用于鉴别新药物的筛选方法

专利名称：：用于鉴别新药物的筛选方法用于鉴别新药物的筛选方法本发明涉及允许鉴别新药物的新筛选方法。具体地，本发明涉及用于选择氨酰-tRNA合成酶(ARS)抑制剂化合物的筛选方法，所述氨酰-1RNA合成酶(ARS)抑制剂化合物除了其它之外，还能够用作抗菌剂和抗真菌剂。
背景技术：
：在现代药物发现程序中，将化学文库与机器人系统组合使用以快速地评价大量化合物对给定反应的作用。这种方法具有两个主要缺点。首先，通常需要开发易于监控的生化检测以鉴别候选化合物。由于所选择药物的潜在的负作用，该方法是昂贵并且不灵敏的。其次，该方法忽视了生物利用度和毒性参数。由于溶解度、生物利用度或毒性问题，稍后放弃了大多数起始选择的化合物。氨酰-tRNA合成酶(下文中所谓的"ARS")对于药物开发而言代表着理想的耙标，这是因为它们是普遍分布的必需酶，其遗传性质(ancestralnature)允许选择特定的抑制剂。此外，它们是可溶的，稳定的，易于大量表达和纯化，并且可通过一种或多种方法直接检测。对于所有合成酶的实例可获得X-射线结构，并且已知许多关于氨酰化反应的机制(参见，Weygand-DurasevicI.等人，"Yeastseryl-tRNAsynthetaseexpressedinEscherichiacolirecognizesbacterialserine-specifictRNAsinvivo"，Eur.J.Biochem.,1993，vol.214，pp.869-877)。ARS催化特定氨基酸至相应(cognate)tRNA的连接。该反应在单活性位点结构域内发生，并且典型地分两步进行。首先，氨基酸用ATP活化以形成氨酰-腺苷酸，并伴随着焦磷酸的释放。接下来，将氨基酸转移到tRNA的3'末端以产生氨酰-tRNA和AMP。该两步反应通过将特定的核苷酸三联体(tRNA反密码子)与特定的氨基酸连接来建立遗传密码。各氨基酸通过其自己的特异ARS识别，所述ARS是普遍分布的。将氨酰-tRM合成酶均分为各自约10种酶的两类。类内的所有酶似乎进化自单结构域ATP结合蛋白。在该结构域上的插入和变化建立了用于结合tRNA接纳茎的框架。在进化过程中另外的结构域加入至此核心结构。通过氨酰-tRNA合成酶的tRNA的识别主要依赖于与tRNA的接纳系统和反密码子环的分子相互作用(参见.Rich,A."RNAstructureandtherootsofproteinsynthesis"，ColdSpringHarb.Symp.Q磁t.Biol.，2001，vol.66，pp.1-16)。该酶的活性J立点结构域结合到tRNA分子的接纳臂，其中附加上氨基酸。'鉴别，碱基(discriminatorbase)(在通用CCA序列之前的未配对碱基)，和接纳茎的第一个三碱基对具有大部分通过ARS活性位点识别的鉴别元件。在针对翻译的商业抗生素中，一种是耙向tRNA合成酶的。假单胞菌酸(莫匹罗星(mupirocin))为来自革兰氏阳性传染性病原体的异亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)的抑制剂。对于病原体与哺乳动物HeRS相比，假单胞菌酸具有约8000倍的选择性，但是药物的全身生物利用度的缺乏限制了其用于局部给药。虽然存在其它已知的针对合成酶的天然产物抑制剂(例如，疏螺体素、呋喃霉素、榴菌素等)，由于抑制活性的缺乏、不良的特异性或不良的生物利用度，这些无一开发成商业抗生素。因此，需要更有效的用于选择ARS抑制剂的方法以筛选大的化学文库和鉴别有希望的药物候选物。发明概述本申请的目的在于提供用于选择ARS抑制剂的篩选方法。提供了正向筛选方法，其意味着潜在先导化合物的所期望的作用是援救和/或刺激哺乳动物细胞的生长，并且不抑制任何给定的反应或阻止细胞培养的生长。因此，在本文提出的正向选择中，将通过那些能够抑制靶ARS毒性作用的分子援救哺乳动物细胞(特别是人类细胞)的生长。该作用将简单地通过测量培养密度(一种快速便宜的方法)来监控。