用于产生神经胶质细胞的群体的分化方法

用于产生神经胶质细胞的群体的分化方法
【专利摘要】本发明提供从多能细胞产生少突神经胶质祖细胞的方法，以及以相对纯的培养物长期维持这些少突神经胶质祖细胞的方法。本发明还提供进一步将这些少突神经胶质祖细胞分化成各种神经胶质细胞的方法。
【专利说明】用于产生神经胶质细胞的群体的分化方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求转让给本申请的受让人的2010年10月26日提交的美国临时专利申请第61/406，664号的权益，并且该临时专利申请通过引用并入本文。
[0003]政府资助研究的声明
[0004]本发明部分地由美国国立精神卫生研究所(National Institute of MentalHealth, NIMH)支持，基金号为R21MH087877-01。联邦政府对本发明拥有部分权力。
发明领域
[0005]本发明涉及神经胶质谱系的细胞和同质细胞的群体的产生。
[0006]发明背景
[0007]在下面的讨论中，将为了背景和介绍目的描述某些文章和方法。本文中所含的内容不被解释为现有技术的“承认”。 申请人:明确地保留在适当时，证明本文引用的文章和方法在适用的法律条文下并不构成现有技术的权利。
[0008]在哺乳动物中枢神经系统(CNS)的动作电位的有效的传导要求髓鞘将神经元轴突适当地放入鞘中和绝缘。哺乳动物CNS的少突神经胶质细胞，即成髓鞘细胞(myelinogenic cells)的受损会引起多种令人衰弱的和常常是致命的人类病变。髓鞘缺陷的致残效果的特征是运动缺陷并且有时是认知缺陷，在先天性髓鞘化障碍病症和获得性脱髓鞘病变如多发性硬化症和大脑性瘫痪方面容易明显。通过髓鞘再生的治疗要求恢复内源性细胞的髓鞘化能力，或移植外源性的髓鞘化细胞。
[0009]致命的人类神经胶质祖细胞的移植已经表明导致恢复了致命的髓鞘形成不良小鼠模型(Windrem等，Cell Stem Cell, 2 (6):553-65 (2008))。尽管清楚地建立了给人类患者解释的原理论证，来自流产的人类胎儿的细胞不仅面临道德而且有免疫的挑战；然而，提供临床规模所需的细胞数目现在是不现实的。这样一来，理解和治疗与髓鞘有关的神经退行性紊乱的主要限制因素是缺乏用于少突神经胶质细胞发育的研究和筛选药物的可放大规模和易处理的平台。
[0010]由于通过疾病模型化和细胞置换治疗影响人类健康的潜力，干细胞生物学吸引了许多注意力。尤其是，多能干细胞理论上提供了神经胶质细胞和它们的祖先的大量来源。虽然以前的研究通过清楚的证明少突神经胶质细胞可衍生自多能细胞，创造了对髓鞘修复的激动，结果还未产生一个系统来研究少突神经胶质细胞谱系，这种系统提供高细胞群体同质化而不依赖免疫淘选、抗生素抗性或细胞分选技术来改进群体特征。由于少突神经胶质祖细胞(oligodendrocyte progenitor cell, 0PC)的纯的群体很难以临床相关量获得,髓鞘修复的激动就这样被减弱了。提供纯的和大量的神经胶质细胞的方法是必要的，以使得能够通过移植治疗。
[0011]这样，本领域中存在对产生神经胶质细胞谱系的细胞和细胞的群体的需求，尤其是,对于OPC和少突神经胶质细胞产生的需求。本发明解决了这种需求。
[0012]发明概述[0013]本概述的提供是为了介绍一系列简化形式的概念，所述简化形式的概念将进一步在下面的发明详述中描述。本概述并不意图鉴定所请求保护主题的关键或必需的特征，也不意图用于限制所请求保护主题的范围。所请求保护的主题的其他的特征、细节、用途和优点将从下面书面的发明详述中明显，包括在附图描述的和在所附的权利要求书中定义的那些方面。
[0014]本发明提供产生神经胶质细胞的方法，包括在诱导哺乳动物多能细胞和/或神经前体细胞分化成神经胶质细胞谱系的细胞和细胞群体的条件下，培养哺乳动物多能细胞和/或神经前体细胞。本发明还提供产生、扩增和使用哺乳动物神经胶质细胞的群体的方法，所述哺乳动物神经胶质细胞的群体包括少突神经胶质祖细胞、少突神经胶质细胞和星形胶质细胞的群体。而且，由本文所述的方法产生少突神经胶质祖细胞、少突神经胶质细胞和星形胶质细胞比本领域中目前使用的方法要求少得多的时间。
[0015]这样，在一个实施方案中，本发明提供产生哺乳动物神经外胚层的方法，包括:提供多能细胞，通过在激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂和骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂的存在下培养所述多能细胞来诱导所述多能细胞发育成神经外胚层细胞。
[0016]在另一个实施方案中，本发明提供产生哺乳动物模式(patterned)的神经外胚层的方法，包括:提供多能细胞；通过在激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂和骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂的存在下培养多能细胞来诱导多能细胞发育成神经外胚层；并且，通过在音猬因子(sonic hedgehog)、视黄酸和头蛋白(noggin)的一种或多种存在下培养神经外胚层来诱导模式的神经外胚层的发育。
[0017]在又一个实施方案中，本发明提供一种产生哺乳动物少突神经胶质祖细胞的方法，包括:提供多能细胞；通过在激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂和骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂的存在下培养多能细胞来诱导多能细胞发育成神经外胚层；通过在音猬因子、视黄酸和头蛋白的一种或多种存在下培养神经外胚层来诱导模式的神经外胚层的发育；并且，通过在成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子的一种或多种存在下培养模式的神经外胚层细胞来诱导少突神经胶质祖细胞的发育。
[0018]在这些实施方案的某些方面，多能细胞是哺乳动物外胚层干细胞，在其他方面，多能细胞是神经前体细胞。在某些实施方案中，多能细胞是啮齿动物胚胎干细胞(ESC)或啮齿动物诱导多能细胞(iPC)，在这种情况下，首先在JAK/STAT抑制剂如JAK抑制剂I的存在下培养啮齿动物ESC或iPC，以将细胞分化为外胚层样的细胞，随后继续分化为神经外胚层。
[0019]在这些实施方案中的某些方面，激活素-nodal通路的抑制剂是SB431542，骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂选自dorsomorphin、LDN-193189或头蛋白。在这些实施方案中的某些方面，从多能细胞的培养得到的细胞的75%或更多是神经外胚层细胞，在其他方面，从多能细胞的培养得到的细胞的80%、85%、90%、95%、99%或更多是神经外胚层细胞。
[0020]在某些方面，视黄酸、音猬因子或头蛋白之一用于培养神经外胚层来产生模式的神经外胚层，并且，在某些方面，视黄酸、音猬因子或头蛋白中的二种用于培养神经外胚层来产生模式的神经外胚层。而在另外的方面，视黄酸、音猬因子和头蛋白的所有三种用于培养神经外胚层来产生模式的神经外胚层。在某些方面，成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子中的一种或多种用于从模式的神经外胚层诱导少突神经胶质祖细胞的发育，在其他方面，成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子的所有三种用于从模式的神经外胚层诱导少突神经胶质祖细胞的发育。在某些方面，成纤维细胞生长因子是FGF2，血小板衍生生长因子是TOGF-AA。在这些实施方案中的某些方面，从模式的神经外胚层的培养得到的细胞的75%或更多是少突神经胶质祖细胞，在其他方面，从模式的神经外胚层的培养得到的细胞的80 %、85 %、90 %、95 %、99 %或更多是少突神经胶质祖细胞。
[0021]本发明另外的方面包括含本发明的少突神经胶质祖细胞的药物组合物、含本发明的少突神经胶质祖细胞以及神经元或神经前体细胞的药物组合物、含本发明的少突神经胶质祖细胞的诊断工具、和含本发明的少突神经胶质祖细胞的研究工具。而其他方面包括在受治疗者中治疗CNS的医学病症，所述治疗包括向受治疗者施用治疗有效量的由本发明的方法产生的少突神经胶质祖细胞。
