专利名称：一种神经细胞传递信息功能的定性和定量评估方法
技术领域：
本发明涉及生物物质功能的测试方法，具体涉及神经细胞感受刺激和传导兴奋功 能的评估方法。
背景技术：
神经系统的基本功能是信号传导或信息传递，其基本单位是神经细胞，即神经元。 神经元(Neuron)是一种高度特化的细胞，是神经系统的基本结构和功能单位之一，它具有 感受刺激和传导兴奋的功能，所以对其的观察和评估具有重要意义。例如对一些神经元样 细胞功能的观察和评估可以协助判断这些细胞是仅仅结构类似神经元还是功能上具备神 经元的功能；对神经细胞功能的观察还可以评价不同的病理条件或药物等干预条件对神经 细胞功能活动的影响；研究神经系统发育和神经细胞分化过程也都涉及到对其功能的观察 评估。目前，神经细胞的信号传导或信息传递功能的检测主要依赖细胞膜片钳技术，该 技术通过玻璃微电极的尖端与单个细胞膜接触，以观测细胞膜离子通道的微小电流。然而 在测定某种神经细胞膜离子通道电流时尚存在一些技术上的难题。首先，在体外培养的细 胞群体中并非每个细胞都具备活性，具备空间上的随机性，从数以百万计的体外培养细胞 群体中选择可能发生膜电流变化的某个细胞以用来观察十分困难；其次，即使选中作为观 察对象的这个细胞具备产生离子通道电流的能力，这种电流改变往往是瞬时发生和消失 的，具备时间上的随机性，如何捕获这种瞬时的电流在观测时间点的选择上更是难上加难； 另外，即使观测时该细胞发生了离子通道电流改变，在电流程度非常微弱的情况下很难捕 捉到信号。因此，对神经细胞功能作出准确的评估，需要另辟蹊径，寻求新的评估方法。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种不受神经细胞功能 活动随机性影响的神经细胞的信号传导或信息传递功能的评估方法。本发明解决上述问题的技术方案一如下一种神经细胞传递信息功能的定性评估方法，该方法由以下步骤组成先分别制备含造影的神经细胞冷冻凝胶和含未造影的神经细胞冷冻凝胶，再分别 进行磁共振功能成像，然后将二者的磁共振图像进行对照，如果含造影的神经细胞冷冻凝 胶的磁共振图像较含未造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振图像增强，则表明这种神经细胞 具有传递信息的功能；其中，所述的含造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法由以下步骤组成(1)先往DMEM/F12培养基中添加10 %的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经 细胞接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增 至神经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至培养瓶中，在温度为37°C、C02浓度为5%的条件下 培养24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/L的NGF诱导5天； (2)加入NGF诱导5天后，往培养瓶中加入氯化锰，使其在所述含血清培养基 中浓度为0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度为 ΙΟμπιοΙ/L 并作用 24h ； (3)然后倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入ImL浓度为2. 5g/L 胰酶的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养 基终止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓冲液重悬后移至 另一试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新的试管中，离心分 离，去除上清液，如此重复3次之后，于40°C下加入浓度为60g/L 80g/L的琼脂糖凝胶水 溶液重悬至神经细胞浓度为1 X IO6个/mL迅速插入冰浴凝固；所述的含未造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法是，依次执行所述的含造影的神 经细胞冷冻凝胶的制备方法的步骤(1)和步骤(3)即可。本发明所述的定性评估方法，其中所述的含造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法 的步骤(2)中所述的氯化锰和谷氨酸是分别用去离子水溶解后再加入培养瓶中的。