因此，本发明的一方面是提供用于鉴别药物候选物的篩选方法，所述方法包括以下步骤(a)获得表达载体，所述表达栽体包含编码天然存在的病原非识另UtRNA合成酵(pathogenicnon—discriminatingtRNAsynthetase)的基因序列；b)用所述表达载体转化分离的哺乳动物细胞；c)在允许病原tRNA合成酶(pathogenictRMsynthetase)表达的条件下在营养培养基中使由(b)产生的重组细胞生长，引起病原tRNA合成酶表达导致细胞死亡或细胞分裂的速率的降低；d)提供待测试的物质；和e)分析所得的细胞生长，其中如果细胞生长增加，那么所述物质选择性地抑制病原tRNA合成酶的活性，并且不影响其细胞直系同源物，导致所述物质为药物候选物。优选地，所述分离的哺乳动物细胞为分离的人类细胞。本发明的筛选方法基于以下策略如果非特异性ARS对细胞是有毒性的，并且该毒性无需操纵活性位点即可实现，那么其应该可以设计人类病原体的ARS以锗栽(mischarge)人类tRNA，从而杀死正好表达该蛋白的哺乳动物细胞或影响其生长速率。如果药物的候选分子正好是结合到该酶活性位点的化合物，那么它们在来自目的病原体的野生型ARS中将同样有活性，这是因为在此过程中未操作毒性ARS的催化腔(catalyticcavity)。有利地是，遵从本发明筛选方法鉴别为药物候选物的分子表征为选择的小分子，这是由于它们的恢复非特异性ARS的毒性作用的能力，还表征为能够同时地穿过细胞膜，抑制病原合成酶，不抑制其人类直系同源物，并且不影响细胞代谢的其它方面。因此，所述药物候选物特异性杀死病原体，并且对宿主细胞没有毒性。除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有与本发明所属
技术领域：
普通技术人员所通常理解的相同含义。与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可用于本发明实践。在整个说明书和权利要求书中，6词语"包含"或"包括"、和该词语的变体，例如作为定语的一部分的"包含"和"包括"，不欲于排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。通过检查说明书，本发明的另外目的、优点和特征对本领域技术人员将变得显而易见，或可以通过本发明的实践领会。以示例的方式提供以下实施例和附图，并且不欲于限制本发明。图l表示幽门螺杆菌(〃.AF/or/)GFPGRS2在海拉细胞(HeLacells)中的表达。将模拟的(Mock)或用幽门螺杆菌GFPGRS2瞬时转染的全细胞裂解产物在还原条件下进行SDS/PAGE。使用多克隆抗-GFP抗体通过免疫印迹检测GFPGRS2。图2显示幽门螺杆菌GFPGRS2的表达导致细胞死亡的增加。GFP(灰色)或妖；/7or/GFPGRS2(黑色)在海拉细胞中进行瞬时转染，并且16hr后，加入新鲜培养基。加入新鲜培养基后一、二或三天通过PI染色检查细胞死亡。死亡的转染细胞(缩写为"dtc")的百分比与死亡的非转染细胞的百分比(缩写为"dntc")之比显示在y轴上。对于每一条件计数一式三份的样品，并且显示标准偏差。具体实施方案详述如本文所用，术语"非识别ARN-t合成酶"(缩写为NDARN-1合成酶)是指氨酰-tRNA合成酶，其生物学功能是用相同的氨基酸将一种以上的tRNA氨酰化。例如，大多数细菌包含能够用谷氨酸代替谷氨酰胺(其相应氨基酸)氨酰化tRNA"n的GluRS酶。该反应对于具有该酶的细胞没有毒性，这是因为用谷氨酸氨酰化的tRNA""的瞬时形式快速地改变并且氨基酸谷氨酸转化成谷氨酰胺。如本发明中所用的，术语"非特异"或"非典型(non-canonical)"与术语"非识别"具有相同的含义。术语"天然存在的病原"理解为根据本发明的非识别tRNA合成酶从对于哺乳动物是致病的并且尚未遗传改造过的生物体获得。在本发明第一方面的一个实施方案中，在步骤(a)中获得的表达载体还包含编码天然存在的病原非识别tRNA合成酶的tRNA底物的基因序列。