGKWESDPSGTKTCIGTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRSRKQCKTHTHIVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNIDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVADVEEEEAEDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVRVPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHPFGVDSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN帕金森氏病SNCASEQIDNO22人SNCAcDNA序列AGAGAGGGGGCGAGCGACCGAGCGCCGCGACGCGGAAGTGAGGTGCGTGCGGGCTGCAGCGCAGACCCCGGCCCGGCCCCTCCGAGAGCGTCCTGGGCGCTCCCTCACGCCTTGCCTTCAAGCCTTCTGCCTTTCCACCCTCGTGAGCGGAGAACTGGGAGTGGCCATTCGACGACAGGTTAGCGGGTTTGCCTCCCAC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TATGGGACCGGCTGGTTTACCAGGACCACGGGGCCCACCAGGGCCACCTGGTATCCCCGGCCCGGCTGGAATTTCTGTTACAGGAAAACCTGGACAACAGGGACCTGCAGGAGCCCCAGGACCCAGGGGCTTTCCTGGAGAAAAGGGTGCACCAGGAGTCCCTGGTATCAATGGACAGAAAGGGGAAACGGGATATGGTGCTCCTGGCCGCCCAGGTGACAGGGGCCTTCCAGGCCCCCAGGGCCCAATGGGACCACCTGGCCCTCCTGGAGTGGGAAAGAGAGGGGAAAATGGGTTTCCCGGACAACCAGGCATCAAAGGTGATCGGGGCTTTCCAGGAGAAAGTGGACCGGCTGGTCCACCAGGCCCCCAAGGTCCTCCTGGGGAACAAGGACGAGAAGGCATTGGAAAGCCAGGAGCTCCTGGAGCCGCAGGCCAGCCAGGGCTTCCAGGGACAAAAGGTCACCCCGGGGCTCCAGGAATGGCTGGGCCTCCAGGGGCTCCTGGCTTTGGGAAACCAGGCTTGCCAGGCCTGAAGGGACAAAGAGGTCCTATAGGCCTTCCAGGGGCTCCAGGTGCCAAAGGGGAACAAGGCCCGGCAGGTCATCCTGGGGAACCAGGTCTGACTGGACCCCCTGGAAGTAGGGGACCCCAAGGACCAAAAGGCATCCCAGGCAATAACGGGGTCCCAGGCCCTAAGGGTGAGATAGGGCTGGCTGGGCCTGCAGGATTCCCTGGGGCTAAGGGAGAAAGGGGCCCCTCCGGGTTAGATGGAAAACCAGGGTACCCAGGAGAACCAGGTCTCAATGGTCCCAAGGGTAACCCAGGGTTACCCGGCCCAAAAGGTGACCCTGGAATTGGAGGACCTCCTGGTCTCCCAGGCCCTGTGGGCCCAGCAGGAGCTAAGGGAGTGCCTGGACACAATGGTGAGGCTGGGCCAAGAGGTGCCCCTGGAATACCAGGTACCAGAGGTCCCATCGGGCCACCAGGCATTCCAGGATTCCCTGGCTCTAAAGGGGATCCAGGAAATCCAGGTCCTCCTGGTCCAGCTGGCATAGCAACTAAGGGCCTCAATGGACCCACTGGGCCACCAGGGCCTCCAGGACCAAAAGGTCATGCTGGAGAGCCTGGCCTCCCAGGGCCCCCAGGGCCCCCAGGCCCTCCAGGCCAAGCGGTCCCACCCGAAGGCTTTGTAAAGGAAGGACAGAGGGCTTTTGTTAGTGCCAACCAGGGAGTAACAGGAATGCCTGTATCTGCCTTCACTGTGATTCTCTCCAAAGCTTACCCAGCTATAGGTGCTCCCATCCCCTTTGATAAGATTTTATATAACGGGCAACAGCACTATGACCCAAAAACTGGAATCTTTACCTGCAGGATACCTGGAATCTATTACTTCTCCTACCACATTCACGTGAAGGGGACCCATGCTTGGGTGGGCCTGTATAAAAATGGCACCCCTGTCATGTACACCTATGATGAATATGTCAAAGGCTACCTGGATCAGGCTTCAGGGAGTGCCATCCTTGATCTCACAGATAATGACCAGGTATGGCTCCAGCTGCCCAACGCTGGGTCGAACGGGCTGTACTCCTCTGAGTACGTCCACTCCTCTTTCTCAGGATTCCTAGTGGCTCCAATGTGASEQIDNO61猪蛋白质(COL10A1)MLPQTALLLLLLSLNLVHGVFYTEQYQTPTGIKGPPSNTKAQFFIPYAIKSKGISLRGEQGIPGPPGPAGPRGHPGPSGPPGKPGFGSPGPQGQPGLPGPPGPSATGKPGLPGPQGKPGERGPYGPKGDMGPAGLPGPRGPPGPPGIPGPAGISVTGKPGQQGPAGAPGPRGFPGEKGAPGVPGINGQKGETGYGAPGRPGDRGLPGPQGPMGPPGPPGVGKRGENGFPGQPGIKGDRGFPGESGPAGPPGPQGPPGEQGREGIGKPGAPGAAGQPGLPGTKGHPGAPGMAGPPGAPGFGKPGLPGLKGQRGPIGLPGAPGAKGEQGPAGHPGEPGLTGPPGSRGPQGPKGIPGNNGVPGPKGEIGLAGPAGFPGAKGERGPSGLDGKPGYPGEPGLNGPKGNPGLPGPKGDPGIGGPPGLPGPVGPAGAKGVPGHNGEAGPRGAPGIPGTRGPIGPPGIPGFPGSKGDPGNPGPPGPAGIATKGLNGPTGPPGPPGPKGHAGEPGLPGPPGPPGPPGQAVPPEGFVKEGQRAFVSANQGVTGMPVSAFTVILSKAYPAIGAPIPFDKILYNGQQHYDPKTGIFTCRIPGIYYFSYHIHVKGTHAWVGLYKNGTPVMYTYDEYVKGYLDQASGSAILDLTDNDQVWLQLPNAGSNGLYSSEYVHSSFSGFLVAPM权利要求1.一种用于常染色体显性遗传疾病的非人动物模型，其中非人动物模型表达至少一种与通过遗传定子获得的所述常染色体显性遗传疾病相关的表型。2.一种用于常染色体显性遗传疾病的非人动物模型，其中非人动物模型表达至少一种与通过精子介导的基因转移获得的所述常染色体显性遗传疾病相关的表型。3.权利要求1或2的模型，其中所述常染色体显性遗传疾病为蛋白质构象疾病。4.权利要求1或2的模型，其中所述常染色体显性遗传疾病为肌萎缩性侧索硬化(ALS)。5.权利要求1或2的模型，其中所述常染色体显性遗传疾病为阿尔茨海默病。6.权利要求1或2的模型，其中所述常染色体显性遗传疾病为帕金森氏病。7.权利要求1或2的模型，其中所述常染色体显性遗传疾病为与三核苷酸重复相关的疾病。8.权利要求7的模型，其中所述常染色体显性遗传疾病为亨廷顿舞蹈病。9.权利要求1或2的模型，其中所述常染色体显性遗传疾病为软骨发育不良。10.一种用于常染色体显性遗传疾病的猪模型，其中猪模型表达至少一种与通过遗传定子获得的所述常染色体显性遗传疾病相关的表型。