专利名称：一种筛选、识别干细胞的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种啮齿动物、人类或其他哺乳动物干细胞筛选、识别试剂盒。
背景技术：
众所周知，干细胞具有下述特征1)长期的自我更新能力；2)能够产生高度分化的其它种类细胞；3)本身处于未分化状态；4) 一般处于慢周期或静息状态；5)组织中处于相应的小生境(niches)内。干细胞包括胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)和成体干细胞(Adult Stem Cells, ASCs)，胚胎干细胞是全能性的，在理论上于体内可以再生身体内几乎任意组织，但由于其一方面在获取的伦理、道德等方面遇到了问题，另一方面其在应用上遇到了较为严重的问题，例如移植的胚胎干细胞可控性差，有生长为肿瘤的风险，并且其在移植受体后将会受到受体免疫系统的排斥等等，从而限制了其应用。鉴于胚胎干细胞研究及应用所遇到的上述问题，科学家期望通过核编程的方式让成体细胞能够回到类胚胎干细胞的状态，经过几十年的研究，终于，在2006年日本科学家山中伸弥(Yamanaka S, Cell, 2006. 126(4) :663-676,日本专利 2008-131577)采用四个诱导因子0ct4、nanOg、sox2等导入正常人成纤维细胞内，成功重编程其为类胚胎干细胞，被称为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，该细胞具有类似人类胚胎干细胞的特性，它虽然与胚胎干细胞相似，具有能分化成生物体内所有组织的潜力，但是 Lowry 和 Plath 发现(Lowry 等，Cell Stem Cell, 2009. 5 (1) :111-123)，当进行分子标签比较的时候，胚胎干细胞中某些基因的表达明显与iPS细胞不同，与胚胎干细胞相比，iPS 细胞研究仍有问题亟待解决，例如iPSCs具更高基因畸变频率(Loring等，CellStemCell, 2011.8(1) :106-118)、致瘤性风险、编程效率低等等需要克服，因而，尽管研究人员取得了令人印象深刻的进展，要把细胞再编程用于治疗疾病还需要更多一些突破。成体干细胞是另外一类具有修复、再生、替代能力的未分化细胞类型，通常位于特定的小生境内，在受到外界损伤后，其会动员或者产生新的干细胞，通过增殖、分化的方式形成新的功能细胞，从而调节组织和器官细胞数量保持动态平衡。成体干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞得以发现。造血干细胞是目前研究的最为详尽的成体干细胞之一，在过去近40年里一直是干细胞领域研究的主题，它们在体内进行自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化为所有的造血成份，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓得以恢复。成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用先决条件和最关键条件之一是对干/ 祖细胞的有效识别、筛选分离。最近越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成熟组织 (Moore ΚΑ, Science, 2006. 311(5769) :1880-1885)，并且很可能是由处于静息态(细胞周期外且低代谢状态)和激活(细胞周期内且不能保留DNA标记)态的干细胞共存(Li等， Science, 2010. 327(5965) :542-545)，但从成体中分离干细胞仍是极具挑战性的任务，一方面在于其数量较少且更难于定位、筛选分离各种组织特异性干细胞，另外一方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进行识别。