在本发明第一方面的另一个实施方案中，在步骤(b)中通过使用第二表达载;，来转化^乳动物细胞。'、^'本发明的发明人已经发现，编码病原非识别tRNA合成酶和其tRNA底物的基因的同时表达，能够增加所述非识别tRM合成酶在表达两种基因的细胞中诱导毒性的能力。编码天然存在的病原非识别tRNA合成酶的tRNA底物的基因序列获自公共数据库(例如，来自三种不同分离物的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)全基因纟且序歹'J可在Genebank索引号NC—000915.1，NC-008086.1，和NC—000921.1下发现)。在本发明的一个实施方案中，天然存在的病原非识别t-RM合成酶选自Glu-tRNA合成酶和Asp-tRNA合成酶。在氨酰-tRNA合成酶中，谷氨酰-和谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(分别为GluRS和GlnRS)与天冬氨酰-和天冬酰胺酰-tRNA合成酶(分别为AspRS和AsnRS)分别在序列上和进化上相关(参见.Brown，J.R.等人，"Genedescent,duplication,andhorizontaltransferintheevolutionofglutamyl—andglutaminyl-tRNAsynthetases"，J.Mol.Evol.1998，vol.49，p.485495;Hong，K.W.，等人，"RetracingtheevolutionofaminoacidspecificityinglutaminyHRNAsynthetase"，FEBSLett,1999，.vol.434，p.149-154)。在真核生物和一些细菌中，GlnRS和GluRS(GluRS-D)各自催化高度特异的tRNA氨酰化反应。GluRS-D不会用Glu错酰化(misacylate)tRNAGln，GlnRS不会用Gln错酰化tRNA"11。相反，古细菌和大多数细菌不编码功能性GlnRS，并且Gln-tRNA^是间接生物合成的(参见，Wilcox，M.&Nirenberg，"TransferRNAasacofactorcouplingaminoacidsynthesiswiththatofprotein"，1968，Pro"Natl.Acad.Sci.USA,vol.61，p.229-236.)。首先，通过非识别GluRS(GluRS-ND)将tRNA^错酰化，以形成Glu-tRNAGln(方程1)[GluRS-ND仍催化其相应反应，以产生Glu-tRNAeiu]。接下来，错酰化的Glu-tRNA"n中间体通过谷氨酰胺-依赖性Glu-tRNA^酰胺转移酶(Glu-Adt)来进行转酰胺基地改变(方程2)。Glu+tRMGln+ATP+GluRS-ND~>Glu-tRNAGln+AMP+PPi(Eq.1)Gln+Glu-tRNAGln+ATP+Glu-Adt4Gln-tRNAGln+Glu+ADP(Eq.2)对于AspRS和AsnRS存在类似的情况Asp+tRNAAsn+ATP+AspRS-ND~>Asp-tRNAAsn+AMP+PPi(Eq.3)Asn+Asp-tRNAAsn+ATP+Asp-Adt">Asn-tRNAAsn+Asp+ADP(Eq.4)这样，尽管缺少相应GlnRS或AsnRS,遗传编码的保真性(fidelity)也精确地保持。然而，将NDG1uRS导入不能催化该改变步骤的细胞对该细胞而言是有毒性的，因为其导致用谷氨酸氨酰化的tRNA"n的累积，最终引起通过生物体合成的蛋白质中大量突变形成。该作用已经通过在大肠杆菌(&c力er/c//aco/"中表达NDGluRS证实，所述大肠杆菌为缺少将tRNA^中的谷氨酸转化为谷氨酰胺的能力的生物体。在本发明中，"表达栽体"是指将所期望的DNA(例如异源核酸)的片段插入其的载体分子。栽体起将外源DNA导入宿主细胞的作用。