11.一种用于常染色体显性遗传疾病的猪模型，其中所述疾病是通过遗传定子获得的蛋白质构象疾病。12.一种用于通过遗传定子获得的常染色体显性遗传神经变性疾病的猪模型。13.一种用于通过遗传定子获得的肌萎缩性侧索硬化的猪模型，其中所述猪模型表达至少一种与肌萎缩性侧索硬化相关的表型。14.一种用于通过遗传定子获得的阿尔茨海默病的猪模型，其中所述猪模型表达至少一种与阿尔茨海默病相关的表型。15.一种用于通过遗传定子获得的帕金森病的猪模型，其中所述猪模型表达至少一种与帕金森病相关的表型。16.一种用于通过遗传定子获得的与三核苷酸重复相关的疾病的猪模型，其中所述猪模型表达至少一种与三核苷酸重复相关的疾病的表型。17.一种用于通过遗传定子获得的亨廷顿舞蹈病的猪模型，其中所述猪模型表达至少一种与亨廷顿舞蹈病相关的表型。18.一种用于通过遗传定子获得的软骨发育不良的猪模型，其中所述猪模型表达至少一种与软骨发育不良相关的表型。19.权利要求1所述的非人动物模型，其中所述非人动物模型是猪。20.权利要求10-18任一项所述的模型，其中所述猪不是小型猪。21.根据权利要求20的模型，其中所述猪属于种家猪(S.domesticus)。22.权利要求20的模型，其中所述猪是选自兰德瑞斯(Landrace)，约克夏(Yorkshire)，汉普夏(Hampshire)，杜洛克(Duroc)，中国梅山猪(ChineseMeishan)、贝克郡猪(Berkshire)以及皮特兰猪(Piêtrain)组成的组，包括它们的任何组合。23.根据权利要求19的模型，其中所述猪是近交系猪。24.权利要求10-18任一项所述的模型，其中所述猪是小型猪。25.权利要求24的模型，其中小型猪选自由戈廷根猪(Goettingen)、尤卡坦猪(Yucatan)、巴马香猪(BamaXiangZhu)、五指山猪(Wuzhishan)和西双版纳猪(XiShuangBanna)组成的组，包括它们的任何组合。26.根据权利要求1-25中任一项的模型，其通过包括以下步骤的精子介导的基因转移(SMGT)获得i)提供雄性非人动物的精子，ii)提供一种遗传定子，当该遗传定子在所述非人动物模型表达时，其能够建立所述至少一种与所述遗传疾病相关的表型，iii)将所述精子和所述遗传材料接触，iv)将来自雌性的非人动物的卵母细胞与所述精子和所述遗传定子受精，以及v)将所述的受精卵母细胞在允许该受精卵母细胞发育成所述非人动物模型的条件下温育。27.根据权利要求1-25中任一项产生模型的方法，所述方法包括以下步骤i)提供雄性非人动物的精子，ii)提供至少一种遗传定子，当所述至少一种遗传定子在所述非人动物模型表达时，其能够建立所述至少一种与所述遗传疾病相关的表型，iii)将所述精子和所述至少一种遗传定子接触，iv)将来自雌性的非人动物的卵母细胞与所述精子和所述遗传材料受精，以及v)将所述的受精卵母细胞在允许所述受精卵母细胞发育成所述非人动物模型的条件下温育。28.权利要求27的方法，其中所述模型表达至少一种与遗传疾病相关的表型。29.权利要求28的方法，其中所述遗传疾病是常染色体显性的。30.权利要求28的方法，其中所述常染色体遗传疾病是权利要求1-8任一项限定的疾病。31.权利要求24的方法，其中所述非人动物是猪。32.权利要求31的方法，其中所述猪不是小型猪。33.权利要求32的方法，其中所述猪属于种家猪(S.domesticus)。34.权利要求32的方法，其中所述猪是选自兰德瑞斯(Landrace)，约克夏(Yorkshire)，汉普夏(Hampshire)，杜洛克(Duroc)，中国梅山猪(ChineseMeishan)、贝克郡猪(Berkshire)以及皮特兰猪(Piêtrain)组成的组，包括它们的任何组合。35.根据权利要求31的方法，其中所述猪是近交系猪。36.权利要求31的方法，其中所述猪是小型猪。37.