[0022]而本发明的 又一个实施方案提供一种产生哺乳动物少突神经胶质祖细胞和在培养物中维持哺乳动物少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括:提供多能细胞；通过在激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂和骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂存在下培养多能细胞来诱导多能细胞分化成神经外胚层；通过在音猬因子、视黄酸和头蛋白中的一种或多种存在下培养神经外胚层来诱导模式的神经外胚层的发育；通过在成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子的存在下培养模式的神经外胚层来诱导少突神经胶质祖细胞的发育；并通过在fct-β -连环蛋白信号传导活化剂的存在下或在成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(TOGE)和音猬因子(SHH)的存在下培养少突神经胶质细胞来维持少突神经胶质祖细胞。
[0023]在本发明的这个实施方案的某些方面，从模式的神经外胚层的培养得到的细胞的75%或更多是少突神经胶质祖细胞，在其他的方面，从模式的神经外胚层的培养得到的细胞的80%、85%、90%、95%、99%或更多是少突神经胶质祖细胞。在某些方面，在少突神经胶质祖细胞的维持的培养物中的细胞的75%或更多是少突神经胶质祖细胞，在其他的方面，在少突神经胶质祖细胞的维持的培养物中的细胞的80 %、85 %、90 %、95 %、99 %或更多是少突神经胶质祖细胞。在本发明的这个实施方案中的某些方面，fct-β-连环蛋白信号传导活化剂是GSK3 0抑制剂，在具体的方面，GSK3 0抑制剂是CHIR99021。
[0024]本发明的这个实施方案的另外的方面包括从在培养物中维持的少突神经胶质祖细胞产生少突神经胶质细胞的方法，所述方法包括在FGF和TOGF不存在和在刺激分化的因子存在下培养少突神经胶质祖细胞。在某些方面，少突神经胶质细胞分化活化剂是甲状腺激素(Τ3)。本发明的这个实施方案的另外的方面包括从在培养物中维持的少突神经胶质祖细胞产生星形胶质细胞的方法，所述方法包括在骨形态发生蛋白和JAK/STAT通路活化剂的存在下培养少突神经胶质祖细胞。
[0025]本发明的其他实施方案和方面在下面的详述中描述。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1是一般图解，表明将多能细胞定向分化成少突神经胶质细胞命运的细胞的步骤。
[0027]图2是条形图，描绘了在EpiSC转变为神经外胚层期间得到的基因表达变化的结果O
[0028]图3是条形图，描绘了模式的神经外胚层转变为OPC期间得到的基因表达变化的结果。
[0029]图4是条形图，描绘了 OPC转变为少突神经胶质细胞期间得到的基因表达变化的结果。
[0030]图5是条形图，描绘了用GSK3i3抑制剂Chir099021处理OPC时，成熟少突神经胶质细胞标志物表达的抑制。
[0031]定义
[0032]本文中所用的术语意图具有如本领域普通技术人员理解的简单和普通的意思。除非特别指出，否则下面的·定义目的是帮助读者理解本发明，但不是意图改变或者以其他方式限制这些术语的意思。
[0033]术语“星形胶质细胞(astrocyte) ”和“星形胶质(astroglia) ”指将神经元锚定于它们的血液供应的神经胶质细胞。本发明的星形胶质细胞指原浆型和纤维性星形胶质细胞二者。本发明的星形胶质细胞特征在于，表达一种或多种神经胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)、SlOOi1、谷氨酰胺合成酶、GLAST或GLTl，并具有至少一种星形胶质细胞结构性或功能性表型。星形胶质细胞的结构性表型包括圆型细胞核、“星形”体和许多长的突起，所述许多长的突起作为血管脚踏板在CNS小血管上结束；结构性星形胶质细胞表型的另外例子可以在下面的材料中发现:Reynolds和Weiss，Science, 255:1707-1710(1992)；Reynolds 等，J.Neurosci 12:4565-4574(1992)；和 Kandel 等(1991), Principles ofNeuroscience，第三版(1991) (Appleton&Lange)。
[0034]“结合剂”是通过化学或物理方式结合的与特定的细胞命运的细胞上或中的一个或多个区域结合的任何分子。为了本发明的目的，结合剂优选与对特定的细胞命运的细胞独特的细胞表面分子或细胞内蛋白或部分选择性相互作用，所述特定的细胞命运的细胞例如，少突神经胶质祖细胞。可用在本发明中的结合剂的例子包括，但不限于:肽、蛋白(包括衍生的或标记的蛋白)；抗体或其片段；小分子；适体；碳水化合物和/或其他非蛋白结合部分；天然存在的结合伴侣的衍生物和片段；肽模拟物和药效团。
[0035]在本文使用的术语“生物过程”包括正常生理过程，如髓鞘再生、神经保护等，以及病理过程，如在疾病和疾患中涉及的那些，如自身免疫性疾病、神经退行性疾病、涉及遗传功能障碍的疾病、等等。
·[0036]在本文使用的术语“诊断工具”指为了对患者样品进行诊断试验或测试，使用的本发明的任何组合物或测试。作为诊断工具，本发明的组合物可以被认为是分析物特异性试剂的集合，这样可以形成被联邦或州机构批准的诊断测试的部分。
[0037]术语“赋形剂”指加入到本发明的药物组合物中的进一步促进治疗细胞的施用的惰性物质。赋形剂的例子，包括但不限于盐水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类型淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
[0038]术语“神经胶质细胞”和“神经胶质”是指神经系统中的非神经元前体和/或完全分化的细胞，它提供支持和营养，维持内稳态，形成髓鞘，参与信号传递。本发明的神经胶质细胞的例子包括但不限于少突神经胶质祖细胞、少突神经胶质细胞和星形胶质细胞。
[0039]术语“弓丨入(introducing) ”、“引入(introduction) ”等当用于递送剂给细胞(例如，wnt通路活化剂或激活素-nodal通路抑制剂)的情况时，指以任何生物有效形式递送齐U，包括但不限于肽、蛋白(包括衍生的或标记的蛋白)、抗体或其片段、小分子、适体、肽模拟物、和/或药效团。术语“引入(introducing) ”还指包含通过遗传方法的引入,例如,基因表达载体的引入，如病毒载体(如腺病毒载体或慢病毒载体)或表观遗传载体。
[0040]术语“少突神经胶质细胞”指成熟的充分分化的少突神经胶质细胞。成熟的少突神经胶质细胞可以根据结构和功能表型与少突神经胶质祖细胞区分。成熟的少突神经胶质细胞功能表型的例子包括但不限于，一种或多种标志物的表达，如蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘相关的糖蛋白(MAG)、髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)、和/或一种或多种半乳糖脑苷脂(OUGalC)。成熟的少突神经胶质细胞结构表型的例子包括但不限于，分支的和分叉的表型和实现髓鞘化的能力。
[0041]本文所用的术语“少突神经胶质祖细胞”和“0PC”指具有分化成少突神经胶质细胞的能力的细胞。OPC可以通过结构和功能表型与少突神经胶质细胞区分。少突神经胶质祖细胞功能表型的例 子包括，但不限于，有丝分裂的细胞(即，在培养中能分裂和被扩增三或更多代)，具有迁移能力，以及在体内和体外分化成髓鞘化表型来实现髓鞘化的潜能。
[0042]术语“药物组合物”指在本文描述的本发明的细胞的一种或多种、与至少一种药学上合适的赋形剂的制品。
[0043]术语“药学上可接受的载体”指促进递送和/或所施用的细胞的生物活性和性质的载体或稀释剂。载体的非限制性的例子有丙二醇、盐水、乳剂、和有机溶剂和水的混合物。
[0044]术语“多能细胞”指既能分化成具有特定的特化的功能(即“完全分化”细胞)的更特化的细胞类型(如神经胶质细胞)，又能产生具有相同或相似的未分化状态的细胞的能力的细胞。
[0045]在本文使用的术语“研究工具”指用于学术的或商业的性质的科学查询的本发明的任何细胞组合物或本发明的细胞或细胞组合物的用途，包括药物和/或生物治疗剂的开发。本发明的研究工具不意味着治疗性的或受到监管部门的批准；而是，本发明的研究工具意味着促进研究并帮助这些开发活动，包括目的是产生支持监管意见书的信息而进行的任何活动。