更具体地，"表达载体"为包含DM序列的DNA载体，所述DNA序列可操作地连接至合适的能够实现DNA在合适的宿主中表达的控制序列上。此类控制序列包括实现转录的启动子，任选的控制此类转录的操作子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。载体可为质粒、噬菌体颗粒、或仅仅潜在的基因组插入物(genomicinsert)。一旦转化入合适的宿主，栽体可以独立于宿主基因组复制并且起作用，或在某些情况下，可整合到基因组本身，产生稳定的细胞系，所述细胞系组成型地表达或在用所述基因表达的诱导剂处理细胞后表达所述基因。本文术语"质粒"或"载体"有时相互交换地使用，因为目前质粒是栽体的最常用形式。然而，本发明意欲包括此类起等价功能作用的并且为本领域已知的栽体的其它形式。表达载体典型地进一步包含其它功能上重要的核酸序列，例如编码抗生素抗性蛋白的表达盒、多克隆位点、复制序列等。在本发明的一个实施方案中，表达载体选自病毒或非病毒质粒、粘粒、噬粒、穿梭载体、yak等。优选表达载体为腺病毒。在本发明的另一个实施方案中，载体进一步包含用来表达基因的四环素-依赖性调节系统。在本发明的又一个实施方案中，载体包括选择标记。优选选择标记为潮霉素。在另一个实施方案中，病原体选自利用非特异性ARS翻译其遗传密码的生物体，例如肺炎链球菌(57re;^ococc^p/e咖o/2'ae)。如本文所用，术语"转化"或"转染"是指用于将外源核酸(例如DNA)导入原核或真核宿主细胞(包括分离的人类细胞)的本领域公认(art-recognized)技术的任何变种。用于将包含核酸的表达载体导入(转导入)宿主细胞以产生转导重组细胞，或产生包含整合到该细胞核DNA中的基因的稳定细胞系的合适方法在本领域是公知的。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可参见MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，由J.Sambrook和D.W.Russell编辑(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，2000)，以及其它实验室手册。用于生长和保存细菌菌林的方法公开于MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，由J.Sambrook和D.W.Russell编辑(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2000)。如本领域技术人员公知，控制人类细胞中基因的表达和抑制基础表达的存在是有挑战性的(参见，Rai等人，"Expressionsystemsforproductionofheterologousproteins"，CurrentScience,2001vol.80，pp.1121-11)。发明人已经利用人类细胞蛋白表达领域中的两个最新进展来诱导(vector)我们的测试菌林。首先，已经使用以四环素调节的Tet-ON-和孕酮拮抗剂RU486调节的基因表达系统为基础的基于腺病毒的基因表达载体。该载体可在许多细胞种类中起作用，并且显示蛋白质表达的调节受到紧密的控制(参见，Edholm，D.等人，"Adenovirusvectordesignedforexpressionoftoxicproteins"，J.Virology,2001,vol.75，pp.9579-9584)。可选择地，测试菌林的栽体可以基于Cre/loxP重组系统以活化基因转录。Cre为源自噬菌体P1的38kDa的重组酶蛋白，其介导loxP位点之间的分子内(切除(excisive)或倒置)和分子间(整合)位点特异重组。Cre的DNA切除能力可用于通过切除启动子和基因编码区之间的间插终止序歹'J(interveningstopsequence)来开启夕卜源基因。