当前，主要有以下现有技术公开了如何得到相关的成体干细胞1)采用分子标志物筛选候选的干细胞，例如Thy-Ι1 或 FLK2-Lineage_Sca-l+c-Kit+ 分选造血干细胞群(Christemsen JL 等，PNAS，2001. 98 14541-14546 ；UchidaN 等，Experimental hematology, 1996. 24 :649-659)，用 CD14+ 免疫磁性分离的方法从外周血筛选新的干细胞群(PCT/055950干细胞的提纯、识别及用途) 用 α J5briIOGTtwm (LiA 等，PNAS，1998. 95 (7) :3902-3907 ；Tani H 等，PNAS，2000. 97 (20) 10960-10965 ；Lavker RM 等，PNAS，2000. 97 (25) :13473-13475)识别人类、啮齿动物来源的上皮干细胞，但其有效性还有待进一步证实；2)以其他技术联合分子标记进行干细胞的筛选、富集比如公开号为CN108677A 的一种干细胞靶向定位富集的方法，采用针对干细胞表面标志性抗原的特异性抗体与干细胞结合，再标记上免疫磁珠，移植后通过两个异性磁极将干细胞富集于靶组织内。Azuma 等研究小组者采用机械或酶消化分离后结合已知分子标志物的方法，希望从成体组织中直接分离出干/祖细胞，从而对其进行鉴别及后续的功能研究(Azuma H等，Hepatology, 2003. 37(6) :1385-1389 ；Wright N 等，Biochem Biophys Res Commun, 2008. 366(2) 367-372)。通过小鼠遗传学标志谱系试验等实验，结合所发现的分子标志物，例如 Musashi-I、Lgr5 等提供了鉴定干细胞的可能(BarkerN 等，Nature, 2007. 449(7165) 1003-1007 ；HaegebarthA等，Am J Pathol, 2009. 174(3) :715-721)，然而它们的有效性还有待进一步证实。不足之处是，磁珠标记可能会影响细胞活力，而酶消化作用时间又较长，富集后细胞活力不高，且这些分离的细胞群并不是同质类型的，而是由许多不同分化状态或增殖能力的混合细胞群组成，非常不纯。3)侧群筛选法(side population, SP)，分化程度较低的干/祖细胞通常表达一些ATP结合转运蛋白(ATP-binding cassette，ABC)，细胞常利用ATP能量把外来的有毒物质从细胞内排出，以达到保护自身的目的，早期Goodell等(Goodell等，J Exp Med, 1996. 183(4) :1796-1806)的研究发现，当用Hoechst33342对骨髓细胞进行染色后， 造血干细胞具有很强的排出染液的能力，被称为侧群细胞。最近，miltf等(Wulff等， Haematologica, 2003. 88 (4) :368-378)从小鼠肝内分离到一群 SP 细胞，CD45+或 CD45-细胞亚群，其所占的百分比为1%，体外培养均可产生肝系和造血系起源的克隆，类似的研究结果在人类的成体肝组织内也分离到类似的SP细胞。此方法已被用于从其他器官和组织中筛选潜在的干/祖细胞群，不足之处是，当从实体组织中筛选出SP细胞后，由于获得活细胞的能力有限，当此类细胞进行移植后可能影响他们的重塑能力。4)采用损伤联合移植实验进行干细胞特性的研究，例如Li等(LiffL等， Stem cells, 2006. 24(2) :322-332)从倒千里光碱 / 部分肝切除(Retrorsine/Partial Hepatectomy, Rs/PH)处理后成年小鼠的肝内分离到一种细胞群，在培养期间，其可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞，Li等认为这群细胞具有干/祖细胞潜能，被称为肝上皮祖细胞 (liver epithelial progenitor cells，，LEPCs)。移植实验提示其具有分化的潜能。然而类似的损伤试验加入的药物通常具有致癌特性，是否其导致组织中的细胞发生癌变，转变为具有干细胞特性的前体细胞尚不清楚。