专利名称：含有源自身体的多个细胞种类的、能形成原始的器官样的细胞块的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有源自身体的多个细胞种类的、能形成原始的器官样的 细胞块的制造方法，以及通过该方法制造的细胞块。
背景技术：
由于近年来医学的惊人进步，通过除去病因，例如，癌症的外科切除 等对症疗法的治疗技术、或组织.脏器的生物体移植技术等，挽救人生命的
机会越来越高。但是，有时伴随患部切除，患者被治疗后的QOL大幅降 低所困扰。另外，依赖生物体移植的治疗也存在移植供体不足、排斥反应 等局限性。如果可以使由于外科治疗或意外事故而失去的组织、器官、脏 器等再生，那么就可以大幅改善患者的QOL。另外，再生医疗还可以谋求 消除生物体移植所存在的问题。从该观点出发，对再生医疗的期待度较高。
在再生医疗中获得成功的技术，主要以人工皮肤、人工骨骼、人工牙 齿等从形态方面和功能方面来看比较简单的组织为中心。重构成的人工皮 肤、人工骨骼有时已经可以被细胞吸收，为组织构建提供必要的信号。但 是，再生医疗技术所产生的人工皮肤.人工骨骼的分化的所有组成成分有 限。例如同种角质形成细胞、皮肤成纤维细胞等，有时分化成作为表皮的 结构物，被周围的器官编入，及至具有有屏障性质的角质层、基底膜，但 是被指出不会派生毛嚢、脂肪腺和汗腺等二次衍生物。
生物体组织通常是具有干细胞性质的细胞与具有体细胞性质的细胞共 存，通过两者的相互作用而成立，所述具有干细胞性质的细胞在自我复制 的同时，通过向分化的细胞传导信号等来供给分化的细胞，从而维持组织 的稳态，所述具有体细胞性质的细胞是接收来自所述具有干细胞性质的细
4胞的各种信号等来接收指令的、已经完成分化状态的细胞。例如，在脊推 动物的情况下，在大部分组织和器官形成中，间充质细胞与上皮细胞之间 的相互作用是必须的。在毛嚢的情况下，作为间充质细胞的毛乳头细胞承 担干细胞的性质，作为上皮细胞的角质形成细胞在分化成毛千(毛质本身) 的意义上，相当于具有体细胞性质的细胞。
再生医疗所产生的器官形成时的难度在于，^泉在实际的生物体组织内
的状态。在现有技术中，即使将上皮细胞与间充质细胞共培养，也只能是 共同完成分化，或者共同保持未分化状态中的一种，不会重现像才莫仿生物 体组织那样未分化状态与分化状态的细胞共存。
发明内容
本发明的课题是，通过将多种分化的身体细胞进行组合、培养，提供 可以形成原始的器官样的细胞块。 本申请包含以下发明。
(1) 含有源自身体的多个身体细胞种类的、能形成原始的器官样的细 胞块的制造方法，该方法包括，
准备所述多种的含有身体细胞的培养液，
将所述多种身体细胞培养液混合，然后向该混合细胞培养液中添加
Wnt信号激活剂，
将所述含有Wnt信号激活剂的培养液进行规定时间的非平面接触性 培养，
将所述经非平面接触性培养的培养物的培养基更换成不含有Wnt信 号激活剂的培养基，进一步培养少见定时间，这里所述多种身体细胞中的至 少l种保持未分化状态。
(2) 根据(1)所述的方法，所述多种身体细胞包含上皮系身体细胞和间充 质系身体细胞的组合，该间充质系身体细胞保持着未分化状态。
(3) 根据(2)所述的方法，所述上皮系身体细胞是角质形成细胞，所述间充质系身体细胞是毛乳头细胞。
(4) 根据(3)所述的方法，从所述细胞块形成具有毛嚢诱导功能的毛嚢。
(5) 根据(1) ~ (4)的任一项所述的方法，所述Wnt信号激活剂是6-溴靛 玉红-3，-將(6-bromoindirubin-3'-oxime， BIO)。
(6) 根据(1) ~ (5)的任一项所述的方法，所述非平面接触性培养方法是悬 滴方法。
(7) 含有源自身体的多个身体细胞种类的、能形成原始的器官样的细 胞块，该细胞块是通过下述方法制造的，所述方法包括，
准备所述多种的含有身体细胞的培养液，
将所述多种身体细胞培养液混合，然后向该混合细胞培养液中添加 Wnt信号激活剂，
将所述含有Wnt信号激活剂的培养液进行规定时间的非平面接触性 培养，
将所述经非平面接触性培养的培养物的培养基更换成不含有Wnt信 号激活剂的培养基，进一步培养规定时间，这里所述多种身体细胞中的至 少l种保持未分化状态。
(8) 根据(7)所述的细胞块，所述多种身体细胞包含上皮系身体细胞和间 充质系身体细胞的组合，该间充质系身体细胞保持着未分化状态。
(9) 根据(8)所述的细胞块，所述上皮系身体细胞是角质形成细胞，所述 间充质系身体细胞是毛乳头细胞。
(10) 根据(9)所述的细胞块，从所述细胞块形成具有毛囊诱导功能的毛嚢。
(11) 根据(7) ~ (10)的任一项所述的细胞块，所述Wnt信号激活剂是6-溴靛玉红-3，-肟(BI0)。
(12) 才艮据(7) ~ (ll)的任一项所述的细胞块，所述非平面接触性培养方法 是悬滴方法。
(13) 筛选具有育毛效果的药剂的方法，通过对(9) ~ (12)的任一项所述的 细胞块应用候选药剂来进行。(14)才艮据(13)所述的方法，将选自所述细胞块的c-myc、 BMP4和 IGFBP3的1个或多个基因的表达量作为指标。
图l是通过本发明的方法制成的细胞块的免疫染色图(l)，显示DP细 胞和NHEK细胞的染色。
图2是通过本发明的方法制成的细胞块的免疫染色图(2)，显示细胞块 中毛乳头细胞的定位。
图3是通过本发明的方法制成的细胞块的免疫染色图(3)，显示细胞块 中的细胞增殖。