本发明解决上述问题的技术方案二如下一种神经细胞传递信息功能的定量评估方法，该方法由以下步骤组成先分别制备含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水 重悬液，再分别置于超声破碎仪中，超声作用5s，停5s，持续5min破碎细胞膜后，使用等离 子体质谱仪分别检测含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水 重悬液中的锰含量，然后计算出二者锰含量的比值，此值越大则表明这种神经细胞传递信 息的功能越强；其中，所述的含造影的神经细胞去离子水重悬液的制备方法由以下步骤组成(I)先往DMEM/F12培养基中添加10 %的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经 细胞接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增 至神经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至培养瓶中，在温度为37°C、C02浓度为5%的条件下 培养24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/L的NGF诱 导5天；(II)加入NGF诱导5天后，往培养瓶中加入氯化锰，使其在所述含血清培养基 中浓度为0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度为 lOymol/L 并作用24h ；(III)然后倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入ImL浓度为2. 5g/ L胰酶的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10 %的胎牛血清的DMEM/F12培养 基终止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓冲液重悬后移至 另一试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新的试管中，离心分 离，去除上清液，如此重复3次之后，加入去离子水重悬至神经细胞浓度为1 X IO6个/mL ；所述的含未造影的神经细胞去离子水重悬液的制备方法是，依次执行所述的含造 影的神经细胞去离子水重悬液的制备方法的步骤(I)和步骤(III)即可。本发明所述的定量评估方法，其中所述的含造影的神经细胞去离子水重悬液的制
5备方法的步骤(II)中所述的氯化锰和谷氨酸都是先用去离子水溶解后再加入培养瓶中 的。本发明所述的两种评估方法，其中，所述的定性评估方法是将神经细胞扩增、诱导 后加入氯化锰和谷氨酸，使神经细胞在谷氨酸的下刺激而开放钙离子通道，让含氯化锰溶 液中的锰离子进入神经细胞内，冰浴凝固后进行磁共振图像，并将所得到的图像与未加造 影剂的神经细胞的磁共振图像进行对照，如果图像得到增强便说明这种具有传递信息的功 能，检测结果稳定且直观。所述的定量评估方法是将神经细胞扩增、诱导后加入氯化锰和谷 氨酸，使神经细胞在谷氨酸的下刺激而开放钙离子通道，让含氯化锰溶液中的锰离子进入 神经细胞内，然后再超声破碎细胞膜，使用等离子体质谱仪检测锰含量，并将所测得的锰含 量与未加造影剂的神经细胞的锰含量进行比较，当二者锰含量的差值越大则表明这种神经 细胞传递信息的功能越强，不仅可对神经细胞传递信息功能进行数字化定量评估，而且结 果稳定、精确。
图1为在相差显微镜下观察到的经培养和诱导的PC12细胞的生长状态图。图2为在荧光显微镜下观察到的经培养和诱导的PC12细胞的免疫组化染色图。图3为不同浓度氯化锰造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振成像，按照左右上下顺 序分别为空白凝胶、无锰干预神经元、0. 05mmol/L氯化锰标记、0. lmmol/L氯化锰标记、 0. 2mmol/L氯化锰标记、0. lmmol/L氯化锰复管、0. 5mmol/L氯化锰标记、0. 5mmol/L氯化锰 标记复管。
具体实施例方式神经生长因子(NGF)诱导的PC12细胞株是目前广泛应用于神经细胞功能研究的 一种具有代表性的神经细胞模型，因此下述实施例均使用NGF诱导的PC12细胞进行相关实验。例 1PC12细胞株培养及诱导鉴定1、材料(1)PC12细胞株购自广州市中山大学实验动物中心细胞库；(2)试剂NGF及细胞鉴定所用抗体均购自美国Sigma公司；2、步骤(1)PC12细胞的培养及诱导先往DMEM/F12培养基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经细胞 接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、CO2浓度为5%的培养箱中培养，扩增至 神经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至96孔培养板中，在温度为37°C、CO2浓度为5%的条 件下培养24小时后，往所述的96孔培养板中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/ L的NGF诱导5天。(2)PC12细胞生长状态观察加入NGF诱导5天后，将上述96孔培养板置于相差显微镜下观察，其结果如图1