5)根据核形态进行干细胞的鉴别，例如，PCT/021504专利公开了一种根据细胞核形态鉴定干细胞的方法，通过观察经处理后的组织样品中分布的细胞核形态，核形态型的类型选自钟形、雪茄形、凝聚球形、球形、卵形、香肠形、肾形和子弹形，从而允许显微组织学/病理学技术人员根据核形态，将细胞区分为干细胞/非干细胞。6)幼年动物脉冲追踪法进行干细胞的识别，早期的研究发现，当加入可以“标记”DNA的标记后，与分裂迅速的祖细胞相比，干细胞由于其具有慢周期或静息期的特性而具有长期保留 DNA 标记的能力(Bickenbach JR, J Dent Res, 1981. 60 (Spec No C) 1611-1620)，这一方法已经被用于识别小肠、子宫内膜、胰腺、肾乳头等组织中的干细胞。7)基于干细胞的功能特征，例如耐受药物或其他试剂的处理，报道了用于激活干细胞的方法，(Gordon MY 等，Leukemia research, 1985. 9 :1017-1021 ；Berardi AC 等， Science, 1995. 267 :104-108 ；Sharkis SJ 等，Stem cells, 1997. 15 (Suppl 1) :41-44; Juopperi TA 等，Experimental hematology, 2007. 35 :335-341)，且用一些分子表面标记物分离这些细胞，然而，不足之处，一方面在于是他们所使用的分子标记仍没有很强的特异性，且其中仍不清楚是否混杂有其它分期的祖细胞以及原先存在的增殖细胞，很可能其中仍是一个异质细胞群(Berardi AC等，Science，1995.洸7 104-108)，更重要的是，没有进一步采用可靠且普遍有效的方法用于识别这些激活的干细胞。其他如公开号CN101768570的专利公开了一种富集和提取成体干细胞的方法，它采用一种多孔的三维组织工程材料埋植到人或动物体内，使得成体干细胞在材料中富集， 从而分离得到干细胞。上述所公开描述的方法或技术既有优势也有劣势，例如流式细胞分选法和免疫磁珠法分选往往是根据细胞表面特殊的标记来筛选分离干细胞，但目前特异的细胞表面标记很难达到共识，缺少特异性的分子表面标志，另外，需要借助专业人士的操作仪器来完成， 分离时间较长，耗费较高，并且通过一定处理使之带上仪器能识别的标记，这种化学过程对细胞状态会造成一定的影响，操作不当甚至引起分化或导致细胞走向凋亡，另一方面，仪器分选效率不高，长时间的分选过程，导致细胞活力下降，细胞状态改变等等问题，这些并不适用于大批量筛选富集干细胞用于科研、临床等使用的需求。再者，缺乏功能性证据表明LRCs具有干细胞的功能特征，并且BrdU并不是一个细胞表面标志(Blanpain等，Cell，2004. 118(5) :635-648)；通过细胞核形态鉴别分离干细胞专业和经验要求高，易于出现鉴别错误，且操作过程和时间比较长。因而，成体干细胞的研究也逐渐为临床医学提供了一个发展新疗法的机会，在组织工程和基因工程技术发展起来的细胞治疗和基因治疗是近年来生物医学领域中的研究热点和前沿，例如使用产生的自体经修饰后的干细胞直接施用给患者从而用于基因治疗 (Nathalie Cartier 等，Science，2009. 326 (5954) :818-823)和细胞治疗，成体干细胞作为基因或细胞治疗的载体和首选靶细胞，其中一个益处是减少移植时引起的免疫排斥。成体干细胞在作为临床细胞治疗、药物筛选、人工组织的“种子库”，在肿瘤、创伤修复、组织或器官功能重建、各种退行性疾病的治疗等方面将发挥重要的作用。