图4是通过本发明的方法制成的细胞块的免疫染色图(4),显示p-联蛋
白(p-catenin)和NHEK细胞的染色。
图5是通过本发明的方法制成的细胞块的免疫染色图(5)，显示细胞块
中的发角蛋白表达。
图6是通过本发明的方法制成的细胞块的免疫染色图(6)，显示细胞块
中的毛芽标志物表达。
图7是来自本发明的细胞块的RNA中各种基因的表达(l)。 图8是来自本发明的细胞块的RNA中Wnt3A基因的表达。 图9是来自本发明的细胞块的RNA中WntlOB基因的表达。 图IO是来自本发明的细胞块的RNA中各种基因的表达(2)。
具体实施例方式
通过本发明，可以提供含有多种身体细胞种类的、能形成原始的器官 样的细胞块。
本发明中所谓身体细胞，是指完成了向构成生物体的各种器官的细胞 分化的细胞，即与未分化状态的干细胞相反的细胞。在本发明中，其特征 在于使用2种以上的身体细胞，优选可以是上皮细胞系与间充质细胞的组 合、内皮细胞与间充质细胞的组合、或者上皮细胞与间充质细胞与内皮细
7胞的组合等各种组合。
作为可以由本发明所涉及的细胞块形成的器官，并无特别限制，但可 以列举例如，毛嚢、肺、肾脏、肝脏、胰脏、脾脏、心脏、胆嚢、小肠、 结肠、大肠、关节、骨骼、牙齿、血管、淋巴管、角膜、软骨、嗅觉器官、 听觉器官等各种器官。
例如，在希望形成毛嚢时，例如可以使用源自头部的角质化表皮细胞 作为上皮细胞系，使用毛乳头细胞作为间充质细胞。这里所谓"上皮细胞" 是构成皮肤的表皮或上皮的大部分的细胞，是指由与真皮连接的1层基底 细胞生成的细胞。作为上皮细胞，既可以是源自新生儿(或胎儿)的上皮细 胞、源自成熟的皮肤例如休止期毛的表皮或生长期毛的表皮的细胞，又可 以是处于角质形成细胞形态的细胞的培养物。可用的细胞可以通过该领域 专业人员周知的方法从所要求的供体动物的皮肤来调制。所谓"毛乳头细
胞"，是指作为间充质细胞而位于毛嚢最底部，为了毛嚢的自我再生而向毛 嚢上皮干细胞传导激活信号，承担所谓指挥塔台功能的细胞。例如可以通
制细胞悬浮液，接着通过将该细胞悬浮液冷冻保存来杀死毛嚢上皮细胞， 从而调制"毛乳头细胞"。
另外，例如，对于嗅觉器官的重构建可以如下那样来进行调制。取出 哺乳动物、例如小鼠的嗅觉上皮细胞群的存在组织部位。通过胶原酶处理 消化组织，经离心分离、调制沉淀的细胞群。接着将细胞悬浮液注入用胶
原1或4被覆的细胞培养皿中，为了使附着性优异的嗅觉上皮细胞优先附 着而在5分钟左右迅速吸取悬浮液。残留在该培养皿中的上皮细胞可以转 移至细胞培养。进而残留的细胞中的大部分是上皮细胞。吸出后残余的悬 浮液中存在间充质细胞，但通过将悬浮液注入用纤连蛋白或明胶神皮覆的培 养皿中，在适当的气氛下，例如在37。C、 95%<:02下静置4小时以上，可 以将间充质细胞供给细胞培养。如上所调制的上皮和间充质细胞可以通过 与毛嚢器官的重构建同样的方法供给新的嗅觉器官构建。
进而，例如对于肾小球的重构建，可以如下那样进行调制。取出哺乳动物、例如小鼠的肾脏的存在组织部位。通过胶原酶处理消化组织并离心
分离，用100nm网除去粗大物。接着用40jim网将肾小球收集在网中，用 胰蛋白酶处理制成细胞悬浮液。将细胞悬浮液注入用胶原1或4 ^皮覆的细 胞培养JQL中，使上皮细胞优先附着。通过该处理，本细胞的大部分为源自 肾小球的上皮细胞。
另一方面，在肾脏中，发育时存在的间充质细胞在生物体中消亡了。 所以在本发明中，为了再次诱导组织重构建所必要的上皮间充质相互作用， 可以采用如下的方法。上皮细胞使用上述的源自肾脏的细胞。进而使用同 属的毛乳头细胞或源自骨髓的间充质干细胞作为失去的间充质细胞的代替 细胞。如上的上皮和间充质细胞可以通过与毛囊器官的重构建同样的方法 来供给新的肾脏器官构建。
对本发明所涉及的细胞的起源，根据其目的可以将各种哺乳动物作为 起源，没有限制，源自人，黑猩猩，其它灵长类，家畜动物例如狗、猫， 畜产动物例如牛、猪、马、绵羊、山羊，实验用动物例如兔、大鼠、小鼠、 豚鼠，更优选棵小鼠、SCID小鼠、棵大鼠等。另外，其组合既可以是同 种系也可以是异种系，但优选同种系。
对本发明所涉及的身体细胞培养有效的培养液并不特别限制，可以使 用在细胞培养中惯用的培养液。例如，对于间充质细胞，可以优选使用 DMEM、 MEM、 F12、张氏培养基(Chang medium)等含有血清型的培养 基。这时，血清浓度为0~ 300/Q,优选为100/。，作为必不可少的因子，添 加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和EGF(表皮生长因子)、2mM L-谷氨 酰胺。
在上皮细胞的情况下，优选Epilife(注册商标)、HuMedia(注册商标)(都 为夕，求々社制造)、Iiwitrogen SFM(Invitrogen公司)等无血清型的对角 质形成细胞进行了最适化的培养基。角质形成细胞根据情况可以用Green 法(Cell， 1975年11月，6巻(3): 331-343页，Serial cultivation of strain of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Rheinwalf J. G.， Green H.)来调制，但这时其培养可以使用上述间充质细胞所使用的含有血清型的培养基。此外，作为可以在上皮