[0046]本文所用的术语“选择性结合(selectively binds) ”、“选择性结合(selectivebinding) ”等，当指结合伴侣时(例如，蛋白、核酸、抗体等)，指一种结合反应，这种结合反应决定分子(例如，蛋白和其他生物分子)的异质群体中某一组成(典型地细胞标志物)的存在。这样，在特定的测试条件下，结合伴侣与本发明的组合物的结合是背景的两倍，并将不会实质性地与样品中存在的其他组合物(细胞标志物)以显著的量结合。典型的，特异性结合将至少是背景信号或噪音的五倍，更典型的，是背景的10倍至100倍高。这样，在特定条件下，结合伴侣与它特定的“靶标”组合物结合并不以显著的量与样品中存在的其他分子结合。
[0047]本文所用的术语“小分子”指尺寸与通常用于基于化学的药物的那些有机分子相当的分子。该术语不包括生物大分子(例如蛋白、核酸等)。优选的有机小分子尺寸范围高至约5000Da，更优选的高至2000Da，最优选的高至lOOODa。
[0048]如在本文中使用的，术语“治疗(treat) ”、“治疗(treatment) ”、“治疗(treating) ”和类似术语，指获得所希望的药理和/或生理效果。这种效果可以是在完全地或部分地阻止疾病或其症状方面是预防性的，和/或可以是在部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不利影响方面是治疗性的。本文所用的“治疗”，包括在哺乳动物，优选地在人类中的疾病的任何治疗，包括(a)阻止受治疗者发生疾病,这个受治疗者可能易患疾病但还没有诊断有疾病；(b)抑制疾病，即阻止它的发展；和(C)缓解疾病，例如，引起疾病的倒退，例如，以完全或部分的去除疾病症状。
[0049]发明详述
[0050]本文所描述的技术的实践，除非另外指明，可以使用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、哺乳动物细胞培养、生物化学和测序技术的常规技术和描述，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。这些常规技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、以及使用标记物的杂交的检测。合适的技术的具体的示例可以参考本文的实施例。然而，当然，其他相当的常规的操作步骤也可以使用。这些常规的技术和描述可以在标准的实验室手册中发现，如Butler(2004)，Animal CellCulture (BIOS Scientific) ；Picot (2005), Human Cell Culture Protocols (HumanaPress), Davis (2002), Basic Cell Culture,第二版(Oxford Press) ;Lanza 等(编著)(2009) ,Essentials of Stem Cell Biology,第二版(Elsevier Academic Press) ；Lanza,(编著)(2009)，Essential Stem Cell Methods (Elsevier Academic Press) ;Loring 等(编著.)(2007),Human Stem Cell Manual (Elsevier Academic Press) ；Freshney (2010),Culture of Animal Cells(John Wiley & Sons) ；Ozturk 和 Hu (2006), Cell CultureTechnology for Phamaceutical and Cell-Based Therapies(CRC Press) ;Sambrook和Russell(2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual ；以及 Sambrook 和 Russell (2002), Molecular Cloning:A Laboratory Manual (均来自 Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Stryer, L.(1995)Biochemistry,第四版(ff.H.Freeman) ;Nelson 和 Cox (2000)，Lehninger, Principles of Biochemistry,第三版(ff.H.Freeman);和 Berg 等(2002) Biochemistry,第五版(W.H.Freeman);所有的参考书为了所有目的通过引用全文并 入本文。
[0051]注意，在本文和所附的权利要求书中，单数形式"一(a) "、"一(an)"和"该(the)"包括复数形式指代物，除非上下文另外清楚地指明。这样，例如，提及“少突神经胶质祖细胞”指一个或更多的神经胶质细胞命运的细胞，提及“分选”或“诱导”包括本领域技术人员已知的等效步骤和方法的提及，等等。
[0052]除非另外指出，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。在本文提到的所有出版物为了描述和公开可以与目前描述的发明关联的设备、制剂和方法的目的通过引用并入。
[0053]当提供数值的范围时，应理解，在该范围的上限和下限之间的每一个其间的数值，和该指定的范围中的任何其他指定的或其间的数值，都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，对于指定范围中任何具体地排除的限值，也被包括在本发明中。当指定的范围包括一个或两个限值时，排除这些包括的限值的一个或两个的范围也包括在本发明中。
[0054]在下列描述中，列出很多具体的细节来提供对本发明的更全面地理解。然而，对本领域技术人员来说这是明显的:本发明可以没有这些具体的细节之一或更多也可以实施。在另外的例子里，为了避免模糊本发明，没有描述本领域技术人员公知的特征和操作步骤。
[0055]本发明分化和产生细胞的群体的培养方法
[0056]本发明是基于以下新发现:多能干细胞能通过特定的一系列发育转变可分化为神经胶质谱系的细胞和细胞的群体，重演在发育中的胚胎中存在的复杂的信号传导环境。这包括将多能干细胞分化成相对纯的可扩增的细胞的群体，包括0PC、少突神经胶质细胞和星形胶质细胞。该方法提供产生大量神经胶质细胞谱系的细胞的能力，这种细胞包括来自多能干细胞的少突神经胶质祖细胞。然后这些OPC能被扩增为另外的0PC，或能进一步分化为成熟的细胞如少突神经胶质细胞和星形胶质细胞。这些神经胶质细胞能从多能细胞直接分化，或者它们可以从现存的神经元前体细胞产生，现存的神经元前体细胞已经部分被压低了外胚层细胞命运通路。
[0057]图1是一般图示，表明方法100的步骤，方法100用于多能细胞定向分化成0PC、少突神经胶质细胞 和星形胶质细胞的可扩增的群体。在101，提供了多能细胞。许多类型的多能细胞能用于本发明的方法。多能细胞优选地是哺乳动物干细胞，而在某些方面，禽类多能细胞可以用于本发明的细胞和细胞的群体的产生。
[0058]本发明的某些方面中，多能细胞是啮齿动物多能细胞。这些啮齿动物多能细胞包括大鼠或小鼠的诱导的多能细胞、大鼠或小鼠胚胎干细胞(mE S细胞)，如在美国专利6，190,910中描述或衍生的；大鼠或小鼠外胚层衍生干细胞(EpiSC)，如在USSN2010/0064380 和 Tesar 等 Nature，448(7150): 196-9 (2007)，Epub Jun 27，2007 中描述的，两者通过引用并入本文；大鼠或小鼠的诱导的外胚层干细胞、衍生自妊娠中期胚胎的原始生殖细胞(PGC)的啮齿动物胚胎生殖细胞(EGC) (Matsui等，Cell，70(5):841-7(1992)；Resnick等，Nature, 359 (6395):550-1 (1992));和从移植的新生儿睾丸细胞产生的多能生殖干细胞(mGSC) (Kanatsu-Shinohar, a 等，Cell, 119(7):1001-12 (2004))、成人睾丸细胞(Guan 等,Nature, 440 (7088):1199-203(2006), Epub Mar 24,2006 ；Seandel 等，Nature,449(7160):346-50(2007) ;Ko 等，Cell Stem Cell,5(1):87-96 (2009)、或小鼠睾丸细胞。在啮齿动物胚胎干细胞或啮齿动物诱导的多能细胞的情况下，首先利用例如在含JAK/STAT抑制剂如JAK抑制剂I的培养基中生长两到四天来将细胞分化为外胚层状态。