实用新型内容本实用新型的目的是克服现有技术中所存在的缺点，为了克服上述方法上的不足及提供进一步相关的优点，本实用新型所提供的一种筛选、识别啮齿动物、人类或其他哺乳动物的试剂盒，具有使用方便、特异性强、实用有效的优点，应用前景广泛。本实用新型的筛选、识别干细胞试剂盒，包括盒体、盒体内设有放置试剂瓶的相应卡位槽，盒体内放置有设置封闭盖的6个试剂瓶、及使用说明书，其特征在于，试剂盒(1)包括筛选、识别试剂瓶组合0)，细胞洗涤试剂瓶(5)，细胞因子试剂瓶(6)，混合容器或装置，其中筛选、识别试剂瓶组合( 包括筛选试剂瓶C3)及对应混合容器(7)、识别试剂瓶 (4)及对应混合容器(8)，其中，所述筛选试剂瓶( 、识别试剂瓶(4)、细胞洗涤试剂瓶(5)、 细胞因子试剂瓶(6)中的试剂分别为化疗药物、细胞标记、细胞洗涤液、多种细胞因子，所述筛选试剂混合容器(7)专用于混合化疗药物试剂，所述识别试剂混合容器(8)专用于混合细胞标记，所述放置试剂瓶的卡位槽可选择由泡沫塑料、纸板制成，卡位槽(1幻、(16)、 (17)、(18)、(19)、(20)分别对应放筛选试剂、筛选试剂的混合容器、识别试剂和识别试剂的混合容器、细胞洗涤试剂瓶、细胞因子试剂瓶，所述试剂瓶的封闭盖(9)、(10)、(11)、(12)、 (13)、(14)可选择为压力、螺丝。其中，筛选试剂瓶(3)中所包含的试剂化疗药物选择包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、 抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄胼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合。进一步，筛选试剂瓶(3)中所包含的试剂化疗药物也可选择抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物的组合。其中，筛选试剂瓶(3)中化疗药物的浓度为lmg/kg-100mg/kg细胞重量，进一步， 所述化疗药物作用细胞群的时间为0. lh-7 !。进一步，筛选试剂瓶(3)中化疗药物的浓度为10mg/kg-50mg/kg细胞重量，进一步，所述化疗药物作用细胞群的时间为0.证-3他。其中，所述识别试剂瓶(4)所包含的细胞标记选择BrdU、氚标记胸腺嘧啶核苷、 5-乙炔基_2’脱氧尿嘧啶核苷，其使用的浓度为0. lmg/kg-15mg/kg细胞重量，进一步，所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为0. 01h-96h。其中，所述细胞洗涤试剂瓶(5)的细胞洗涤液可选择为生理盐水、PBS缓冲液。其中，所述细胞因子试剂瓶(6)的细胞因子选择EGF、B27、bEGF、N2、H印arin、LIF 为基础的细胞因子组合，其中所述EGF终浓度为5ng/mL-100ng/mL，优选10ng/mL-50ng/ mL,所述 bFGF 终浓度为 5ng/mL-100ng/mL，优选 10ng/mL-50ng/mL，所述!feparin 终浓度为 2 μ g/mL-40 μ g/mL,所述B27、N2 终浓度分别为 ^g/mL_50ng/mL，优选 10ng/mL_30ng/mL，所述 LIF 终浓度为 100U/mL-1500U/mL，优选 500U/mL_1000U/mL。进一步，所述识别试剂瓶(4)所包含的细胞标记选择为磁性氧化铁标记、量子点标记、GFP标记、RFP标记。进一步，所述试剂盒作用的对象为啮齿动物、人类及其他哺乳动物的正常离体或活检组织、细胞系、肿瘤/癌前组织、癌/肿瘤性组织、转移瘤/癌组织的一种或两种以上的组合。本实用新型的筛选、识别干细胞的试剂盒的使用包括如下步骤a、细胞预处理收集细胞，台盼蓝染色计算细胞存活率，随后，低温以800 IOOOg 离心;3mim 5min，丢弃上清，称重细胞重量。[0033]b、混合筛选试剂通过筛选试剂混合容器(7)进行筛选试剂的混合。C、筛选干细胞细胞重新接种于培养瓶或培养板或培养皿内按照细胞重量加入一定浓度的筛选试剂，随后，于37°C，5% CO2含细胞因子的条件下培养一定时间再收集细胞， 筛选试剂加入次数可以为1 10次。d、计算细胞存活率收集细胞，低温以800 IOOOg离心;3mim 5min，丢弃上清， 加入细胞洗涤液洗涤1 2次，计算细胞存活率后，离心丢弃上清，称重细胞重量。e、混合识别试剂通过识别试剂混合容器( 进行识别试剂的混合。