6所示，PC12细胞的折光性良好，具备细胞突起，说明其生长状态良好。(3)鉴定PC12细胞诱导效果采用免疫组化染色神经细胞特异性抗原微管相关蛋白2(MAP_2)的方法来鉴定 PC12细胞的诱导结果。观察到细胞生长状态良好后，在上述96孔培养板中加入PBS冲洗2 次；将多聚甲醛溶于PBS，制备成多聚甲醛浓度为40g/L的PBS溶液，将此PBS溶液加入到 所述96孔培养板中固定细胞30min ；加入PBS冲洗3次，每次5min ；将Triton X-100溶于 PBS,制备Triton X-100浓度为3g/L的PBS溶液，将此PBS溶液加入所述96孔培养板中， 在温度为37°C条件下处理30min ；加入PBS冲洗3次，每次5min ；将正常山羊血清溶于PBS， 制备成正常山羊血清的体积浓度为10%的PBS溶液，将此PBS溶液加入所述96孔培养板 中，在温度为37°C条件下封闭15min ；将所述96孔培养板中的正常山羊血清溶液吸出；将 MAP-2 一抗用抗体稀释液稀释100倍，加入所述96孔培养板中；将该96孔培养板置于湿盒 中，在温度为4°C条件下过夜，然后在温度为37°C条件下放置2h ；加入PBS冲洗3次，每次 5min ；将绿色荧光二抗488用抗体稀释液稀释100倍，然后加入所述96孔培养板中；将该 96孔培养板置于湿盒中，在温度为37°C下避光孵育60min ；将上述含绿色荧光二抗488的 抗体稀释液吸出；将带蓝色荧光的Hochest33342溶于抗体稀释液，然后加入所述96孔培养 板中；将该96孔培养板置于湿盒中，在温度为37°C下避光孵育IOmin ；加入PBS冲洗3次， 每次5min ；然后将96孔培养板置于荧光显微镜下观察。3、结果鉴定PC12细胞诱导效果将步骤(3)所得的在荧光显微镜下观察，观察结果如图2所示。图中可见经过步骤 (1)培养和诱导后，PC12细胞可以被Hochest33342抗体染上蓝色荧光，同时可以被MAP-2 抗体染上绿色荧光。说明诱导后的PC12细胞可以表达神经元特异性的MAP-2抗原，诱导后 的PC12细胞为神经元样细胞。例 2氯化锰安全应用浓度范围的测定1、材料(1)PC12细胞株购自广州市中山大学实验动物中心细胞库；(2)试剂=MnCl2, NGF均购自美国sigma公司；2、步骤(1)PC12细胞的培养及诱导先往DMEM/F12培养基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经细胞 接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增至神 经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至96孔培养板上，接种30孔。在温度为37°C、C02浓度为 5%的条件下培养24小时后，往所述的96孔培养板中加入在所述含血清培养基中的浓度为 10 μ g/L的NGF诱导5天。(2)上述96孔培养板上接种了细胞的有30孔，每6孔分为一组，共5组。其中 4组添加氯化锰和谷氨酸，另1组不添加氯化锰和谷氨酸作为对照。首先向该4组的孔中 分别添加不同量的去离子水溶解的氯化锰，使氯化锰在4组含血清培养基中浓度分别为 0. 05mmol/L、0. Immol/L、0. 2mmol/L、0. 5mmol/L，然后向该4组含血清培养基中分别加入谷
7氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度均为ΙΟμπιοΙ/L，作用24h ；(3)MTT法检测不同浓度氯化锰对PC12细胞存活的影响将上述96孔培养板中的所述含血清培养基除去，每孔加入新鲜DMEM/F12培养基 200 μ L ；将MTT溶于PBS，制备成MTT浓度为5mg/mL的溶液，将该PBS溶液加入所述96孔 培养板中，每孔添加20 μ L，在温度为37°C条件下培养4h ；吸去96孔培养板中培养上清液； 加入二甲基亚砜(DMSO)，每孔加150 μ L，振荡IOmin至反应产生的晶体完全溶解；将96孔 培养板置于酶标仪上，在570nm波长下测定各孔吸光度，记录结果。(4)统计学分析将记录结果用均数士标准差表示，应用SPSS13. 0软件进行统计分析，多组均数的 比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P < 0. 05为差异有统计学意义。3、结果不同浓度氯化锰对PC12细胞存活影响将步骤(4)所得的不同浓度氯化锰干预的PC12细胞存活量用MTT法检测的统计 数据记录于下述表1中。由表中数据可看出方差齐性检验显示对照组及4个浓度锰标记组 细胞存活测定方差齐性(Levene statistic = 0. 169，P = 0. 952)，5组细胞存活量差异具有 显著性(F = 11. 693，P = O. 000)，应用LSD法两两比较显示0. 05mmol/L、0. lmmol/L锰标记 组与对照组比较细胞存活量无明显差异(Pab = 0. 363 ；Pac = 0. 793),0. 2mmol/L、0. 5mmol/L 氯化锰标记组与对照组比较细胞存活量差异具有显著性(Pad = 0. 000 ；Pae = 0. 000)，说明 占含血清培养基的浓度为0. lmmol/L以下的氯化锰适合于进行PC12细胞功能测定。表 1不同浓度氯化锰干预的PC12细胞存活用MTT法检测的结果
分组 对照组0.05mmol/L 0. lmmol/L 0.2mmol/L 0.5mmol/LMnCI2 组 MnCI2 组 MnCI2 组 MnCI2 组