这才羊，编码毒性合成酶的基因能够以其转录起始位点被终止信号阻断的载体的形式导入人类细胞。重组，即终止信号的切除，仅当Cre的表达被激活时发生(参见，Sauer，B等人，"Cre/lox:one匿estepinthetamingofthege顏e，，，Endocrine,2002，Vol.19，pp.22卜228)。一旦开发出测试菌林，本发明人已经设计了使用自动平板阅读器的在96孔平板中的简单的生长-监控试验。他们已经成功地执行了类似的程序以分析在大肠杆菌co7/.)中的毒性酶作用。一旦运行此试验，其开始篩选小分子文库以寻找潜在的新的靶合成酶的抑制剂。术语"测试物质"和"物质"相互交换使用，并且指化合物、化合物的混合物(即至少两种化合物)或包含一种或多种化合物的天然产物样品。这样，测试物质的细胞生长分析可包括超过一种生长抑制剂的抑制活性，以便乾基因产物的选择性和非选择性抑制剂的组合与包含毒性非识別ARS的真核细胞的生长具有可观测的关系。尽管缺少测试小分子在整个组织或个体中的作用，在人类细胞培养物中测试它们将提供具有最大可能区别力的篩选，这是因为基于细胞生长的选择在多因子基础上鉴别化合物或化合物的组合。起始选择鉴别能够阻断合成酶活性和穿过细胞膜的抑制剂，而第二筛选进一步ii细化(refine)搜索不影响人类细胞代谢的分子。表达非识别氨酰-tRNA合成酶的人类细胞用于发现这些酶的抑制剂。当诱导编码非识别氨酰-tRM合成酶的基因表达时，包含所述编码非识别氨酰-tRNA合成酶的基因的细胞合成这些蛋白，且这引起细胞死亡，该细胞死亡归因于非识别氨酰-tRNA合成酶催化的生化反应。由非识别氨酰-tRNA合成酶引起的细胞死亡可以借助各种商业或标准方法(中性红摄入，WST1，LDH水平，ATP水平，以及其它)，通过使用分光光度计或任何其它为监控细胞死亡目的设计的装置来监控。将要就它们消除由非识别氨酰-tRNA合成酶引起的毒性作用的能力进行测试的化合物在诱导编码非识别氨酰-tRNA合成酶的基因表达之前、期间或之后加入细胞。诱导基因之后，在存在或不存在待测试的各化合物下监控在各细胞培养中的细胞死亡。认为这样的化合物为引起细胞死亡的非识别氨酰-1RNA合成酶的潜在的抑制剂，其引起培养物的细胞死亡率与在不存在该化合物下相同培养物的细胞死亡率相比降低。因此，在本发明的一个实施方案中，天然存在的病原非识别tRNA合成酶来自细菌，并且测试所述物质以确定其是否为抗菌剂，所述抗菌剂通过选择性抑制表达入重组人类细胞的细菌来源的非识别t-RNA合成酶的功能而起作用。在本发明的另一个实施方案中，天然存在的病原非识别tRNA合成酶来自真菌，并且测试所述物质以确定其是否为抗真菌剂，所述抗真菌剂通过选择性抑制表达入重组人类细胞的细菌来源的非识别t-RNA合成酶的功能而起作用。在本发明的另一个实施方案中，天然存在的病原非识别tRM合成酶来自原生动物，并且测试所述物质以确定其是否为抗寄生虫剂，所述抗寄生虫剂通过选择性抑制表达入重组人类细胞的原生动物来源的非识别t-RNA合成酶的功能而起作用。在本发明的又一个实施方案中，天然存在的病原非识别tRNA合成酶来自后生动物，并且测试所述物质以确定其是否为抑制剂，所述抑制剂通过选择性抑制表达入重组人类细胞的后生动物来源的非识另'Jt-RNA合成酶的功能而起作用。实施例在海拉细胞中的幽门螺杆菌谷氨酰-tRNA合成酶的表达病原菌幽门螺杆菌利用两种必需谷氨酰-tRNA合成酶(GluRSl和GluRS2)。GluRSl为典型的识别GluRS(discriminatingGluRS)，GluRS2为非典型的，因为其仅对错酰化的Glu-tRNA""的产生而言是必需的。为了研究在哺乳动物系统中表达幽门螺杆菌非典型GRS2是否具有毒性作用和导致细胞死亡，在海拉细胞中表达幽门螺杆菌GFPGRS2，检查人类细胞系和其推定的毒性作用。