f、识别干细胞加入细胞标记试剂对筛选后的干细胞进行识别，于37°C，5% C02 包含多种细胞因子组合的条件下培养，细胞标记的浓度为0. lmg/kg-15mg/kg细胞重量，其中，所述标记作用时间为0. 01h-96h，标记加入次数可以为1 20次。g、标记检测每隔一定时间采用单克隆抗体或多克隆抗体以特异性检测细胞标记。进一步，所述抗体为免疫球蛋白分子，能够结合靶目标，本实用新型中所指标记， 其结合方式是至少识别免疫球蛋白的可变区的一个抗原位点，本发明所述抗体不仅包括全抗体分子，也包括它们的片段，例如Fab、Fab’、Fv、单链(ScFv)等，或者它们的突变体，或者是包含抗体部分的融合蛋白，完全化的或部分化的人源化抗体及任何其他的被修饰的免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含一个抗原结合位点。进一步，所述抗体选择携带荧光素、生物素、放射性标记、酶标记、荧光底物标记、 显色底物标记、化学发光标记等中的任何一种。进一步，所述筛选分离的干细胞群和或其子代源自肝脏组织、肾脏组织、心脏组织、胰腺组织、肠组织、表皮组织、卵巢组织、输卵管组织、睾丸组织、神经组织、胃组织、肺组织、乳腺组织、脂肪组织、肌肉组织、甲状腺、间充质、脾脏组织、骨髓组织、外周血、脐带血、 经血、胎盘、牙组织、眼组织和脑组织中的一种或两种以上所组成的组中。其中，所述组织来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的活检或离体正常组织。进一步，所述筛选分离的干细胞群和或其子代源自介于正常组织与癌/肿瘤性组织之间的啮齿动物、人类及其他哺乳动物来源的肿瘤/癌前任意病变组织。进一步，所述筛选分离的干细胞群和或其子代源自肝癌、肾癌、胰腺癌、肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、肺癌、肝部转移瘤、肺转移瘤、肿瘤细胞系和或肿瘤/癌活检、离体组织等材料的一种或两种以上所组成的组中。其中，肿瘤细胞系包括源自啮齿动物、人类或其他哺乳动物的肿瘤组织建立的肿瘤细胞系。进一步，根据本发明的试剂盒筛选获得的新型成体干细胞作为基础、临床与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复失去功能的病变组织或器官中的应用。
图1是筛选、识别干细胞的试剂盒组成图图中1.试剂盒，2.筛选、识别试剂瓶组合，3.筛选试剂瓶，4.识别试剂瓶，5.细胞洗涤试剂瓶，6.细胞因子试剂瓶，7.筛选试剂混合容器，8.识别试剂混合容器，9.封闭盖， 10.封闭盖，11.封闭盖，12.封闭盖，13.封闭盖，14.封闭盖。[0049]图2是试剂瓶放置的卡位槽示意图图中15.筛选试剂瓶卡位槽，16.筛选试剂混合容器卡位槽，17.识别试剂瓶卡位槽，18.识别试剂的混合容器卡位槽，19.细胞洗涤试剂瓶卡位槽，20.细胞因子试剂瓶卡位槽，虚线区域为筛选、识别试剂瓶及对应混合容器的放置区域。
具体实施方式
实施例1本实用新型的筛选、识别干细胞试剂盒，包括盒体、盒体内设有放置试剂瓶的相应卡位槽，6个试剂瓶、及使用说明书。所述试剂盒(1)包括筛选、识别试剂瓶组合( ，细胞洗涤试剂瓶( ，细胞因子试剂瓶(6)，混合容器或装置，其中筛选、识别试剂瓶组合( 包括筛选试剂瓶C3)及对应混合容器(7)、识别试剂瓶(4)及对应混合容器(8)，所述筛选试剂瓶( 、识别试剂瓶(4)、 细胞洗涤试剂瓶(5)、细胞因子试剂瓶(6)中的试剂分别为化疗药物、细胞标记、细胞洗涤液、多种细胞因子，所述筛选试剂混合容器(7)专用于混合化疗药物试剂，所述识别试剂混合容器(8)专用于混合细胞标记。进一步，所述放置试剂瓶的卡位槽可选择泡沫塑料、纸板制成。其中，所述卡位槽(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)分别对应放筛选试剂、筛选试剂的混合容器、识别试剂和识别试剂的混合容器、细胞洗涤试剂瓶以及细胞因子试剂瓶，进一步，所述试剂瓶的封闭盖(9) (10)、(11)、(12)选择为压力，试剂瓶的封闭盖 (13)和(14)选择为螺丝。