MTT 0.754±0.106a 0.698土 0.101b 0.770±0.116c 0.492±0.102d 0.466±0.097e例 3PC12细胞功能的定性评估1、材料(1)PC12细胞株购自广州市中山大学实验动物中心细胞库；(2)试剂=MnCl2, NGF均购自美国sigma公司；(3)仪器磁共振仪(Philips, 3. 0T，荷兰)；2、步骤(1)PC12细胞的培养及诱导先往DMEM/F12培养基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经细胞 接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增至神 经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至25cm2培养瓶中，在温度为37°C、CO2浓度为5 %的条件 下培养24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/L的NGF诱导5天。(2)再重复步骤(1)6次，共制备7个培养瓶的PC12细胞。其中6瓶添加氯化锰 和谷氨酸，另1瓶不添加氯化锰和谷氨酸作为对照。首先向该6个培养瓶中分别添加不同 量的去离子水溶解的氯化锰，使氯化锰在该6个培养瓶所述含血清培养基中浓度分别为 0. 05mmol/L>0. Immol/L>0. 2mmol/L>0. Immol/L>0. 5mmol/L>0. 5mmol/L,然后向该 6 个培养 瓶所述含血清培养基中分别加入谷氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度均为10 μ mol/L, 作用24h ；(3)将上述7个培养瓶PC12细胞分别进行以下处理制备成7试管神经细胞冷冻 凝胶倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入ImL浓度为2. 5g/L胰酶的水溶 液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化， 然后移至0. 5cm直径的试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓冲液重悬后移至 另一试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新的试管中，离心分 离，去除上清液，如此重复3次之后，于40°C下加入浓度为70g/L的琼脂糖凝胶水溶液重悬 至神经细胞浓度为1 X IO6个/mL迅速插入冰浴凝固(在40°C下重悬细胞时，因60g/L以下 的凝胶水溶液难以迅速在冰浴中凝固，而80g/L以上的凝胶水溶液过于粘稠，难以完成吹 打重悬细胞的操作，所以60g/L 80g/L的凝胶水溶液最合适)。(4)另取0. 5cm直径的试管，于40°C下加入浓度为70g/L的琼脂糖凝胶水溶液，迅 速插入冰浴凝固以制备不含神经细胞的凝胶对照；(5)将步骤(3)所获的7管神经细胞冷冻凝胶及步骤(4)所获的不含神经细胞的 冷冻凝胶送磁共振检测，获取Tl加权序列图像。磁共振检测的具体参数为重复时间(TR) 330ms，回波时间(TE) 16. 6ms，matrix size :512X512，视野(FOV) :6X6cm2，层厚1· 5mm。3、氯化锰及谷氨酸干预的PC12细胞磁共振成像步骤(5)所得的神经细胞冷冻凝胶的磁共振成像如图3所示。图中可见，将占含 血清培养基的浓度为0. Immol/L、0. 2mmol/L及0. 5mmol/L的氯化锰处理的神经细胞冷冻凝 胶与未经氯化锰处理的神经细胞冷冻凝胶比较，氯化锰处理的神经细胞冷冻凝胶磁共振信 号强度明显增高，而且随标记锰浓度增高，磁共振Tl加权序列信号强度增加，说明PC12神 经细胞具有传递信息的功能。例 4细胞功能的定量评估1、材料(1)PC12细胞株购自广州市中山大学实验动物中心细胞库；(2)试剂=MnCl2、盐酸维拉帕米、NGF均购自美国sigma公司；(3)仪器电感耦合等离子体质谱仪(X SERIES 2，ThermoFischer, Bremen，德 国)；2、步骤一、PC12细胞功能的定量评估(1)PC12细胞的培养及诱导先往DMEM/F12培养基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经细胞 接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增至神
9经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至25cm2培养瓶中，在温度为37°C、CO2浓度为5 %的条件 下培养24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/L的NGF 诱导5天。(2)重复步骤⑴1次，得到两瓶PC12细胞，将2个培养瓶分别标记为Al和A2。(3)往标记有Al的培养瓶中先加入去离子水溶解的氯化锰，使氯化锰在该培养瓶 所述含血清培养基中浓度为0. lmmol/L，再加入谷氨酸，使谷氨酸在所述含血清培养基中浓 度为10 μ mol/L并作用24h ；将标记有A2的培养瓶放置24h ；(4)将标记有Al和A2的培养瓶中的细胞分别进行下述处理，并将所得去离子水重 悬的试管分别标记为A' 1和A' 2:倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入 ImL浓度为2. 