细胞、间充质细胞的培养中通用的抗生素，可以列举青霉素G、卡那霉素、 链霉素、两性霉素B。
在本发明中，其特征在于，在上述多种身体细胞的混合物中添加Wnt 信号激活剂，进行培养。作为Wiit信号，是指促进p-联蛋白核转运、发挥 作为转录因子的功能的一系列作用。本信号源于细胞间相互作用，包括例 如，从某细胞分泌的称为Wnt3A的蛋白质进而作用于其它细胞，细胞内 的P-联蛋白进行核转运，作为转录因子发挥作用的一系列流程。 一系列流 程引起以上皮间充质相互作用为例的器官构建的最初现象。人们知道Wnt 信号通过激活P-联蛋白途径、PCP途径、Ca^途径三个途径，来控制细胞 的增殖和合化、器官形成和早期发育时的细胞运动等各种细胞功能。由于 Wnt信号所具有的维持该未分化状态的功能，可以为了抑制分化而在培养 ES细胞时使用(例如，NoburoSato等，Nature Medicine, IO巻第I期， 2004年1月)，但是对于在身体细胞培养中其使用和效果完全不清楚。
作为Wnt信号激活剂，并不特别限制，只要显示糖原合成酶激酶3 (GSK-3)的抑制活性即可，可以是任何物质，可以列举例如，双巧l咮(靛玉 红)化合物(BIO)((2，Z,3，E)-6-溴靛玉红-3，-將)、其丙酮將类似物BIO-丙酮將 ((2，Z，3，E)-6-溴靛玉红-3，-丙酮肟)、噻二唑烷(TDZD)类似物(4-节基-2-甲基 -1,2，4-噻二唑烷-3，5-二酮)、氧代噻二唑烷-3-硫酮类似物(2，4-二节基-5-氧代 噻二唑烷-3-硫酮)、噻吩基-01-氯甲基酮化合物(2-氯-1-(4，4-二溴噻吩-2-基)-乙酮)、苯基-a-溴甲基酮化合物(a-4-二溴苯乙酮)、含有噻唑的脲化合物 (N-(4-甲氧基千基)-N，-(5-硝基-l，3-噻唑-2-基)脲)，以及GSK-邓肽抑制剂例 如HKEAPPAPPQSpP-NH2，等等。
对Wnt信号激活剂的添加量并不特别限制，只要其量能够实现激活 Wnt信号、换而言之实现抑制GSK-3,且不停止细胞增殖即可，依据所使 用药剂的种类和应该增殖的细胞的种类，由本领域技术人员适当决定。例 如，在毛乳头细胞中^f吏用BIO作为Wnt信号激活剂时，其量例如0.1jiM 10jiM左右为适量，但当然不限于这样的量。本发明的另 一特征是将在上述多种身体细胞的混合物中添加了 Wnt 信号激活剂的混合物进行非平面接触性培养。所谓非平面接触性培养是在 具有球面的界面上培养细胞使得平面附着性细胞不附着的方法。作为非平 面接触性培养方法的例子，有悬滴法(Kdler G. M.等，Curr. Opin. Cell Biol., 7巻，862-869页，1995年)。所谓悬滴法是下述的方法将含有培 养细胞的培养液的液滴(一般为25 ~ 3^L左右)点在培养皿盖的顶部内侧， 小心合上盖使得培养液不要落下或流下，通过表面张力以倒置的液滴的状 态来培养培养液内的细胞。通过这样培养，可以使细胞在平面培养等情况 下由于与平面接触而受到的影响为最小限。作为其它非平面接触性培养方 法的例子，有使用预先进行了表面加工使得细胞不能附着的半球状细胞培 养皿(例如住友X—夕，xf卜所销售的"7:7工口< K")的形成方法(球状体 形成方法)，通过在硝酸纤维素培养基内培养以浮游状态使细胞凝集的浮游 方法，等等。
用于非平面接触性培养的温度、时间可以依据所处理细胞的种类、传 代次数而变化，例如在37T:进行1 ~ 10天，优选进行3 ~ 7天，如果必要 用同样的培养基进行适当更换。
最后通过将上述培养基换成不含有Wnt信号激活剂的培养液，从而将 细胞在不存在Wnt信号的状态下进一步进行非平面接触性培养。这时培养 时间和温度也可以依据所处理细胞的种类、传代次数而变化，例如在37。C 进行1 ~ 10天，优选进行3 ~ 7天，如果必要用同样的培养基进行适当更换。
根据本发明，可以效率良好地人工制成对例如毛嚢移植、各脏器移植、 以及不完成完全的脏器但构成脏器的微小器官的部分移植等有用的细胞 块，所述微小器官例如，角膜、肾小球、嗅觉上皮组织、软骨部位。另夕卜， 人工制成的细胞块通过供给药剂评价，可以更正确地评价药剂对生物体内 器官的作用。另外，通过在像棵小鼠、SCID小鼠那样的免疫缺陷动物中 移植细胞块，可以制成完成度更高的器官样组织，例如通过异位地制成人 毛囊、小鼠肾等，可以制成能够进行新型药剂评价和基因功能评价的模型 动物。特别是在制成细胞块时通过对细胞实施基因导入或改变，可以简便
ii地制成具有报告基因的重构建器官，可以正确地把握调查组织和器官水平 上的生物体内分子行为。
在本发明所涉及的细胞块中，上皮系身体细胞是角质形成细胞，并且 间充质系身体细胞是毛乳头细胞，而且，在形成具有毛嚢诱导功能的毛嚢 的情况下，该细胞块可以在显示育毛效果的药剂的评价中、例如这样的药 剂的筛选中使用。例如，将育毛药剂的候选药剂应用于该细胞块，与对照 比较，在细胞块的生长变得显著时判定为具有育毛效果的药剂，或者以促
进毛生长的基因、例如c-myc的表达增强为指标，或以抑制毛生长的基因、 例如BMP4、 IGFBP3基因等的表达抑制为指标，可以判断有无育毛效果。
实施例 毛乳头细胞