其中，筛选试剂瓶(3)中所包含的试剂化疗药物为氟尿嘧啶、环磷酰胺、卡钼。其中，筛选试剂瓶(3)中化疗药物的浓度经筛选试剂混合容器(7)混合后终浓度分另丨J 为 10mg/mL、4mg/mL、4mg/mLo其中，所述识别试剂瓶(4)所包含的细胞标记为BrdU。其中，识别试剂瓶中细胞标记经识别试剂混合容器( 混合后终浓度为ang/ kg细胞重量。其中，所述细胞洗涤试剂瓶(5)的细胞洗涤液为生理盐水。其中，所述细胞因子试剂瓶(6)的细胞因子选择为lOng/mL的B27、5ng/mL的N2、 5ng/mL 的 EGF、5ng/mL 的 bFGFUO μ g/mL 的 Heparin, 900U/ml 的 LIF。进一步，所述试剂盒可作用的对象为啮齿动物、人或其他哺乳动物的肝癌活检或离体新鲜肝癌组织处理后得到的细胞群。其中，所述使用说明书用于说明筛选、识别肝癌干细胞试剂盒的使用方法。其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量 (0. 5EU/mL表示试剂盒合格。实施例2本实用新型的筛选、识别干细胞试剂盒，包括盒体、盒体内设有放置试剂瓶的相应卡位槽，6个试剂瓶、及使用说明书。所述试剂盒(1)包括筛选、识别试剂瓶组合( ，细胞洗涤试剂瓶( ，细胞因子试剂瓶(6)，混合容器或装置，其中筛选、识别试剂瓶组合( 包括筛选试剂瓶C3)及对应
8混合容器(7)、识别试剂瓶(4)及对应混合容器(8)，所述筛选试剂瓶( 、识别试剂瓶(4)、 细胞洗涤试剂瓶(5)、细胞因子试剂瓶(6)中的试剂分别为化疗药物、细胞标记、细胞洗涤液、多种细胞因子，所述筛选试剂混合容器(7)专用于混合化疗药物试剂，所述识别试剂混合容器(8)专用于混合细胞标记。进一步，所述放置试剂瓶的卡位槽由泡沫塑料、纸板制成。其中，所述卡位槽(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)分别对应放筛选试剂、筛选试剂的混合容器、识别试剂和识别试剂的混合容器、细胞洗涤试剂瓶以及细胞因子试剂瓶，进一步，所述试剂瓶的封闭盖(9) (10)、(11)、(12)选择为螺丝，试剂瓶的封闭盖 (13)和(14)选择为压力。其中，筛选试剂瓶(3)中所包含的试剂化疗药物为氟尿嘧啶、丝裂霉素。其中，筛选试剂瓶(3)中化疗药物的浓度经筛选试剂混合容器(7)混合后终浓度分别为 2mg/mL、4mg/mL。其中，所述识别试剂瓶(4)所包含的细胞标记为BrdU和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷。其中，识别试剂瓶⑷中细胞标记经识别试剂混合容器⑶混合后终浓度为 0. 8mg/kg、0. lmg/kg 细胞重量。其中，所述细胞洗涤试剂瓶(5)的细胞洗涤液为PBS缓冲液。其中，所述细胞因子试剂瓶(6)的细胞因子选择为lOng/mL的B27、10ng/mL的N2、 30ng/mL 的 EGF、30ng/mL 的 bFGFUO μ g/mL 的 H印arin，600U/ml 的 LIF。进一步，所述试剂盒作用的对象为啮齿动物、人或其他哺乳动物正常心组织，活检或离体心组织处理后获得的细胞群。其中，所述使用说明书用于说明筛选、识别心脏干细胞试剂盒的使用方法。其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量 (0. 5EU/mL表示试剂盒合格。实施例3本实用新型的筛选、识别肝癌干细胞的试剂盒的使用包括如下步骤a、细胞预处理获得肝癌组织经处理后得到单细胞悬液，台盼蓝染色计算细胞存活率，随后，低温以800g离心;3mim 5min，丢弃上清，称重细胞重量。b、混合筛选试剂把筛选试剂瓶(3)中所包含的试剂化疗药物氟尿嘧啶、环磷酰胺、卡钼用筛选试剂混合容器(7)进行混合，终浓度分别为lOmg/mLdmg/mLdmg/mL。C、筛选干细胞细胞重新接种于培养瓶或培养板或培养皿内按照细胞重量加入经混合后的筛选试剂，随后，于37°C，5% CO2条件下培养1 再收集细胞，筛选试剂加入次数为1次。