获得表达载体将质粒载体GRS2并1(SEQIDNO:1)5，-GTCACCACCATGCTTCGTTTTGCGCCTTCGCCTACAG和GRS2并2(SEQIDNO:2)5，-GACTCAATGGTGATGGTGATGATGTGCTTTGAGCCTTAAAACTT用于从来自幽门螺杆菌(ATCC700392D)的基因组DNA扩增GRS2，并且在其C末端添力口kozak共有才亥糖体结合4立^、序歹l1(kozakconsensusribosomebindingsidesequence)和His-tag表位。通过使用标准重叠PCR技术将绿色荧光蛋白(下文中所谓的"GFP")融合到GRS2的NH2末端，以使其借助流式细胞术和免疫印迹法的检测容易。使用GFP-GRS2并1(SEQIDNO:3)5-ATCTCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG和GFP-GRS2#2(SEQIDNO:4)5，-CTGTAGGCGAAGGCGCAAAACGAAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA，扩增GFP，并且使用GFP-GRS2并3(SEQIDNO:5)5，-TCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCTTCGTTTTGCGCCTTCGCCTACAG和GFP-GRS2#4(SEQIDNO:6)5，一GATATTCAATGGTGATGGTGATGATGTGCTTTGAGCCTTAAAACTT将其连接到GRS2。随后将两个片段与引物GFP-GRS2并1和GFP-GRS2并4一起混合，并且进行第二重叠PCR。将扩增产物克隆入PCR2.1-T0P0/TA(Invitrogen)。用Notl消化GFPGRS2/PCR2.l-T0P0/TA，并将其插入进行类似切割的哺乳动物表达栽体，pCMV(BDBiosciencesClontech)。用Xbal和Spel消化GFPGRS2/PCR2.l-T0P0/TA，并将其插入XbaI切割的哺乳动物四环素诱导表达载体pTRE2(BDBiosciencesClontech)。pTRE2用于在Tet-0n海拉细胞系中表达GRS2。pTRE2为包含四环素应答性PhW—!启动子的响应质粒(responseplasmid)(商业获得)。该启动子包含Tet响应元件(TetResponseElement)(TRE)，其由7个拷贝的42-pbtet操作子序列UeW)构成。TRE正好在最小CMV启动子的上游，所述最小CMV启动子缺少其为完整CMV启动子的部分的增强子。对于双賴、定海4iTet—0n转染子(double—stableHelaTet—0ntransfectants)，用PvuII和XmnI(其产生平末端)从pcDNA3.1/潮霉素载体(Invitrogen)消化潮霉素抗性，并且将其亚克隆入平末端的Zra1-消化的GFPGRS2/pTRE2。所有载体的完整性和真实性通过用标准测序技术确定它们的核苷酸序列来确认。获得细胞Tet-0n海拉细l包为人子宫颈癌衍生细胞，其表达反向(reverser)四环素控制反式激活蛋白(rtTA)，并且获自BDBiosciencesClontech。海拉细胞和海拉Tet-On(HeLaTet-0n)在加湿培养箱中在5%C02/95。/。空气下在DMEM培养基上生长，所述DMEM培养基补充有IOOU/ml青霉素、100ng/mL链霉素和10。/。热灭活的胎牛血清(来自Gibco)。在IOOpg/inLG418的存在下维持海拉Tet-On细胞。将细胞保持在指数生长期。粘附细胞在洗涤前通过用胰蛋白酶-EDTA溶液在37。C下温育5分钟来解粘附。细胞的转染对于瞬时转染，将20ng的各DNA加至500jal包含252mMCaCh的水中。然后，将500pl的2xHepes-緩冲的生理盐水緩沖液(280mMNaCl，10mMKC1，1.5mMNa2HP04，50mMHEPES，12mM葡萄糖(dextrose)，pH7.l)逐滴地加至DNA混合物。将该转染混合物加至细胞之后16小时，除去包含DNA的培养基并加入新培养基。