[0059]在某方面，多能细胞衍生自与临床相关的基因型的啮齿动物品种，例如，具有与人类临床敏感性或病理学相关的特定突变或多态性的小鼠。具有各种突变或多态性的小鼠胚胎干细胞允许产生带有这些突变的神经胶质细胞，所述神经胶质细胞可用于研究疾病进展和产生细胞的群体，例如，用于鉴定治疗候选剂或候选的或现存的治疗剂的毒性测定。
[0060]在另外的方面，取决于例如，要被治疗的哺乳动物或感兴趣的动物模型，可以利用其他哺乳动物多能细胞。这些哺乳动物包括猫、狗、马、猪、牛、羊等和灵长类。
[0061]在另外的方面，本发明的方法中使用的多能细胞是人类细胞。例如，人类胚胎干细胞能从人类胚泡分离，或者衍生自延迟胚泡阶段(例如，在W02006/040763中描述的那些)。多能细胞系还已经通过在培养中移植来衍生自其他胚胎和成人组织，用于制备这些人类诱导的或衍生的多能细胞的技术是本领域已知的。所有这些细胞类型的共同点是其来自早期胎儿或生殖谱系细胞的来源，这些早期胎儿或生殖谱系细胞表现为是包含表观遗传构象、允许自发转变成多能状态的仅有的细胞。这些细胞类型的分子共性是内源性0ct4的表达，这样，0ct4可作为细胞是否能产生可用于生产本发明的OPC、OPC群体、少突神经胶质细胞和星形胶质细胞的多能细胞系的有价值的预测标志物。在人类胚胎干细胞或人类诱导多能细胞的情况下，首先利用例如在含JAK/STAT抑制剂如JAK抑制剂I的培养基中生长两到四天来将细胞分化为外胚层状态。
[0062]本发明使用的干细胞也可以衍生自人类胚胎生殖细胞(EG)。对于制备人类胚胎生殖细胞的方法的另外的细节，参看Shamblott等，PNAS USA, 95:13726(1998)和美国专利6，090，622。在某些方面，用于神经胶质细胞谱系的细胞和细胞的群体分化的多能细胞是诱导的多能干细胞，如在Tokuzawa等，Cell，113(5) =631-42(2003)中描述的那些。
[0063]在步骤102中，将一种或多种激活素-nodal通路抑制剂和一种或多种骨形态发生蛋白通路抑制剂加入多能细胞101的培养基中。细胞培养技术是本技术公知的，并参考教科书如 Butler (2004), Animal Cell Culture (BIOS Scientific) ；Picot (2005), HumanCell Culture Protocols (Humana Press) ；Davis (2002), Basic Cell Culture,第二版，(Oxford Press) ；Freshney(2010), Culture of Animal Cells(John Wiley & Sons);以及 Ozturk 和 Hu (2006), Cell Culture Technology for Phamaceutical and Cell-BasedTherapies (CRC Press)。例如，多能细胞可以是外胚层干细胞，其中，用于培养的培养基包含补充20% Knockout血清替代品、Glutamax、非必需氨基酸和0.lmM2_巯基乙醇(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)的Knockout DMEM、或本领域中已知的其他培养基。
[0064]将一种或多种激活素-nodal通路抑制剂和一种或多种骨形态发生蛋白通路抑制剂加入(“引入”)该培养基中。Nodal是由NODAL基因编码的人类蛋白，是转化生长因子β超家族的成员。像TGFii超家族的许多其他成员一样，nodal参与细胞分化。小鼠NODAL对应物的研究表明，这个基因可以是早期胚胎发育中的中胚层形成和接下来的左右轴结构的机体形成必需的。小鼠的Nodal敲除引起神经外胚层的早熟分化和原条的不存在，并且不能形成中胚层，导致刚好在原肠胚形成之后的发育停止。激活素-nodal信号传导有助于维持人类胚胎干细胞(hESC)的多能性，人类胚胎干细胞(hESC)是内细胞群的衍生物，但共有外胚层组织的分子性质。激活素-nodal信号传导的抑制导致丧失hESC多能性。激活素-nodal通路抑制剂的例子 包括但不限于SB431542、SB505124、A83-01和卵泡抑素。
[0065]骨形态发生蛋白(BMP)是一个配体家族，也属于TGFii超家族。BMP与细胞表面上的特定的受体相互作用，所述受体称为骨形态发生蛋白受体。通过BMPR的信号转导(Signal transduction)导致下游祀标物的磷酸化。最充分地表征的信号级联是Smad通路，其表明对心脏、中枢神经系统和软骨的发育、以及出生后骨发育是重要的。BMP的变异和它们的拮抗剂如硬化蛋白(Sclerostin)与影响骨架和其他组织的许多人类疾病相关。骨形态发生蛋白通路抑制剂的例子包括但不限于Dorsomorphin、LDN-193189、头蛋白、ALK3_Fc、ALK6_Fc、Gremlin、脊索发生素(Chordin)和 Cerberus。
[0066]用激活素-nodal通路抑制剂和骨形态发生蛋白通路抑制剂处理多能细胞如多能外胚层干细胞导致区域特异性的神经外胚层细胞分化103，其中，激活素-nodal通路抑制剂诸如SB431542，它是TGF β超家族I型激活素受体-样激酶(ALK)受体ALK4、ALK5和ALK7 的抑制剂(参见 Inman 等,Molecular Pharmacology, 62 (I):65-74 (2002)),骨形态发生蛋白通路抑制剂诸如Dorsomorphin, —种BMP信号传导的小分子选择性抑制剂(参见Yu等，Nat Chem Biol，4:33_41 (2008))。在步骤104，通过在音猬因子(SHH)、视黄酸(RA)和头蛋白的一种或多种的存在下培养，得到的神经外胚层能随后进一步分化成模式的神经外胚层105，这导致区域特异性转录因子01ig2和Nkx2.2的上调，这两个转录因子通常在发育中的神经管的腹侧区域中表达。在106，通过在血小板衍生生长因子(TOGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和音猬因子(SHH)的存在下培养神经上皮细胞实现向少突神经胶质祖细胞的分化。
[0067]音猬因子同源物(SHH)是称为刺猬因子(hedgehog)的哺乳动物信号传导通路家族的三种蛋白之一，另两种是沙漠刺猬因子(desert hedgehog)和印度刺猬因子(Indianhedgehog)。SHH是刺猬因子信号传导通路的最充分研究的配体，在调整脊椎动物器官发生，如肢体的手指或足趾的生长和大脑的机体形成中起关键作用。音猬因子是形态发生素的最充分建立的例子之一，形态发生素是一种扩散形成浓度梯度的分子，取决于其浓度，对发育中的胚胎的细胞有不同效果。音猬因子在脊椎动物发育过程中中枢神经系统(CNS)的模式形成中承担多种作用，并保持对成体重要，控制成体干细胞的细胞分裂。最近，音猬因子还已经显示作为轴突引导信号起作用。
[0068]视黄酸(RA)是维生素A (视黄醇)的代谢产物，介导对生长和发育所需的维生素A的功能。视黄酸在包括从鱼类到人类的所有高等动物的脊索动物中是必需的。在早期胚胎发育中，在胚胎的特定区域中产生的视黄酸，通过作为指导胚胎后部分发育的分子间信号传导分子，帮助决定沿胚胎前/后轴的位置。它通过Hox基因作用，这个基因最终控制在早期发育阶段模式的前/后模式形成。
[0069]头蛋白，还称为N0G，是在人类中由NOG基因编码的蛋白。头蛋白通过与TGF-β家族配体结合并阻止它们与它们相应的受体结合来抑制TGF-β信号转导。头蛋白通过抑制ΒΜΡ4、以及其他TGF-β信号传导抑制剂如脊索发生素和卵泡抑素，在神经诱导中起关键作用。小鼠敲除实验已经证明，头蛋白还在骨骼发育、关节形成和神经管融合方面起重要作用。由NOG基因编码的分泌的多肽头蛋白，与转化生长因子-β超家族信号传导蛋白的成员如骨形态发生蛋白-4结合并将其失活。头蛋白表现为在发育早期和晚期具有多效的效果O`[0070]血小板衍生生长因子(TOGF)是调节细胞生长和分裂的众多的生长因子之一，在血管生成、胚胎发育、细胞增殖和细胞迁移方面起着重要的作用。在化学方面，血小板衍生生长因子是二聚的糖蛋白，由两个A(-AA)链或两个B(-BB)链或两个的组合(-AB)构成。PDGF在早期发育阶段是促有丝分裂的，推动未分化的间充质和一些祖先群体增殖。在后面的成熟阶段，PDGF信号传导牵涉在组织重塑和细胞分化、和参与模式形成和形态发生的诱导事件中。除了推动间充质增殖外，在发育期和成体动物中，TOGF显示指导各种特化的间充质的和迁移的细胞类型的迁移、分化和功能。在这个家族中的其他生长因子包括血管内皮生长因子B和C、以及胎盘生长因子(PlGF)。