d、计算细胞存活率收集细胞，低温以800g离心;3mim 5min，丢弃上清，加入细胞洗涤剂洗涤1 2次，计算细胞存活率后，离心丢弃上清，称重细胞重量。e、混合细胞标记把识别试剂瓶(4)中所包含的细胞标记试剂BrdU，用识别试剂混合容器( 进行混合，终浓度为ang/kg细胞重量。f、识别干细胞加入混合后细胞标记试剂识别肝癌干细胞，于37°C，5% CO2包含 10ng/mL 的 B27、5ng/mL 的 N2、5ng/mL 的 EGF、5ng/mL 的 bFGFUO μ g/mL 的 Heparin, 900U/ml的LIF的条件下培养，其中，所述标记作用时间为36h，每隔1 加入一次，标记加入次数共为3次。g、标记检测每隔1 进行细胞标记的检测，检测采用FITC荧光素标记的抗BrdU 抗体。其中，整个操作过程保持在无菌条件下进行。实施例4本实用新型的筛选、识别心脏干细胞的试剂盒的使用包括如下步骤a、细胞预处理获得新鲜心脏组织经处理后得到单细胞悬液，台盼蓝染色计算细胞存活率，随后，低温以900g离心;3mim 5min，丢弃上清，称重细胞重量。b、混合筛选试剂把筛选试剂瓶(3)中所包含的试剂化疗药物氟尿嘧啶、丝裂霉素用筛选试剂混合容器(7)进行混合，终浓度分别为aiig/mL、％ig/mL。C、筛选干细胞细胞重新接种于培养瓶或培养板或培养皿内按照细胞重量加入经混合后的筛选试剂，随后，于37°C，5% CO2条件下培养24h再收集细胞，其中，筛选试剂加入次数为2次，每隔12小时加入1次。d、计算细胞存活率收集细胞，低温以900g离心;3mim 5min，丢弃上清，加入细胞洗涤液洗涤1 2次，计算细胞存活率后，离心丢弃上清，称重细胞重量。e、混合细胞标记把识别试剂瓶中所包含的细胞标记试剂BrdU和5_乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷，用识别试剂混合容器(8)进行混合，终浓度0. 8mg/kg、0. lmg/kg细
胞重量f、识别干细胞加入细胞标记试剂BrdU和5_乙炔基_2’脱氧尿嘧啶核苷对筛选后的心脏干细胞进行识别，于37°C，5% C02包含10ng/mL的B27、10ng/mL的N2、30ng/mL的 EGF、30ng/mL的bFGF、10 μ g/mL的H印arin，600U/ml的LIF的条件下培养，其中，其中，所述标记作用时间为Mh，每隔他加入一次，标记加入次数共为4次。g、标记检测每隔1 进行细胞标记的检测，检测采用FITC荧光素标记的抗BrdU 抗体。其中，整个操作过程保持在无菌条件下进行。显然在不违反本实用新型的领域及范畴下，可以对上述用于筛选、识别干细胞的试剂盒进行成分的修饰及或增加，本实用新型是以上述实施例进行试剂盒的说明，并不是用于限制试剂盒的使用，对此进行的任何等同替换、修改、增加均落在本实用新型的试剂盒保护范畴内。
权利要求1.一种筛选、识别干细胞的试剂盒，包括盒体、盒体内设有放置试剂瓶的相应卡位槽， 盒体内放置有设置封闭盖的6个试剂瓶、及使用说明书，其特征在于，试剂盒(1)包括筛选、识别试剂瓶组合O)，细胞洗涤试剂瓶(5)，细胞因子试剂瓶⑴)，混合容器或装置，其中筛选、识别试剂瓶组合( 包括筛选试剂瓶( 及对应混合容器(7)、识别试剂瓶(4)及对应混合容器(8)，所述筛选试剂瓶(3)、识别试剂瓶G)、细胞洗涤试剂瓶(5)、细胞因子试剂瓶(6)中的试剂分别为化疗药物、细胞标记、细胞洗涤液、多种细胞因子，所述筛选试剂混合容器(7)专用于混合化疗药物试剂，所述识别试剂混合容器(8)专用于混合细胞标记， 所述放置试剂瓶的卡位槽选择由泡沫塑料、纸板制成，所述卡位槽(15)、(16)、(17)、(18)、 (19)、(20)分别对应放筛选试剂、筛选试剂的混合试剂瓶、识别试剂和识别试剂的混合试剂瓶、细胞洗涤试剂瓶、细胞因子试剂瓶，所述试剂瓶的封闭盖(9)、(10)、(11)、(12), (13)、 (14)可选择为压力、螺丝。