24小时之后，将转染细胞用于试验。对于双稳、定4争染子(double—stabletransfectants)，用20DM转染Tet-0n海拉细胞。转染48小时之后，在24孔平板中分散(split)细胞，并加入500jug/mL的潮霉素以用于选择。大约15天后，选择单独的细胞克隆，并放入96孔平板中以进行扩增(expansion)。借助流式细胞术通过检查其GFP表达来选择克隆。克隆的选择免疫印迹将在Laemmli蓝样品緩冲液中的全蛋白提取物载入并在10。/。凝胶上通过SDS-PAGE分离。将凝胶转移至PVDF膜上并用包含10%(w/v)牛奶的TBS-T(0.5MTris，1.5MNaCl，0.1%(v/v)Tween-20，pH7.4)封闭至少l小时。随后，用纯化的抗绿色荧光蛋白兔多克隆抗体(Immunokontact)在10。/。BSA/TBS-T封闭溶液中以1:5000温育印迹。用一抗温育后立刻将印迹洗涤两次，然后以15分钟的间隔另外洗涤两次。最后，用二抗(抗兔IgG，连接辣才艮过氧化物酶(horsedishperoxidase)的全抗体，其由Amersham供应)在TBS-T中以l:IOOOO温育印迹l小时,而后如上洗涤并使用增强型化学发光(ECU检测系统(Amersham)进行显影。流式细力包术研究细胞的细胞存活率。立刻使用CoulterEpicsXL(BeckmanCoulter)和使用SystemII软件分析PI染色的细胞。从使用这些技术获得的结果推断，海拉细胞(来自人子宫颈癌)已用空质粒(模拟(mock))或编码GFP-GRS2/pCMV的质粒瞬时转染。如图1所示，使用抗GFP多克隆抗体通过免疫印迹检测GFP融合蛋白的表达。在GFP-GRS2海拉细胞全细胞裂解产物中检测到约78kDa的条带。细胞死亡的确定为了评价在哺乳动物系统中表达幽门螺杆菌非识别GRS2是否具有毒性作用和导致细胞死亡，在海拉细胞中表达幽门螺杆菌GFPGRS2，检查人类细胞系及其推定的毒性作用。如图2所示，通过PI染色测量，海拉细胞中幽门螺杆菌GFPGRS2的表达导致细胞死亡增加。与海拉细胞中的GFP表达相比，幽门螺杆菌GFPGRS2的表达对细胞存活具有有害作用，并且该作用持续至转染后3天。这些结果证明哺乳动物系统中幽门螺杆菌GFPGRS2的表达导致细胞死亡增加。该细胞死亡敏感性的增加可能是由于谷氨酸代替谷氨酰胺的掺入的增加，这种增加可能在表达幽门螺杆菌GFPGRS2的海拉细胞中引起错误折叠蛋白质(misfoldedproteins)的水平上升，导致细胞死亡增加。由于海拉细胞中幽门螺杆菌GFPGRS2的组成型表达导致细胞死亡增加，本发明人已经在海拉Tet-On细胞(四环素-诱导系统)中稳定地表达幽门螺杆菌GFPGRS2。候选药物的确定为了确定物质是否为候选药物，在NDGlutRNA合成酶的存在下必须允许或改进人类细胞的生长(即，该化合物必须对所述非识别ARS具有抑制活性)。进行生化反应，其中NDGlutRNA合成酶催化对应氨基酸掺入至相应tRNA。通过使用放射性标记氨基酸并且测量放射性标记至tRNA分子的添加来监控该掺入。通过与ARS(其抑制是所要寻求的)同源的人类酶来催化类似的反应。然后，将候选药物的物质加入反应混合物。通过测量该分子抑制放射性氨基酸掺入至其相应tRNA"u的能力，并且将该能力与相同化合物抑制类似的人类酶对其各自的相应tRNA的活性的能力相比，来评价该物质选择性识别非识别ARS和其人类同源物的能力。当其能够抑制来自病原的酶，而不抑制类似的人类酶时，分子是特异的。因此，就其抑制最初包含非识别ARS的生物体生长的能力方面测试分子。认为这样的分子是用于抑制该生物体生长的潜在的药物候选物，其显示选择性抑制非识别ARS和延迟或停止天然包含非识别ARS的生物体的生长的能力。权利要求1.