[0071]成纤维细胞生长因子或FGF，是参与血管生成、伤口愈合和胚胎发育的生长因子的家族。FGF是具有各种作用的多功能蛋白；它们最通常是有丝分裂原，但也具有调节的、形态的和内分泌作用。由于它们对多种细胞类型的多重作用，他们可替换地称为“多能”生长因子、和混杂生长因子。在FGF的情况下，四种受体亚型能被多于二十种不同的FGF配体激活。FGF在发育过程中的功能包括中胚层诱导、前后模式形成、肢体发育、神经诱导和神经发育，以及成熟组织/系统的血管生成、角质化细胞的机体形成、和伤口愈合过程。
[0072]在方法100中，从模式的神经外胚层形成的少突神经胶质祖细胞107可以在培养中维持，而不通过引入fct通路活化剂来分化，优选地，使用一种或多种GSK3 β抑制剂，或者通过在成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和音猬因子(SHH)存在下培养，108。可用于本发明方法的示例性GSK3 0抑制剂包括但不限于，氯化锂(LiCl)、6-溴靛玉红-3'-肟(BIO)、Chiron 99021和在Gabriel等的美国专利7，300，943中描述的那些化合物，此参考文献通过引用全文并入本文。fct信号传导通路是蛋白网络，它们最已知的作用是在胚胎发生和癌症中，但也参与成年动物的正常生理过程。fct蛋白激活细胞中的各种通路，这些通路能分成典范和非典范Wnt通路。典范Wnt通路描述当Wnt蛋白与Frizzled家族的细胞表面受体结合时发生的一系列事件,引起受体激活Dishevelled家族蛋白，最终导致到达细胞核的β-连环蛋白量的变化。Dishevelled是膜相关的Wnt受体复合物的关键成分，当被fct结合激活时，抑制包括axin、GSK3和蛋白APC的蛋白的第二复合物。axin/GSK-3/APC复合物一般促进β -连环蛋白细胞内信号传导分子的蛋白水解降解。在这个β-连环蛋白 破坏复合物被抑制后，一组细胞质连环蛋白稳定，并且一些连环蛋白能进入细胞核，与TCF/LEF家族转录因子相互作用，促进特定的基因表达。已经将几种蛋白激酶和蛋白磷酸酶与细胞表面fct-激活的Wnt受体复合物结合axin和分解axin/GSK3复合物的能力相关。LRP的细胞质结构域被CKl和GSK3的磷酸化能调节axin与LRP的结合。GKS3的蛋白激酶活性表现为对膜相关的Wnt/FRZ/LRP/DSH/Axin复合物的形成和Axin/APC/GSK3/ β -连环蛋白复合物的功能是重要的。β -连环蛋白被GSK3的磷酸化导致β-连环蛋白的破坏。
[0073]作为维持OPC在祖细胞状态的一种替代方案，通过控制其它分子机理，能将OPC进一步分化成神经胶质谱系细胞。在某些实施方案中，通过取出FGF和TOGF和加入Τ3，110，使用本发明的方法产生的OPC可体外分化成成髓鞘的少突神经胶质细胞111。Τ3，三碘甲状腺原氨酸是一种甲状腺激素，影响身体的几乎每个生理过程，包括生长和发育、代谢、体温和心率。Τ3和它的激素原甲状腺素(Τ4)的产生被促甲状腺激素(TSH)所激活，促甲状腺激素由脑垂体释放。这个通路由闭环反馈过程调节。在血浆中Τ3和Τ4浓度的升高抑制脑垂体中TSH的产生；当这些激素浓度下降时,脑垂体增加TSH的产生，通过这些过程，建立了反馈控制系统来调节血流中甲状腺激素的量。Τ3对发育中的胚胎和婴儿有深刻的作用，影响肺并影响中枢神经系统的出生后生长。Τ3还刺激髓鞘的产生、神经递质的生产、和轴突的生长，对骨骼的线性生长也是重要的。
[0074]在另一个替代的方案中，使用本发明的方法产生的0PC，通过使用骨形态发生蛋白(BMP)和JAK/STAT通路活化剂112，体外分化成星形胶质细胞113。如上所述，BMP是属于TGF^超家族的配体家族，最初认为他们能够诱导软骨形成。尤其适于在本发明中使用的用于分化OPC为星形胶质细胞的一种BMP是BMP4。在人类胚胎发育中，BMP4是胚胎早期分化和背-腹轴建立所需的信号传导分子。BMP4从脊索的背部分泌，与SHH —起作用，为晚期结构的分化建立背-腹轴。另外，BMP4刺激上覆的外胚层组织的分化。
[0075]janus激酶(JAK)-信号转导和转录激活因子(signal transducer and activatorof transcription, STAT)通路在导致各种细胞功能包括增殖、生长、造血和免疫反应的广泛的细胞因子和生长因子的信号传导中起着重要的作用。细胞因子和生长因子与它们相应的受体结合激活JAK，其然后磷酸化的受体和STAT蛋白的特定的酪氨酸残基。STAT然后二聚化，转运到细胞核，与共有的DNA序列结合，并起始靶标基因的转录。已经鉴定了四种JAK家族激酶和七种STAT家族成员，一些被普遍地表达。氨基酸序列的多样性和组织特异性的分布解释了 STAT响应于细胞外细胞因子的不同的作用。JAK/STAT通路的活化剂包括白血病抑制因子(LIF)、IL-6、cntf、CT-1 和 OSM。
[0076]使用由上面概述的本发明的方法，从而可将多能细胞分化成临床相关的OPC的纯的群体，提供易处理的平台，用于解释少突神经胶质细胞发育的分子调控，探索在影响少突神经胶质细胞谱系的先天性紊乱中起作用的致病细胞和分子缺陷，并且用于高通量药物筛选。而且，本发明的细胞的群体可以用于基于细胞的治疗，来恢复功能性的髓鞘化。可选地，OPC能进一步分化成成髓鞘的少突神经胶质细胞和星形胶质细胞，这两种细胞可在体内和体外用于药物筛选或用于基于细胞的治疗。
[0077]细朐移棺
[0078]可以使用用于将本发明的细胞和细胞群体引入受治疗者的许多方法。本发明的一个重要方面涉及治疗患有由髓鞘丧失和/或少突神经胶质细胞不能髓鞘再生神经纤维介导的病变的受治疗者的方法，通过在有效治疗所述病变的条件下向受治疗者施用少突神经胶质祖细胞。对于注射，药物组合物的细胞可以配制成水溶液，优选地，以生理上相容的缓冲液如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。
[0079]通过注射施用药物细胞组合物包括实质内注射进脑本身的患病部分以及在脑、脑干或CNS的远端部位引入细胞，细胞随后迁移到脑的患病部分。一般地，根据所需髓鞘再生的程度，施用涉及从IX IO4至IXlO9的细胞剂量范围。剂量和间隔可以单独地调整至由植入的细胞足够有效地调整髓鞘再生的程度。实现所需效果必需的剂量将依赖于个体特征和施用途径。
[0080]根据要治疗的病变的严重性和响应程度，给药可以包含单次施用或多次施用，疗程持续从几天到几星期，或直到达到疾病状态减缓。当然，要施用的药物细胞组合物的量，依赖于要治疗的个体、痛苦的严重性、施`用方式、处方大夫的判断等等。施用的剂量和时间安排任选地将与受治疗者的变化中的病变的仔细和连续的监测相对应。例如，基于监测的指示，对治疗的多发性硬化症患者将施用足够减轻疾病症状的细胞。
[0081]本发明的细胞可以在“鸡尾酒”中与可用于治疗神经退行性紊乱的治疗剂同时施用，如神经节苷脂；抗生素、神经递质、神经激素、毒素、神经轴促进分子；和抗代谢物和神经递质分子的前体。另外，本发明的细胞可以与其他细胞共同施用。
[0082]移植以后，本发明的细胞优选地在患病区域存活一段时间(例如，至少六个月)，以至于观察到治疗效果。在本发明的一个方面，在辐射施用后对受治疗者施用少突神经胶质祖细胞，例如，以治疗中枢神经系统的原发性肿瘤和转移性肿瘤。
[0083]在某种情况下，包括OPC或少突神经胶质细胞不足与神经元的丧失组合的情况，移植混合的细胞的群体可以是期望的，如本发明的OP C细胞的群体与神经元或神经元前体的混合物。从而，本发明的分化的细胞能与神经元或神经元前体一起被引入，如在USSN2010/0021437中描述地产生的那些，这篇文献通过引用并入本文。在本发明的一个方面，受治疗者将用OPC或少突神经胶质细胞的群体和神经元或神经元前体进行治疗。
[0084]通常，可以使用本领域已知的任何技术来监测移植的成功，包括使用临床的和表型的指示剂。例如，MRI可以被用于可视化脑白质并研究脱髓鞘化病变的负荷，如当前用于监测MS患者的实践。N-乙酰基-天门氨酸水平的磁共振光谱测量能用来评估对局部神经元/轴突生存的作用，通过在移植之前使用顺磁性颗粒标记细胞，使得细胞分散体由MRI跟踪。可选地或另外，可以使用磁化传递对比来监测髓鞘再生(Deloire-Grassin, J.Neurol.Sc1.，178:10-16 (2000)) ο系列的神经生理学监测技术也能用来评估随时间的改进。
[0085]另外，感觉和运动神经传导性的电生理测量，例如，H-波回应，是用来监测与脱髓鞘外周病变相关的神经病的经典方法。(Lazzarini等,编著(2004)Myelin Biology andDisorder(Elsevier Academic Press))。