通过供体所提供的头皮组织来调制源自人的毛乳头细胞。在除去真皮 组织之后，在立体显微镜下使用镊子和眼科剪刀釆集脂肪组织内所存在的 毛嚢部位。将采集的毛嚢移入加入了抗生素的培养液内，进一步在同样显 微镜下目测分离采集毛乳头细胞部位。分离的毛乳头细胞在培养基内于 10cm的圆形培养皿(TRP公司制造)中，在37°C 、 95 % C02下培养1周以 上，供给之后的实验。使用的培养基为Advanced-DMEM(Invitrogen)、 15 0/o胎牛血清、20ng/ml的bFGF、 10ng/ml的EGF、 2mM的L-谷氨酰胺、 青霉素'链霉素.两性霉素混合液(IOO倍稀释)、3.5pl/500ml的p巯基乙醇。 将细胞在相同的条件下适当进行传代培养。传代时，用0.5%胰蛋白酶 /EDTA溶液进行细胞剥离，将细胞移入新的培养亚中，用同样组成的新鲜 培养基进行传代培养。
在添加BIO(Calbiochem公司)时，用DMSO(二甲基亚砜)溶解成 lOmM,进行添加使得其为0.1 ~ 5nM。 角质形成细胞^
如下操作来调制源自人正常新生儿周皮的角质形成细胞。将从供体采 集的周皮组织在存在介軟酶的PBS(-)内以4。C处理一夜左右。通过该处理可以以片状仅收集表皮，将其用与传代时同样的方法用0.25%胰蛋白酶进 行消化调制，连同培养基移至胶原处理过的培养皿中，进行培养。使用 Humedia KG2(夕，求々社)作为培养基。将细胞在相同的条件下适当进行 传代培养。传代时，用0.5。/。胰蛋白酶/EDTA溶液进行细胞剥离，将细胞 移入新的培养皿中，用同样组成的新鲜培养基进行传代培养。将进行如上 所述操作收集的经培养的细胞供给之后的实验。
在添加BIO(Calbiochem公司)时，用DMSO(二曱基亚砜)溶解成 10mM，进行添加4吏得其为0.1 ~ 5jiM。 悬滴培养 培养基组成
将30% Advanced曙DMEM(Invitrogen公司)、2mM的L-谷氨酰胺、 青霉素.链霉素混合液(Invitrogen公司)(100倍稀释)、3.5nl/500ml的卩巯基 乙醇与Humedia KG-2(夕，求夕社)以1:1进行混合。
在添加Bio(Calbiochem公司)时，用DMSO(二甲基亚砜)溶解成 10mM，进行添加使得其为0.1 ~ 5nM。 制成方法
毛乳头细胞为P3(将传代数1记为Pl)以上有Bio负荷或无Bio负荷， 对表皮角化细胞准备了 P3以内的细胞。
在胰蛋白酶处理之后，用各自的培养基进行稀释，使得各细胞为lxl05个。
在添加Bio(Calbiochem公司)时，用DMSO(二曱基亚砜)溶解成 10mM，进行添加使得其为0.1 ~ 5pM。
在10cm见方的正方形培#^(盖)的顶部内侧滴加各培养液25~35jil 进行混合，制成适当大小的官顶上的水滴。
小心合上盖，使得培养液不会落下，在37°C、 5%<:02气氛下进行培养。
3天后，用与上述所使用的相同的培养基进行培养基更换。 再培养4天之后，将一部分供给下述的RT-PCR分析(l)。其余部分将全部培养基换成无Bio条件下的培养基。
在第3天进行同样的培养基更换，在第7天回收生成的细胞块，供给 下述的免疫染色。 免疫组织荧光染色
将悬滴法所得各细胞块用0.1%低聚甲醛固定5分钟，供给之后的染 色。另外，将一部分细胞块在未固定的状态下包埋在OCT液中，用恒冷 切片机制作冷冻切片，进行免疫组织染色。
在含有13。/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS(-)内进行封闭6小时。
将下述表所示各种 一 次抗体用上述含有13 %牛血清白蛋白(BSA)的 PBS(-)稀释成1/200，添加到各样品中，在4。C反应4小时。
用含有0.02 %吐温20的PBS(-)洗涤3次。
将用上述含有13。/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS(-)稀释成1/200的荧光 二次抗体(参考EXCEL文件)添加到各样品中。另夕卜，用DAPI(4，，6-二脒基
-2-苯基吲哚)将细胞核染成蓝色。
用荧光显微镜(OLYMPUS)进行观察。 表l
目的蛋白质制造公司详细
一次抗体CD49fScrotcc大鼠抗人/ 小鼠CD49f
波形蛋白YLEM单克隆
P联蛋白^<夕卜/，、一 y年:/y单克隆
名称制造公司详细
荧光山羊抗大鼠IgG^卞夕乂;x一厶/红
二次抗体缀合有德克萨斯红
兔抗小鼠IgGInvitrogen黄
ALEXAFLUOR488
这里，因为对波形蛋白的单克隆抗体特异性地染色毛乳头细胞，CD49f 多克隆抗体特异性地染色表皮细胞，所以应用波形蛋白抗体和CD49f抗体 于免疫细胞染色中，可以评价本实验系统所生成的细胞块内的细胞的属性。
图l是显示上述显微镜观察结果的黑白照片图。在同图的彩色版中， 可以看清绿色的波形蛋白抗体产生的染色、红色的CD49f抗体产生的染色,
14可以理解成分别为毛乳头细胞、角质形成细胞。另外，如图2所示，可以 确认毛乳头细胞凝集在细胞块的中心部分。由这些图的结果，观察到细胞 在凝集化之后规则地排列，明确了通过本实验体系，上皮细胞与间充质细 胞规则正确地排列。在添加BIO而生成细胞块之后，观察到在未添加BIO 的状态下培养的细胞块中，被染成红色的角质形成细胞规则正确地生长成 分枝状。进而图3表明了，在添加BIO而生成细胞块的情况下，毛乳头凝 集而存在的中心部分、和发展成分枝状的细胞块的尖端部分对增殖标志物 Ki67为阳性。根据以上结果，通常惯例是凝集的身体细胞处于不生长的休 眠状态，但由于BIO的效果而在细胞块中引起细胞的增殖可以说是令人惊 讶的发现。