2.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，筛选试剂瓶(3)中所述化疗药物选择包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄胼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合。
3.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，筛选试剂瓶(3)中所述化疗药物选择抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物的组合。
4.根据权利要求1或2或3所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，筛选试剂瓶(3)中所述化疗药物的浓度为lmg/kg-100mg/kg细胞重量，且所述化疗药物作用细胞群的时间为0. lh-7 !，或选择使用所述的化疗药物的浓度为10mg/kg-50mg/kg细胞重量，且所述化疗药物作用细胞群的时间为0.证-3他。
5.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述识别试剂瓶(4)的细胞标记选择BrdU、氚标记胸腺嘧啶核苷、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷，所述标记使用的浓度为0. lmg/kg-15mg/kg细胞重量，作用于所述筛选后干细胞群的时间为 0.01h-96ho
6.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述细胞洗涤试剂瓶(5)中的细胞洗涤液可选择为生理盐水、PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述细胞因子试剂瓶(6)的细胞因子选择EGF、B27、bEGF、N2、H印arin、LIF为基础的细胞因子组合，其中所述 EGF 终浓度为 5ng/mL-100ng/mL，所述 bFGF 终浓度为 5ng/mL-100ng/mL，所述!feparin 终浓度为2 μ g/mL-40 μ g/mL,所述B27、N2终浓度分别为2ng/mL-50ng/mL，所述LIF终浓度为 100U/mL-1500U/mL。
8.根据权利要求7所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其中，所述细胞因子试剂瓶(6) 中所述EGF终浓度选择为10ng/mL-50ng/mL，所述bFGF终浓度选择为10ng/mL_50ng/mL，所述B27、N2终浓度分别选择为10ng/mL-30ng/mL，所述LIF终浓度选择为500U/mL_1000U/mLo
9.根据权利要求1或5所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述识别试剂瓶⑷的细胞标记也可选择磁性氧化铁标记、量子点标记、GFP标记、RFP标记。
专利摘要本实用新型涉及一种筛选、识别干细胞的试剂盒，包括盒体、盒体内设有放置试剂瓶的相应卡位槽，设置有封闭盖的6个试剂瓶、及使用说明书，其特征在于，试剂盒(1)包括筛选、识别试剂瓶组合(2)，细胞洗涤试剂瓶(5)，细胞因子试剂瓶(6)，混合容器或装置，其中(2)包括筛选试剂瓶(3)及对应混合容器(7)、识别试剂瓶(4)及对应混合容器(8)，所述试剂瓶(3)、(4)、(5)、(6)中的试剂分别为化疗药物、细胞标记、细胞洗涤液、多种细胞因子，所述(7)专用于混合化疗药物试剂，所述(8)专用于混合细胞标记。本试剂盒可工业化生产，使用简便、特异性强、实用有效，可直接用于干细胞的筛选、识别，具有广泛应用前景。
文档编号G01N33/53GK202159058SQ201120188428
公开日2012年3月7日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者卢晶晶, 卢淼淼, 卢磊磊, 李福生 申请人:卢磊磊, 李福生