权利要求36的方法，其中小型猪选自由戈廷根猪(Goettingen)、尤卡坦猪(Yucatan)、巴马香猪(BamaXiangZhu，)、五指山猪(Wuzhishan)和西双版纳猪(XiShuangBanna)组成的组，包括它们的任何组合。38.权利要求27的方法，其中所述精子与所述遗传材料的接触是在包含以下组成的缓冲液中进行i)葡萄糖和ii)柠檬酸盐和/或碳酸氢盐，优选为其钠盐，其任选地与iii)能够螯合二价金属离子的化合物，例如EDTA组合，并进一步任选地与iv)牛血清白蛋白(BSA)组合，其包括i)和ii)与iii)或iv)的任何组合。39.一种用于对遗传疾病的治疗处理的反应评价的方法，所述的方法含有步骤a.提供根据权利要求1-25中任一项的非人动物模型，b.使用至少一种对所述至少一种表型具有疗效的药物组合物治疗所述非人动物，以及c.评估观察到的效果。40.权利要求39的方法，其进一步包含步骤基于前述观察到的疗效建议医学治疗。41.一种非人精细胞，包含至少一种遗传定子，当其在非人动物宿主生物中表达时会引起至少一种遗传疾病的至少一种显性表型。42.权利要求41的非人精细胞，其中所述遗传疾病是常染色体显性疾病。43.权利要求41的非人精细胞，其中所述常染色体遗传疾病为权利要求1-18中任何一项所限定的疾病。44.权利要求41-43任一项的非人精细胞，其中遗传定子是哺乳动物源的，包括人源或猪源。45.权利要求41-43任一项的非人精细胞，其中所述模型是遗传修饰的。46.一种用于产生权利要求41-44中任何一项的非人精细胞的方法，所述方法包括以下步骤a.提供非人精细胞，b.提供至少一种遗传定子，当其在非人动物宿主生物中表达时会引起遗传疾病的显性表型，c.将所述非人精细胞与所述至少一种遗传定子进行接触，其中所述接触会导致遗传定子被摄取到非人精细胞中。47.权利要求46的方法，其中的非人精细胞是猪的精细胞。48.权利要求46的方法，其中遗传疾病是权利要求1-18中任何一项所定义的常染色体显性疾病。49.一种组合物，包含非人精细胞以及至少一种遗传定子，所述遗传定子当在非人动物宿主生物中表达时会引起至少一种遗传疾病的至少一种显性表型。50.权利要求49的组合物，其中遗传疾病是权利要求1-18中任何一项所定义的常染色体显性疾病。51.权利要求49-50中任一项的组合物，其中遗传定子是人源或猪源的。52.一种通过精子介导的基因转移对卵母细胞进行受精的方法，所述方法包括步骤提供根据权利要求41-44中任一项的非人精细胞以及将所述的非人精细胞引入到卵母细胞中进行受精。53.一种通过精子介导的基因转移对卵母细胞进行受精的方法，所述方法包括步骤提供根据权利要求50-51中任一项的组合物以及将所述的组合物引入到卵母细胞中进行受精。54.一种通过将卵母细胞与权利要求41-44中任一项的非人精细胞受精所获得的胚胎。55.一种通过将卵母细胞与权利要求49-50中任一项的组合物受精所获得的胚胎。56.一种培养和发育权利要求54或55任一项的胚胎的方法，所述的方法包括步骤在允许胚胎发育成表达所述遗传定子的非人动物后代的条件下培养所述胚胎和产生遗传疾病的显性表型。57.一种筛选药物组合物的疗效的方法，所述方法包括以下步骤a.提供根据权利要求1-25中任一项的非人动物模型，b.在所述的非人动物模型中表达至少一种遗传定子并产生所述遗传疾病的所述显性表型，c.向所述非人动物施用将要评价其疗效的药物组合物，以及d.评价药物组合物对在非人动物模型中表达的遗传定子产生的表型的疗效，如果有的话。全文摘要本发明公开了常染色体显性遗传疾病的非人动物模型。所述非人动物模型表达与所述疾病有关的至少一种表型，并通过遗传定子获得。本发明也涉及包括常染色体显性疾病的遗传定子的精细胞和胚。另外公开了用于产生非人动物模型、精细胞和胚的方法。文档编号C12N15/877GK101617051SQ200780024419公开日2009年12月30日申请日期2007年4月30日优先权日2006年5月1日发明者罗尼·布鲁恩·麦德森,克里斯蒂安·本迪克森,克努德·拉森,康妮·亚科布森朱尔,博·汤姆森申请人:奥胡斯大学