[0086]更普遍的表型神经生理学评定的其他方法在Leocani等,Neurol Sc1.,21 (4增刊2):S889-91(2000)中描述，其可以用于目的是多病灶性或更弥漫性髓鞘修复的干预。例如，脱髓鞘引起体态(发抖、哆嗦)和运动的改变，并且患有脑白质营养不良的儿童具有运动和智力的迟缓。这些状态的改进可以被评估以监测治疗的成功。
[0087]可适用的疾病状态
[0088]使用本发明方法产生的细胞的群体能被用于脱髓鞘状态的研究，包括药物的鉴定和开发和在涉及神经胶质细胞的多种疾病状态、尤其是涉及CNS的疾病的治疗性干预。下面将更详细地描述可以使用本发明的细胞的群体研究并可鉴定对其的治疗性干预的示例性的疾病。
[0089]多发性硬化症(MS)，一种CNS的进行性的、神经退行性疾病，最常以复发的/减轻的形式发生，其中，脱髓鞘化阶段之后是功能恢复阶段(Weiner, Ann Neurol,65:239-248(2009))。恢复阶段包括经由OPC的迁移和成熟的髓鞘再生(Chari，Int RevNeurobiol, 79:589-620 (2007))。然而，当疾病进行时，随着功能的进行性丧失，不能髓鞘再生(Blakemore 和 Keirstead, J Neuroimmunol, 98:69_76 (1999))。对完整的轴突不能髓銷再生的可能的解释包括OPC向脱髓鞘位点的补充的缺陷或OPC分化成髓鞘化的少突神经胶质细胞的缺陷。虽然研究表明OPC生物学的两个方面在MS中被改变，在成年CNS中协调这些过程的分子机理尚不能完全被理解。
[0090]由髓鞘丧失介导的其他病变包括缺血性脱髓鞘病变、发炎性脱髓鞘病变、儿科脑白质营养不良、粘多糖积症、围广期胚层出血、大脑性擁疾、脑室周围白质软化(periventricular leukoinalacia)、福射诱导的病变、由于各种病因的皮质下脑白质病、以及精神疾病，如精神分裂症。缺血性脱髓鞘病变包括皮质中风、腔隙性梗塞、缺氧后脑白质病、糖尿病性脑白质病和高血压性脑白质病。发炎性脱髓鞘病变包括多发性硬化症、谢耳德氏病、横贯性脊髓炎、视神经炎、接种后脑脊髓炎和感染后脑脊髓炎。儿科脑白质营养不良病变包括溶酶体贮积病(例如，戴萨克斯病)、卡纳万氏病、佩-梅氏病和Crabbe氏球样体脑白质营养不良。粘多糖贮积症的例子是Sly病。辐射诱导的病变包括辐射诱导的脑白质病和辐射诱导的脊髓炎。引起皮层下脑白质病的病因包括HIV/AIDS、头部外伤和多发梗塞状态。
[0091]根据本发明的某些特征，在治疗中使用的药物细胞组合物可以包含少突神经胶质细胞，并且医学病症与不充分的髓鞘化相关。根据进一步的本发明的特征，细胞包括星形胶质细胞，并且医学病症选自由亚历山大病、癫痫、阿尔茨海默氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤和神经发生缺陷组成的组。用包含根据本发明的少突神经胶质祖细胞的药物组合物治疗的受治疗者优选是哺乳动物，更优选人类，最优选，成人或出生后的人类。
[0092]细胞的群体用作药物发现和毒件测试的研究工具[0093]本发明的神经胶质细胞的群体的一个重要的用途是作为研究工具，专门用于发现和开发用于参与疾病、紊乱和/或生理过程如神经修复的一种或多种生物学过程的调节的治疗产品。基于细胞的研究工具可以用于药物发现和研究的各个方面，包括但并不限于候选药物的最初鉴定，候选药物活性的证实，现有的药物产品的活性、和/或药物或候选药物的毒性的鉴定。基于细胞的组合物的另外的用途是作为研究工具，专门用作诊断工具，来检测对参与疾病或紊乱的生物学过程的调控必需的分子的存在或不存在。这样，在一个方面，本发明包括研究工具，其含有本发明的细胞组合物，和这样的研究工具在鉴定、研究和/或证实可用作治疗剂的选择性结合剂的活性中的用途。另外，本发明包括使用本发明的方法分离的结合剂，以及这些结合剂在治疗或诊断环境中的用途。
[0094]这样，根据本发明的又另外的方面，提供了一种确定治疗对CNS功能性的效果的方法，该方法包括将本发明的细胞经受治疗剂或结合剂(例如，药物、条件如电处理和辐射处理)；确定被治疗细胞的至少一种结构或功能表型，与未被治疗的细胞比较，因此确定治疗对CNS功能性的效果。本发明的细胞能用于鉴定和优化能经由神经胶质细胞的活性恢复神经功能的治疗，并因此能用于鉴定和优化适合治疗神经紊乱的药物(例如，包括被本发明设想的治疗方法)。
[0095]确定目标治疗对本发明的细胞的效果能用于鉴定和优化能经由神经胶质细胞的活性恢复神经功能的治疗，并因此能用于鉴定和优化适合治疗神经紊乱的药物。确定针对CNS或要求神经功能性的任何其他组织的疾病的治疗的效果能被用于评估这些临床治疗对CNS功能的毒性。这样，本发明的这个方面能用于经由评价神经胶质细胞的活性，确定各种治疗如药物治疗对神经功能的治疗和毒性效果。本发明的其他方面包括使用细胞或细胞的群体获得细胞或细胞的群体在经受治疗之前和之后的基因表达谱和其他变化。
实施例
[0096]提出下面的实施例是为了给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整的公开内容和描述，并不意味着限制发明人认为的发明范围，也不是指代表或暗示下面的实验是进行的所有的或仅有的实验。本领域技术人员应领会，可以对本发明进行多种改变和/或修改，如在特定的实施方 案中所示的，而不偏离本发明广泛地描述的精神或范围。因此，目前的实施方案在所有方面中被认为是示例的而不是限制。
[0097]已经做了努力保证使用的数字的准确性(例如，量、温度等)，但仍应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指出，份数是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压力是或接近大气压。
[0098]通常，本文和在下面具体的实施例中描述的方法适用于哺乳动物多能细胞；然而，某些细胞如啮齿动物胚胎干细胞和诱导的多能干细胞，和各种其他哺乳动物干细胞(包括人类干细胞)可以要求第一步分化这些细胞成外胚层或外胚层-样细胞。另外，本文描述的各个分化步骤所需的时间安排可以在哺乳动物之间变化。例如，用本文的方法将小鼠的多能细胞分化成神经外胚层可以花2至5天，而人类多能细胞的这样的分化可以花4至10天。相似地，用本文的方法将小鼠的神经外胚层分化成模式的神经外胚层可以花I至2天，而人类神经外胚层的这样的分化可以花2至5天。
[0099]实施例1:多能细胞分化成神经外胚层.[0100]除非另外指出，所有的细胞在37°C和5%C02下培养。单独EpiSC系从小鼠129SVEV品系(EpiSC5和EpiSC7系)、(12901系)和129SvEvX ICR(EpiSC9系)中分离,体外维持在补充有 IOng Hir1FGFZ (R&D Systems, Minneapolis, MN, 233-FB)的 EpiSC 基础培养基中。EpiSC分化成模式的神经外胚层是5天的过程，每天完全更换培养基。
[0101]EpiSC基础培养基由补充有20 % Knockout血清替代品(KSR ； Invitrogen,Carlsbad, CA)>2mM Glutamax(Invitrogen, Carlsbad, CA)>I X 非必需氨基酸(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 0.lmM2-疏基乙醇(Sigma-Aldrich, St.Louise, MO)的Knockout DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)组成。神经基础培养基由补充有 1XN2(R&DSystems, Minneapolis, MN)、无维生素 A 的 I XB-27 (Invitrogen, Carlsbad, CA)和 2mMGlutamax 的 DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 11320)组成。在第 0 天,在标准传代条件下将EpiSC放置 于补充有IOOng πιΓ1头蛋白(R&D Systems, Minneapolis, MN)、20 μ MSB431542 (Sigma-Aldrich, St.Louise, MO ;在01^0 中作为 20mM 母液保持)和 2μΜdorsomorphin(EMD ;作为在DMSO中的IOmM母液供应)的EpiSC基础培养基上。0.1 μ MLDN-193189 (Stemgent，San Diego, CA ;按照制造商的说明作为ImM母液保持)在某些实验中用于代替dorsomorphin。在第一天,对培养物供应补充有IOOng πιΓ1头蛋白、20μΜSB431542和2 μ M dorsomorphin的EpiSC基础培养基和神经基础培养基的1:1混合物。第二天,对培养物供应补充有IOOng πιΓ1头蛋白、20 μ M SB431542和2 μ Mdorsomorphin的神经基础培养基。第三天，对培养物供应补充有IOOng πιΓ1头蛋白的神经基础培养基。第四天，对培养物供应补充有IOOng πιΓ1头蛋白、10 μ M视黄酸(Sigma-Aldrich, St.Louis,MO ;作为在DMSO中的20mM母液保持)和200ng ml^SHH(R&D Systems ；C24II)的神经基础培养基。