另外，将p联蛋白单克隆抗体用于干细胞性质的标志物。因为P联蛋 白在通常的身体细胞中少量存在于细胞膜附近，所以通过通常的荧光免疫 抗体染色仅能微弱地检测到。但是，在具有干细胞性质的细胞中，p联蛋 白在核内作为转录因子发挥作用，其量也增加。进而，因为在核内积累， 所以即使用荧光免疫抗体染色法也可以确认强局部化的状态。在本实验中， 也因为在细胞块的一部分特异性位置p联蛋白被强烈染色而可以确认聚集 的状态，所以可以说，通过P联蛋白抗体的染色适于检测细胞块内的具有 干细胞性质的细胞。
图4是显示通过上述p联蛋白单克隆抗体染色的显微镜观察结果的黑 白照片图。同图的彩色版用绿色显示p联蛋白抗体产生的染色部位，用红 色显示角质形成细胞。确认了发出强烈绿色光的部位的p联蛋白阳性细胞， 显示了细胞的千细胞性质。应该特别提到的是在细胞块的球状部位存在中 心部分发出黄色光的部分。显示该部位是P联蛋白阳性且是角质形成细胞。 P联蛋白阳性细胞如上所述可以说是具有干细胞性质的细胞。另一方面， 可以观察到，从细胞块发展成枝状的角质形成细胞(红)的部位没有发出黄 色光的部位，即在同一细胞块内具有干细胞性质的细胞与具有通常的体细 胞性质的细胞(角质形成细胞)共存。这是在通常的培养状况中观察不到的 情况，可以认为上皮间充质相互作用恰如在体内那样被重现，未分化和分
15化了的细胞群自主地形成细胞块并生长。
这里所谓未分化的角质形成细胞，是指像毛母细胞那样稳定地制造出构建毛的角质形成细胞的、具有干细胞能力的细胞。另一方面分化了的角质形成细胞增殖次数是有限的，是指所谓的确定了变成毛的细胞命运的细
胞。同时在图4的彩色版中包围发绿光的球体的细胞被认为是毛乳头细胞，在该细胞块的环境下毛乳头细胞是P联蛋白阳性细胞，这与Wnt信号在体内在毛嚢形成和开始生长中是重要的类似，可以说是重要的一点。
使用针对表皮角化细胞、外毛根鞘细胞中表达的细胞角蛋白14(K14)的抗体，用于确认这些细胞没有分化成毛干(红色)。因为与发角蛋白特异性反应的AE13单克隆抗体(Lynch等，JCellBiol， 103巻，2593页，1986年)识别44K/46K的酸性发角蛋白二聚体，所以用于标记分化成毛干的状态(绿色)。发角蛋白是在通常的表皮角化细胞中基本完全不存在的、毛嚢特异性的 结构蛋白质。图5是显示其显微镜观察结果的黑白照片图。在同图的彩色版中，在用毛乳头细胞与表皮角化细胞制作的细胞块中不能看到被AE13抗体染色的部分，但如果用BIO刺激，则看到一部分染色。在用毛乳头细胞与外毛根鞘细胞制作的细胞块中，可以看到在无BIO刺激时被AE13抗体染色的部分，由于BIO刺激AE13抗体产生的染色性显著提高。另一方面，因为不能看到在所有的细胞块中被K14抗体(红)与AE13抗体(绿)两者染色的部位(发黄色光的部位)，所以认为发生了从表达细胞角蛋白14的未分化细胞向产生发角蛋白的细胞的变化。
使用针对生毛期的毛芽中特异性表达(Ogawa等，Exp Dermatol， 13巻，401页，2004)的人上皮抗原的Ber-EP4抗体，用于标记生毛期的毛芽(绿色)。图6是显示其显微镜观察结果的黑白照片图。在同图的彩色版中，在用毛乳头细胞与外毛根鞘细胞制作的细胞块中，用BIO刺激时清晰地观察到Ber-EP4抗体产生的免疫染色性(绿)。因为不能看到,皮K14抗体(红)和Ber-EP4抗体(绿)二者染色的部位(发黄色光的部位)，所以可以认为发生了从表达细胞角蛋白14的未分化细胞向分化成表达Ber-EP4的毛芽的细胞的变化。RT-PCR分析(l)
使用TRIZOL(Invitrogen)从各样品提取RNA。将相当于200ng各RNA在RevTraACE(TOYOBO)50nl的反应体系中逆转录成cDNA。使用下述的引物，在50fil的体系中，将lfil得到的样品加入PCR反应。使用的酶是KOD-DASH(TOYOBO)，使用[在95。C、 60秒，将(在95。C、 30秒，在63°C、 15秒，在72。C、 30秒)进行40个循环，在72。C、 60秒的反应程序。
将10fU反应液在2 %琼脂糖凝胶(COSMOBIO)/TAE緩冲液内以100V进行电泳。使用的DNA大小标记物是100bp随才几标志物(TOYOBO)。
使用的引物如下所述，PCR的结果示于图7。
表2
正义引物(正链)反义引物(反链)
Lef-lgctatcaaccaga"cttggcagaagg (序列编号1)cagctgtcattcttggacctgtacctg (序列编号2)
SHHctacgagtccaaggcacatatccactg (序列编号3)tccaggaaagtgaggaagtcgctgtag (序列编号4)
STAT3aagaccggcgtccagttcactactaaag (序列编号5)ggtcaagtgtttgaattctgcagagagg (序列编号6)
多功能蛋白聚糖(Versican)tccaagttatgttggtgcactttgtgag (序列编号7)tcaaacatcttgtcattgaggcctatcc (序列编号8)
TWIST-1ggccaggtacatcgacttcctctac (序列编号9)tctccttctctggaaacaatgacatc (序列编号10)