5g/L胰酶的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10%的胎牛血清 的DMEM/F12培养基终止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓 冲液重悬后移至另一试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新 的试管中，离心分离，去除上清液，如此重复3次之后，加入去离子水重悬至神经细胞浓度 为 1 X IO6 个 /mL ；(5)将标记有A' 1和A' 2的两试管分别置于超声破碎仪中，超声作用5s，停5s， 持续5min破碎细胞膜后，使用等离子体质谱仪分别检测两试管内去离子水重悬液中的锰 含量，然后计算出二者锰含量的比值，并记录于下述表2中。二、功能抑制的PC12细胞功能的定量评估(1)PC12细胞的培养及诱导先往DMEM/F12培养基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经细胞 接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增至神 经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至25cm2培养瓶中，在温度为37°C、CO2浓度为5 %的条件 下培养24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/L的NGF 诱导5天。(2)重复步骤(1) 1次，得到两瓶PC12细胞，将2个培养瓶分别标记为Bl和B2。维拉帕米处理的PC12细胞样本制备及处理再重复步骤(1) 2次，制备2个培养瓶 的PC12细胞，将2个培养瓶分别标记为B1、B2瓶。首先在这2个培养瓶中添加盐酸维拉帕 米，使盐酸维拉帕米在培养瓶所述含血清培养基中浓度为30 μ mol/L以制备维拉帕米处理 的PC12细胞。然后应用与步骤(2)相同的方法和剂量给予氯化锰和谷氨酸；加药完成后作 用 24h;(3)首先分别往标记有Bl和B2的两培养瓶中添加盐酸维拉帕米，使盐酸维拉帕米 在培养瓶所述含血清培养基中浓度为30 μ mol/L ；然后，往标记有Bl的培养瓶中先加入去 离子水溶解的氯化锰，使氯化锰在该培养瓶所述含血清培养基中浓度为0. lmmol/L，再加入 谷氨酸，使谷氨酸在所述含血清培养基中浓度为10 μ mol/L并作用24h ；将标记有B2的培 养瓶放置24h ；(4)将标记有Bl和B2的培养瓶中的细胞分别进行下述处理，并将所得去离子水重 悬的试管分别标记为B' 1和B' 2:倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入 ImL浓度为2. 5g/L胰酶的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10%的胎牛血清 的DMEM/F12培养基终止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓
10冲液重悬后移至另一试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新 的试管中，离心分离，去除上清液，如此重复3次之后，加入去离子水重悬至神经细胞浓度 为 1 X IO6 个 /mL ；(5)将标记有B' 1和B' 2的两试管分别置于超声破碎仪中，超声作用5s，停5s， 持续5min破碎细胞膜后，使用等离子体质谱仪分别检测两试管内去离子水重悬液中的锰 含量，然后计算出二者锰含量的比值，并记录于下述表2中。三、评估结果的比较与分析盐酸维拉帕米是本领域公认的一种细胞钙通道阻滞剂，因此，本例中采用维拉帕 米对PC12细胞进行功能抑制后再按本发明所述定量评估方法进行锰含量的测定，以期说 明细胞内的锰含量与神经细胞传递信息功能的强弱正相关。由表2可见，添加过锰标记的A' 1管中PC12细胞较未添加过锰标记的A' 2管 中PC12细胞内锰含量高，说明正常PC12细胞有传递信息功能。添加过锰标记的B' 1管中 PC12细胞较未添加过锰标记的B' 2管中PC12细胞内锰含量高，说明经过盐酸维拉帕米处 理的PC12细胞也有传递信息功能。但是，A' l/k' 2的值是B' 1/B' 2值的六倍，该结 果既说明过盐酸维拉帕米对PC12细胞传递信息功能有明显抑制作用，也说明本发明所述 的定量评估方法可用于神经细胞功能的定量评估。表2评估结果的比较
分组Α·1 管 Α’2 管 Α’1/Α·2 B'l 管 B’2 管 B’l/B’2
锰含量 120ppm IOppm 1220ppm IOppm 权利要求
1.一种神经细胞传递信息功能的定性评估方法，该方法由以下步骤组成先分别制备含造影的神经细胞冷冻凝胶和含未造影的神经细胞冷冻凝胶，再分别进行 磁共振功能成像，然后将二者的磁共振图像进行对照，如果含造影的神经细胞冷冻凝胶的 磁共振图像较含未造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振图像增强，则表明该神经细胞具有传 递信息的功能；其中，所述的含造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法由以下步骤组成(1)先往DMEM/F12培养基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经细胞 接入所述含血清培养基中，然后置于温度为371^0)2,1度为5%的培养箱中培养，扩增至神 经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至培养瓶中，在温度为37°C、C02浓度为5%的条件下培养 