[0102]实施例2:将EpiSC衍生的模式的神经外胚层分化成0PC.[0103]将第5天的模式的神经外胚层细胞使用1.5mg πιΓ1胶原酶IV(Invitrogen,Carlsbad, CA)从培养皿中释放，并且用 TrypLE Select (Invitrogen, Carlsbad, CA)将其分解成单细胞悬液。计数细胞，以4X IO4细胞/cm2放置于以0.1mg πιΓ1聚(L-鸟氨酸)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)接着用 IOygmr1 层粘连蛋白(Sigma ；L2020)包被的Nunclon-Λ板上。细胞生长在OPC培养基上，OPC培养基由补充有20ng mr1FGF2,20ngInF1PDGF-AA(R&D Systems, Minneapolis, MO)和 200ng Hir1SHH 的神经基础培养基组成，每隔一天供应一次，共5天。此时，培养物由增殖中的OPC的高纯度的群体构成。
[0104]实施例3:0PC培养.[0105]将EpiSC 衍生的 OPC 培养物在补充有 20ng mr1FGF2,20ng Hir1PDGF-AA 和 200ngHir1SHH 或 20ng m^PDGF-AA、200ng ml^SHH、IOOng πιΓ1 头蛋白、10 μ M 二丁酰基环-AMP 钠盐(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) > IOOng HiF1IGF-1 (R&D Systems, Minneapolis, MO)和IOng ι?1_1ΝΤ3 (R&D Systems, Minneapolis, MO)的神经基础培养基上维持和扩增，每隔一天供应一次。OPC生长在用聚(L-鸟氨酸)和层粘连蛋白包被的Nunclon-Δ板上。细胞用TrypLE Select每3_5天传代，并典型地以2 X IO4细胞/cm2接种。OPC可以被容易地冷冻或融化，在补充有 10% FBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 10% DMSO(Sigma-Aldrich,St.Louis, MO)的DMEM中冷藏保存。对于累积的OPC实验，在‘第O代’接种4X IO4细胞/cm2。接着，在80-90%汇合时将细胞传代并以2X IO4细胞/cm2接种。每代的总细胞数用血细胞计计数。确定每代的生长速率并且延伸到细胞的整个群体以产生累积的计数。
[0106]实施例4:EpiSC衍牛的OPC的分化.[0107]对于OPC分化成少突神经胶质细胞，将细胞以2.2X IO4细胞/cm2铺板，并用补充有 0.4ng ι?1_1Τ3 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) >200ng HiF1SHH^ IOOng mF1 头蛋白、ΙΟμΜ 二丁酰基环-AMP钠盐、IOOng Hir1IGF-1和IOng πιΡΝΤβ的神经基础培养基诱导。调控这个分化范例的结果的努力包括用Jagl (R&D Systems, Minneapolis, MN)、CHIR99021 (Stemgent, San Diego, CA)、LIF (Millipore, Billerica, MA)和 / 或BMP4(R&DSystems, Minneapolis, MN)处理。
[0108]实施例4 =EpiSC衍生的OPC分化的时间推移成像和免疫染色.[0109]对于活细胞成像实验，将EpiSC衍生的OPC放置在用聚(1-鸟氨酸)和层粘连蛋白包被的玻璃底微孔盘上(MatTek，Ashland，MA，P35G-1.5-14-C)。在分化培养基(T3、SHH、头蛋白、cAMP、IGFl和NT3)中，以3.1XlO4细胞/cm2的密度接种细胞。在允许细胞粘附3小时之后，在37°C和5% CO2,在活细胞培养室和盖(Pecon,Erbach,Germany)中,用HamamatsuOrca电荷耦合器件(CCD)照相机每10分钟采集一次图像，直到72小时，所述照相机在倒置的显微镜上(Leica DMI6000B),所述显微镜配备有精密扫描载物台(Marzhauser,Wetslar,Germany)。使用自适应聚焦控制保持随时间的多位焦点稳定性。使用Image Pro Plus和Adobe Premiere Pro CS5 产生影片。
[0110]准备体外培养的细胞用于免疫染色是通过先在4% (体积/体积)多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)中固定 15 分钟，然后用在 PBS (pH7.4)中的0.2% Triton X透化10分钟。然后在室温(21_24°C )下用PBS中的10%正常山羊血清(Abcam)或10%正常驴血清(Abeam, Cambridge, MA)封闭细胞的非特异性结合1_2小时。在封闭溶液中稀释第一抗体并且与样品培养，在4°C过夜或在室温下I小时。样品用PBS润洗并用合适的AlexaFluor标记的第二抗体(Invitrogen ；4 μ g ι?Γ1)于室温培养I小时。对于细胞核的可视化，将样品与PBS中的I μ g Iiir1DAPI (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)培养5分钟。`
[0111]对细胞表面标志物04使用活细胞染色。活细胞用10%正常山羊血清封闭，并用04抗体于37°C处理20分钟。细胞轻轻的用温的神经基础培养基润洗三次并用4%多聚甲醛固定。样品用PBS润洗并于室温下用AlexaFluor标记的第二抗体(Invitrogen, Carlsbad,CA ;4μ g πιΓ1)培养I小时。然后将细胞透化并用DAPI染色以使细胞核可视化。
[0112]所用的第一抗体是针对以下的:0ct3/4(Santa Cruz, sc5279 ；0.4 μ gmF1) >Soxl (R&D Systems, AF3369 ；I μ g ml 0、Pax6(Covance, PRB-278P ；0.67 μ g ml 0、01ig2 (Millipore, Billerica, MA ;1: 1，000)、Nkx2.2 (DSHB，74.5A5 ;4.4 μ g πιΓ1)、SoxlO (R&D Systems, AF2864 ；2μ g ml—1)、04 (1: 10)、GFAP (DAK0，Z0334 ;0.58 μ g πιΓ1)、β II1-微管蛋白(Covance, Tujl ;0.2 μ g ml O 和 MBP (Covance, SM1-99P ;2 μ g Iiil1SAbeam, ab7349 ； 1: 25)的抗体。由 T.Jessell 和 S.Brenner-Morton 开发的Nkx2.2 (74.5A5)抗体从发育研究杂交瘤库(Developmental Studies Hybridoma Bank)得到,该发育研究杂交瘤库由美国国家儿童健康和人类发育研究所(US National Institute of Child Healthand Human Development)主持并由 University of 1wa 维持。
[0113]对于胚胎组织，在胚胎11.5天时(E11.5)，用4%多聚甲醛固定胚胎并冷冻切片。在使用柠檬酸钠缓冲液(IOmM柠檬酸钠和0.05%吐温20 ；pH6.0)回收抗原之后，切片用含有0.2% Triton X的10%驴血清封闭2小时。切片然后在封闭溶液中用01ig2 (Millipore,Billerica, MA, AB9610 ；1: 200)和 Nkx2.2 (DSHB，74.5A5 ;8.8 μ g ι?Γ1)抗体染色，于 4°C下过夜。Alexa Fluor标记的第二抗体(Invitrogen ；4 μ g ι?Γ1)用于检测，细胞核用DAPI可视化。