P-联蛋白cgcg3g肌gatgacccag3tcatg (^列编号11)ccacaggactccatgcccacg (序列编号12)
使用p-联蛋白作为整个实验的对照。
Lef-l是Wnt信号的下游基因，如图7所示，无论在存在BIO和不存在BIO的任一状态下都可以在本实验体系中检测到。在看到Lef-l的基因表达时，意味着细胞中Wnt信号发挥作用。所以，可以理解成在本实验体系中，由于添加BIO， Wnt信号向细胞内发挥作用。
SHH(Sonic Hedge Hog)是与组织形成时相关的基因，如图7所示，在存在BIO和不存在BIO的任一状态下在本实验体系中都检测不到。SHH是接收Wnt和Lef-l的信号而转录表达的基因。本基因表达显示，Wnt信号作用于细胞，进而发生像在体内发生的那样的连锁基因表达。同时，SHH是承担上皮间充质之间的细胞间信号的蛋白质，故而同时还提示发生了上皮间充质相互作用。
STAT-3(信号转导及转录激活蛋白3， SIGNAL TRANSDUCER ANDACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 3)是毛嚢诱导相关基因，如图7所示，与不存在BIO情况下相比，在存在BIO情况下被显著地检测到。STAT-3是细胞内的信号传导蛋白，据说与干细胞的自身增殖相关。该基因的增强^JI、性干细胞自身增殖与维持万能性必不可少的因子，是显示其千细胞性质的标志物之一。同时，如论文SanoS.等，Nature Med., 11巻43-49页，2005年"Stat3 links activated keratinocytes and immunocytesrequired for development of psoriasis in a novel transgenic mouse model."所述那样，SATA-3是向毛的生长期转换中非常重要的基因，从这方面来看，在本实验体系中STAT-3的转录增强，提示之后将踏入生长成毛嚢时的正常阶段。同时，STAT-3信号本身并不直接受BIO的影响(SatoN等，Nat Med.， 2004年1月，10巻(l): 55-63页,电子版2003年12月21日，"Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cellsthrough activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specificinhibitor"),即，STAT-3在添加BIO时的增强显示，由于上皮间充质相互作用而在细胞块内生成干细胞维持系统。
TWIST-1是胚性间充质系干细胞的标志物，提示毛乳头细胞具有极高的干细胞性质。因为TWIST-1在身体细胞的表达仅限于包括骨髓性间充质干细胞的极为稀少的细胞种类，所以毛乳头细胞虽然作为身体细胞，但可以说是具有较高干细胞性质的细胞。在图7的RT-PCR实验中，模板使用等量的总RNA来进行RT-PCR。在BIO存在下看起来表达降低，这是因为如由图l和2可以观察到的那样，在总细胞数中毛乳头细胞的数量相对降低的原因。作为结论，即使在考虑表达量的多少之后，表达TWIST-1基因的细胞也持续存在，这提示，在本实验中能够具有干细胞能力的毛乳头细胞持续存在。
多功能蛋白聚糖基因是由于诱导生毛时在毛乳头细胞中强烈表达而为人们所知的生毛标志物(Kishimoto等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999年，7336-7341页)。在图7的RT-PCR实验中，模板使用等量的总RNA来进行RT-PCR。在BIO存在下看起来表达降低，这是因为如由图1和2可以观察到的那样，在总细胞数中毛乳头细胞的数量相对降低的原因。作为结论，即使在考虑表达量的多少之后，表达多功能蛋白聚糖基因的细胞也持续存在，这提示，在本实验中能够具有诱导生毛能力的毛乳头细胞持续存在。
从各种基因的表达水平的变化可以说，由于在细胞块内BIO的直接效果，维持了上皮和间充质细胞的未分化性，并且引起了疑似通过Wnt信号的上皮间充质相互作用。另外，因为像STAT-3那样可以看到出现了与Wnt信号无关的干细胞性质，所以可以说，BIO效果有助于创造具有自主的细胞间相互作用与增殖能力的细胞块。Wnt3A RT-PCR
毛乳头细胞为P3(将传代数1记为Pl)有Bio负荷，对角质形成细胞准备了 P3以内的细月包。
在胰蛋白酶处理之后，用各自的培养基进行稀释，使得各细胞为3xl03个。
用DMSO(二甲基亚砜)将Bio(Calbiochem公司)溶解成10mM，进行添加4吏得其为0.1 ~ 5jiM。
在10cm见方的正方形培养皿(盖)的顶部内侧滴加各培养液25~35fU进行混合，制成适当大小的官顶上的水滴。
小心合上盖，使得培养液不会落下，在37。C、 5%<:02气氛下进行培养。
3天后，用与上述所使用的相同的培养基进行培养基更换。在第7天回收样品，供给如下所述的RT-PCR分析(2)(图8的"0天")。进而对剩余的同样细胞将培养基更换成无Bio条件的培养基，进行分化诱导，将在第3天回收的样品同样供给如下所述的RT-PCR分析(2)(图8的"3天，，)。RT-PCR分析(2)