24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10μ g/L的NGF诱导5 天；(2)加入NGF诱导5天后，往培养瓶中加入氯化锰，使其在所述含血清培养基中浓度为 0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度为10 μ mol/L并 作用24h ；(3)然后倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入ImL浓度为2.5g/L胰酶 的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基终 止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓冲液重悬后移至另一 试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新的试管中，离心分离， 去除上清液，如此重复3次之后，于40°C下加入浓度为60g/L 80g/L的琼脂糖凝胶水溶液 重悬至神经细胞浓度为1 X IO6个/mL迅速插入冰浴凝固；所述的含未造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法是，依次执行所述的含造影的神经细 胞冷冻凝胶的制备方法的步骤(1)和步骤(3)即可。
2.根据权利要求1所述的一种神经细胞传递信息功能的定性评估方法，其特征在于， 所述的氯化锰和谷氨酸是分别用去离子水溶解，再加入培养瓶中。
3.—种神经细胞传递信息功能的定量评估方法，该方法由以下步骤组成先分别制备含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水重悬 液，再分别置于超声破碎仪中，超声作用5s，停5s，持续5min破碎细胞膜后，使用等离子体 质谱仪分别检测含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水重悬 液中的锰含量，然后计算出二者锰含量的比值，此值越大则表明该神经细胞传递信息的功 能越强；其中，所述的含造影的神经细胞去离子水重悬液的制备方法由以下步骤组成(I)先往DMEM/F12培养基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经细胞 接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增至神 经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至培养瓶中，在温度为37°C、C02浓度为5%的条件下培养 24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/L的NGF诱导5 天；(II)加入NGF诱导5天后，往培养瓶中加入氯化锰，使其在所述含血清培养基中浓度为 0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度为10 μ mol/L并 作用24h ；(III)然后倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入ImL浓度为2. 5g/L胰酶 的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基终 止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓冲液重悬后移至另一 试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新的试管中，离心分离， 去除上清液，如此重复3次之后，加入去离子水重悬至神经细胞浓度为1 X IO6个/mL ；所述的含未造影的神经细胞去离子水重悬液的制备方法是，依次执行所述的含造影的 神经细胞去离子水重悬液的制备方法的步骤(I)和步骤(III)即可。
4.根据权利要求3所述的一种神经细胞传递信息功能的定量评估方法，其特征在于， 所述的氯化锰和谷氨酸是分别用去离子水溶解，再加入培养瓶中。
全文摘要
本发明具体涉及一种神经细胞传递信息功能的定性和定量评估方法，其中，所述的定性评估方法是，先分别制备含造影的神经细胞冷冻凝胶和含未造影的神经细胞冷冻凝胶，再分别进行磁共振功能成像，然后将二者的磁共振图像进行对照，如果含造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振图像增强，则表明该神经细胞具有传递信息的功能；所述的定量评估方法是，先分别制备含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水重悬液，再分别置于超声破碎仪中破碎细胞膜后，使用等离子体质谱仪分别检测含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水重悬液中的锰含量，然后计算出二者锰含量的比值，此值越大则表明该神经细胞传递信息的功能越强。
文档编号G01N1/28GK102004114SQ201010274158
公开日2011年4月6日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者姜晓丹, 张润, 张鹏, 李鹏, 法志强, 王志娟 申请人:南方医科大学