用于鉴别药物候选物的筛选方法，其中，所述方法包括以下步骤a)获得表达载体，所述表达载体包含编码天然存在的病原非识别tRNA合成酶的基因序列；b)用所述表达载体转化分离的哺乳动物细胞；c)在允许病原tRNA合成酶表达的条件下在营养培养基中使由(b)产生的重组细胞生长，引起病原tRNA合成酶表达导致细胞死亡或细胞分裂速率的降低；d)提供待测试的物质；和e)分析所得的细胞生长，其中如果细胞生长增加，那么所述物质选择性地抑制病原tRNA合成酶的活性，并且不影响其细胞直系同源物，导致所述物质为药物候选物。2.根据权利要求l所述的方法，其中在步骤(a)中获得的表达载体还包含编码天然存在的病原非识别tRNA合成酶的tRM底物的基因序列。3.根据权利要求l所述的方法，其中使用包含编码天然存在的病原非识别tRM合成酶的tRNA底物的基因序列的第二表达载体，在步骤(b)中转化所述哺乳动物细胞。4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述天然存在的病原非识别t-RNA合成酶选自Glu-tRNA合成酶和Asp-tRNA合成酶。5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述表达载体选自病毒或非病毒质粒、粘粒、噬粒、穿梭载体和yak。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述表达载体为腺病毒栽体。7.根据权利要求5-6中任一项所述的方法，其中所述载体包含用于基因表达的四环素-依赖性调节系统。8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述载体包含选择标记。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述选择标记为潮霉素。10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述天然存在的病原非识别tRNA合成酶来自细菌，并且测试所述物质以确定其是否为抗菌剂，所述抗菌剂通过选择性抑制表达入重组哺乳动物细胞的细菌来源的非识别t-RNA合成酶的功能而起作用。11.根据权利要求l-9中任一项所述的方法，其中所述天然存在的病原非识别tRNA合成酶来自真菌，并且测试所述物质以确定其是否为抗真菌剂，所述抗真菌剂通过选择性抑制表达入重组哺乳动物细胞的真菌来源的非识别t-RNA合成酶的功能而起作用。12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述天然存在的病原非识别tRNA合成酶来自原生动物，并且测试所述物质以确定其是否为抗寄生虫剂，所述抗寄生虫剂通过选择性抑制表达入重组哺乳动物细胞的原生动物来源的非识别t-RNA合成酶的功能而起作用。13.根据权利要求l-9中任一项所述的方法，其中所述天然存在的病原非识别tRM合成酶来自后生动物，并且测试所述物质以确定其是否为抑制剂，所述抑制剂通过选择性抑制表达入重组哺乳动物细胞的后生动物来源的非识别t-RNA合成酶的功能而起作用。14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述重组哺乳动物细胞为重组人类细胞。全文摘要用于鉴别药物候选物的筛选方法，其中，所述方法包括以下步骤a)获得表达载体，所述表达载体包含编码天然存在的病原非识别tRNA合成酶的基因序列；b)用所述表达载体转化分离的哺乳动物细胞；c)在允许病原tRNA合成酶表达的条件下在营养培养基中使由(b)产生的重组细胞生长，引起病原tRNA合成酶表达导致细胞死亡或细胞分裂的速率的降低；d)提供待测试的物质；和e)分析所得的细胞生长，其中如果细胞生长增加，那么所述物质选择性地抑制病原tRNA合成酶的活性，并且不影响其细胞直系同源物，导致所述物质为药物候选物。文档编号C12Q1/68GK101479390SQ200780024286公开日2009年7月8日申请日期2007年6月28日优先权日2006年6月28日发明者L·里瓦斯德普布拉纳,T·博里桑申请人:卡塔兰研究和高级研究院;巴塞罗那科学园厕所基金会;生物医学研究院厕所基金会