使用TRIZOL(Invitrogen)从各样品提取RNA。将相当于200ng各RNA在RevTraACE(TOYOBO)50fi1的反应体系中逆转录成cDNA。使用下述的引物，在50jil的体系中，将lpl得到的样品加入PCR反应。使用的酶是KOD-DASH(TOYOBO),使用[在94°C、 2分钟，将(在94°C、 30秒，在63。C、 10秒，在72。C、 30秒)进行32个循环，在72。C、 2分钟的反应程序。
正义引物(正链)caggaactacgtggagatcatg (序歹'J编号13)反义引物(负链)ccatcccaccaaaactcgatgtc (序列编号14)将10jil反应液在2 %琼脂糖凝胶(COSMOBIO)/TAE緩沖液内以100V进行电泳。在用溴化乙锭可视化之后，检测目的条带。
将其结果示于图8。图中，用箭头表示的是Wnt3A的条带。人们知道Wnt3A自身表达稀少，主要由上皮细胞表达，是与器官形成、上皮细胞-间充质细胞相互作用相关的基因。如图所示，在通过于BIO存在下培养而激活了 Wnt信号的细胞中，完全看不到Wnt3A表达，相反，在之后通过除去BIO而诱导了细胞分化的细胞中，看到了 Wnt3A表达。因此明确了，在本实验体系中，通过在BIO存在下培养之后除去BIO进行培养，可以诱导角质形成细胞分化，进而诱导自主的器官形成。Wntl0B RT-PCR
毛乳头细胞为P3(将传代数1记为Pl)无Bio负荷，对外毛根鞘细胞准备了 P3以内的细胞。
在胰蛋白酶处理之后，用各自的培养基进行稀释，使得各细胞为3xl03个。
用DMSO(二甲基亚砜)将Bio(Calbiochem公司)溶解成10mM，进行添加使得其为0.1 ~ 5fiM。
在10cm见方的正方形培养皿(盖)的顶部内侧滴加各培养液25~35jil进行混合，制成适当大小的官顶上的水滴。
小心合上盖，使得培养液不会落下，在37。C、 5。/。C02气氛下进行培养。
3天后，用与上述所使用的相同的培养基进行培养基更换。在7天后回收样品，供给如下所述的RT-PCR分析(3)(图9的"7天")。进而对剩余的同样细胞将培养基更换成无Bio条件的培养基，进行分化诱导，将在IO天后和14天后回收的样品同样供给如下所述的RT-PCR分析(3)(图9的"IO天"和"14天")。RT-PCR分析(3)
使用TRIZOL(Invitrogen)从各样品提取RNA。将相当于200ng各RNA在RevTraACE(TOYOBO)50ji1的反应体系中逆转录成cDNA。使用下述的引物，在20jil的体系中，将化l得到的样品加入定量PCR(LightCycler系统，Roche)。 4吏用LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenI (Roche)的反应程序[将在95。C、 10秒，在63。C、 10秒，在72。C、 15秒进行40个循环。
正义引物(正链)gaagttctctcgggatttcttggatcc (序列编号15)反义引物(负链)cggttgtgggtatcaatgaagatgg (序列编号16)将其结果示于图9。数据全部表示为对在细胞块中不负荷BIO时的3天后表达量的相对表达量。人们知道Wntl0B在毛嚢的形态形成期与生毛期主要由上皮细胞表达，是参与上皮细胞-间充质细胞相互作用的基因。如图所示，在通过于BIO存在下培养而激活了 Wnt信号的细胞中，只要在BIO存在下培养，就看到Wntl0B的表达仅为与在BIO不存在下培养的对照相同的程度，相反，在之后通过除去BIO而诱导了细胞分化的细胞中，WntlOB表达经时地升高。因此明确了，在本实验体系中，通过在BIO存在下培养之后除去BIO进行培养，可以诱导毛嚢上皮细胞(外毛根鞘细胞)分化，进而诱导自主的器官形成。细胞块对生毛药剂环孢菌素A的反应性
作为免疫抑制剂的环孢菌素A,是作为其副作用的多毛症(Lutz等，Skin Pharmacol, 7巻101页，1994年)为人们所知的药剂，已经明确其显示生毛作用(Paus等，Lab Invest, 60巻，365页，1989年)、促进毛生长作用(Taylor等，J Invest Dermatol, 100巻，237页，1993年)。
毛乳头细胞为P3(将传代数1记为Pl)无Bio负荷，对外毛根鞘细胞准
21备了 P3以内的细胞。
在胰蛋白酶处理之后，用各自的培养基进行稀释，使得各细胞为3xl03个。
在10cm见方的正方形培养皿(盖)的顶部内侧滴加各培养液25~35jil进行混合，制成适当大小的,顶上的水滴。
小心合上盖，使得培养液不会落下，在37°C、 5。/。C02气氛下进行培养。
3天后，用与上述所使用的相同的含有环孢菌素A的培养基进行培养基更换。用乙醇将环孢菌素A(Novartis公司)溶解成lOmM，进行添加使得其为0.1 ~ lOyiM。
在添加环孢菌素A的3天后回收样品，供给如下所述的RT-PCR分析
(4)。
RT-PCR分析(4)
使用RNeasy试剂盒(QIAGEN)从样品提取RNA。将相当于2000ng各RNA在Superscript II (Invitrogen) 20jil的反应体系中逆转录成cDNA。使用下述的引物，在20nl的体系中，将ljil得到的样品加入定量PCR(LightCycler系统，Roche)。 4吏用LightCycler FastStart DNA MasterSYBR Green I (Roche)的反应程序[将在95°C 、 10秒，在58。C、 10秒，在72°C、 15秒进行40个循环。BMP4
正义引物(正链)gggcacctcatcacacgact (序歹'J编号17)反义引物(负链)ggcccaattcccactccctt (序列编号18)c-myc
正义引物(正链)ttctctccgtcctcggattctctg (序列编号19)反义引净勿(负链)cagcagaaggtgatccagactctgac (序歹'J编号20)IGFBP3
正义引物(正链)acagccagcgctacaaagtt (序歹'J编号21)反义引物(负链)tagcagtgcacgtcctcctt (序列编号22)
22将其结果示于图10。数据全部显示为对不添加环孢菌素A时的相对表 达量。人们知道，BMP4在毛嚢的形态形成期和生毛期主要由毛乳头细胞 表达，是对上皮细胞-间充质细胞相互作用发挥抑制作用的基因(Hens等， Development, 134巻，1221页，2007年)。如图所示，BMP4的表达量达 到60%左右，表达显著降低。另外，人们知道，c-myc在生毛期的突起区 域、生长期的毛母细胞中强烈表达，是对毛嚢上皮细胞的增殖发挥正面作 用的基因(Bull JJ等，Invest Dermatol, 116巻，617页，2001年)。如图所 示，c-myc表达增强到接近1.5倍。进而，IGFBP3作为抑制毛生长的因子 为人们所知(Weger等，J Invest Dermatol, 125巻，847页，2005年)，明 确了其在休止期表达升高(Schlake等，Gene Expr. Patterns， 4巻，141页， 2004年)。如图所示，IGFBP3表达达到60%左右，表达显著降低。因此 明确了，在本实验体系中，与生毛和毛生长相关的基因由于环孢菌素A而 变化，从而明确了可以在影响生毛、毛生长的药剂的评价中使用本实验体 系。
权利要求
1. 含有源自身体的多个身体细胞种类的、能形成原始的器官样的细胞块的制造方法，所述方法包括，准备所述多种的含有身体细胞的培养液，将所述多种身体细胞培养液混合，然后向该混合细胞培养液中添加Wnt信号激活剂，将所述含有Wnt信号激活剂的培养液进行规定时间的非平面接触性培养，将所述经非平面接触性培养的培养物的培养基更换成不含有Wnt信号激活剂的培养基，进一步培养规定时间，这里所述多种身体细胞中的至少1种保持未分化状态。
2. 根据权利要求l所述的方法，其中所述多种身体细胞包含上皮系身 体细胞和间充质系身体细胞的组合，该间充质系身体细胞保持着未分化状 态。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述上皮系身体细胞是角质形成 细胞，所述间充质系身体细胞是毛乳头细胞。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中从所述细胞块形成具有毛囊诱导 功能的毛囊。
5. 根据权利要求1 4的任一项所述的方法，其中所述Wnt信号激活 剂是6-溴靛玉红-3，-肟(BI0)。
6. 根据权利要求1~5的任一项所述的方法，其中所述非平面接触性 培养方法是悬滴方法。
7. 含有源自身体的多个身体细胞种类的、能形成原始的器官样的细胞 块，该细胞块是通过包括下述步骤的方法制造的，准备所述多种的含有身体细胞的培养液，将所述多种身体细胞培养液混合，然后向该混合细胞培养液中添加 Wnt信号激活剂，将所述含有Wnt信号激活剂的培养液进行规定时间的非平面接触性 培养，将所述经非平面接触性培养的培养物的培养基更换成不含有Wnt信 号激活剂的培养基，进一步培养规定时间，这里所述多种身体细胞中的至 少l种保持未分化状态。
8. 根据权利要求7所述的细胞块，其中所述多种身体细胞包含上皮系 身体细胞和间充质系身体细胞的组合，该间充质系身体细胞保持着未分化 状态。
9. 根据权利要求8所述的细胞块，其中所迷上皮系身体细胞是角质形 成细胞，所述间充质系身体细胞是毛乳头细胞。
10. 根据权利要求9所述的细胞块，其中从所述细胞块形成具有毛嚢 诱导功能的毛嚢。
11. 根据权利要求7~10的任一项所述的细胞块，其中所述Wnt信号 激活剂是6-溴靛玉红-3，-肟(BI0)。
12. 根据权利要求7~11的任一项所述的细胞块，其中所述非平面接 触性培养方法是悬滴方法。
13. 筛选具有育毛效果的药剂的方法，所述方法通过对权利要求9 12 的任 一 项所述的细胞块应用候选药剂来实施。
14. 根据权利要求13所述的方法，所述方法将选自所述细胞块的 c-myc、 BMP4和IGFBP3的1个或多个基因的表达量作为指标。
全文摘要
本发明提供含有源自身体的多个身体细胞种类的、能形成原始的器官样的细胞块的制造方法，该方法包括，准备所述多种的含有身体细胞的培养液，将所述多种身体细胞培养液混合，然后向该混合细胞培养液中添加Wnt信号激活剂，将所述含有Wnt信号激活剂的培养液进行规定时间的非平面接触性培养，将所述非平面接触性培养的培养物的培养基更换成不含有Wnt信号激活剂的培养基，进一步培养规定时间，这里所述多种身体细胞中的至少1种保持未分化状态。
文档编号C12N5/071GK101479376SQ20078002420
公开日2009年7月8日 申请日期2007年6月27日 优先权日2006年6月27日
发明者岸本治郎, 相马勤, 藤原重良 申请人:株式会社资生堂