[0114]对于TOGFRα和NG2的流式细胞术，EpiSC衍生的OPC从培养物中收集并用10%正常驴血清封闭30分钟。然后细胞用别藻蓝蛋白(APC)轭合的TOGFRa (eBioscience,APA5 ；4μ g ι?Γ1)和未轭合的兔多克隆 NG2 (Millipore，Billerica，ΜΑ，ΑΒ5320 ;1 μ g ι?Γ1)抗体染色30分钟,接着用Alexa Fluor标记的第二抗体(Invitrogen ；4 μ g ι?Γ1)培养20分钟。使用同种型对照抗体作为染色对照并设置门控(APC-轭合的大鼠IgG (eBioscience ；
4μ g ml—1))和正常的兔 IgG (Santa Cruz ； I μ g ml—1)、Alexa Fluor 标记的第二抗体(Invitrogen ;4 μ g πιΓ1))。在 BD FACSAria 上分析细胞,用 WinList3D7.0 软件产生绘图。象限门控以少于0.1%双阳性细胞的同种型对照设置。
[0115]实施例5:共培养物的髓鞘化分析.[0116]从E17小鼠的皮质获得原代神经元。解剖之后，皮质用在Earle氏平衡盐溶液(EBSS)中的0.125%胰蛋白酶于37°C培养8分钟并重悬于含10% FBS的10ml DMEM中。皮质在 600g 离心 2 分钟并重悬于 Iml 含 2 % B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA)和 0.25 %Glutamax2的神经基础培·养基(NBM)中。然后皮质通过直径逐渐减少的3个玻璃吸管磨碎，离心，重悬于补充的NBM中，然后通过40 μ m细胞过滤器(BD Biosciences, FranklinLakes,New Jersey)过滤。将细胞置于腔室盖玻片上,此盖玻片已经用聚(d_赖氨酸)和层粘连蛋白包被，在37%和10% CO2下维持I星期。将EpiSC衍生的OPC悬浮在neurobasal和DMEM(ND)生长培养基2的1:1 (体积/体积)混合物中并加入到神经元培养物中。在6天的共培养之后处理细胞用于免疫荧光，并用MBP (Abcam，Cambridge，MA)和β II1-微管蛋白(Tujl ；Neuromics, Edina MN)抗体分析。使用Alexa fluor标记的第二抗体(2 μ gπιΓ1)检测并用DAPI将细胞核可视化。
[0117]实施例6:体内髓鞘化分析.[0118]所有的动物实验均被Case Western Reserve University的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。出生后早期 1-3 天(P1-P3)的哆嗦者(Mbpshi/shi)小鼠作为移植EpiSC衍生的OPC的宿主。幼崽用异氟烷麻醉并且以0.5μ Ι/min的速度单侧注射悬浮在1.5μ I的神经基础培养基中的2.5X IO5细胞，以祀向未来的胼胝体。注射用Hamilton注射器进行,在头骨中线向右+0.5mm和前囟点前+0.5臟，深度2mm。在不同时间点杀死用EpiSC衍生的OPC以及对照注射的小鼠以分析髓鞘化。小鼠用啮齿类鸡尾酒(氯胺酮、甲苯噻嗪和乙酰丙嗪)深度麻醉，于室温下心脏灌注0.9%盐水，然后灌注冰冷的4%多聚甲醛。大脑被解剖并用4%多聚甲醛固定2小时，然后用鹿糖冷冻保护。皮质于干冰上在最优切片温度(OCT)介质中冷冻,在Microm 525低温恒温器上切割20 μ m切片。切片被空气干燥然后冷冻。对于MBP荧光染色，切片被融化并被允许干燥，然后在PBS中再水化。切片用冰冷的95%甲醇和5%乙酸处理7分钟，在PBS中润洗并于室温在10%·山羊血清中封闭I小时。切片然后用MBP (Covance ；2μ g ι?Γ1)染色过夜。Alexa Fluor标记的第二抗体(2 μ g πιΓ1)用于检测并且细胞核用DAPI可视化。染色的切片使用Vectashield (Vector Labs)封片并用Zeiss LSM 510 META激光扫描共聚焦显微镜成像。呈现的所有的图像是Z-维系列最大强度投影，所述投影由每0.9 μ m收集的1.8 μ m光片(由LSM 510软件确定最佳时间间隔设置)组成。
[0119]实施例7:器官型(Organotypic)切片培养物髓鞘化分析.[0120]解剖P2-P4哆嗦者或野生型小鼠的前脑并且300 μ m冠状切片在Leica Vibratome上制作。切片如以前描述的那样在含有15%马血清、修改的N2和TOGF-AA的DMEM-BasalMedium Eagle氏基础培养基中培养3天。使用拉式玻璃吸管将2X IO5EpiSC衍生的OPC人工地注射进切片并在培养物中生长另外的10天。一些OPC培养物首先用EGFP以慢病毒标记。切片在4%多聚甲醛中固定，用冰冷的95%甲醇和5%乙酸处理，并测试MBP表达(Covance ；Jackson Labs,生物素-抗-小鼠 IgG ；Vector Labs, ABC ；Sigma, DAB)。对于谱系追踪实验，切片被测试 NeuN(Millipore, Billerica, MA, ABN78)和 GFP(Invitrogen,Carlsbad, CA 3E6)表达。为了分析髓鞘超微结构，然后将固定的和MBP染色的切片固定(在0.1M 二甲胂酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛和2%戊二醛，pH7.4)，在1%四氧化锇中培养并一起在醋酸双氧铀中染色。将它们脱水和包埋在Poly/Bed812环氧树脂中。厚的切片(Iym)被切片并被甲苯胺蓝染色。薄的切片(90nm)前位(en face)或横向切片，收集在300 μ m镍格上，用甲苯胺蓝染色，并用碳包被用于电子显微术。甲苯胺蓝染色的厚的切片在Leica DM 5500B显微镜上以100X成像，甲苯胺蓝染色的薄的切片以80kV在JEOLJEM-1200-EX电子显微镜上成像。在电子显微术之前对切片的MBP染色允许对待分析的区域有效靶向。
[0121]实施例7:结果
[0122]为了将外胚层干细胞(EpiSC)分化成神经外胚层谱系，EpiSC用下列处理:SB431542, 一种 Alk4、Alk5 和 Alk7 (激活素-nodal 信号传导)的抑制剂；dorsomorphin 或LDN-193189，Alk2、Alk3和Alk6 (BMP信号传导)的抑制剂；和头蛋白，一种BMP拮抗剂。作为响应，EpiSC快速下调多能基因如Pou5fl (也称为0ct3/4)的表达，上调神经外胚层基因如Pax6和NeurocM，经历形态 上的变化以形成径向组织的模式的神经外胚层(图2)。这种分化策略极其牢固并导致> 99%的EpiSC集落形成表达Pax6和Soxl 二者(Pax6+和Soxl+)的模式的神经外胚层。
[0123]为了测试是否诱导的模式的神经外胚层的行为如同非诱导的神经外胚层的行为，将诱导的EpiSC衍生的模式的神经外胚层以区域特异性方式模式化。在发育中的神经管中，特定的细胞前体区域通过来自周围组织的局部信号被建立。在发育中的脊髓中，响应于音猬因子(SHH)和其它来自脊索和底板的信号，OPC首先从神经管的腹侧脑室区出现。第四天，在头蛋白的持续存在下，EpiSC衍生的模式的神经外胚层用特定浓度的视黄酸和SHH处理I天，使它们以区域特异性方式模式化。这种处理导致OPC相关的转录因子01ig2和Nkx2.2的上调。在模式的神经外胚层中的这些因子的表达方式模仿在发育中的小鼠神经管的腹侧脑室区中的非重叠表达。另外，EpiSC衍生的模式的神经外胚层表达合适的后相关的(posterior-related)Hox基因，从而证实了它们的沿后尾椎轴(rostrocaudal axis)的脊髓身份。这些结果证明，引导发育信号的供应导致多能细胞在5天后适当特化和模式化成发育中的脊髓的区域特异性细胞。
[0124]在传代后，EpiSC衍生的模式的神经外胚层立刻产生β II1-微管蛋白+神经元和表达01ig2或Nkx2.2的推定的OPC 二者。这些结果重演了在发育中的脊髓的腹侧脑室区的体内细胞特化事件，所述事件已知产生神经元和OPC 二者。在这些培养物中，神经元并不能坚持超过培养的前三天。然而，推定的OPC发展了 01ig2和Nkx2.2的强的共表达，并且在FGF2JDGF和SHH存在下快速增殖，在5天后产生汇合的和几乎同质的细胞群体(从EpiSC开始分化的10天)。这些EpiSC衍生的OPC展现出了典型的双极性形态学并表达转录因子和细胞表面标志物如 OligU 01ig2、Nkx2.2、SoxlO、PDGFR α、EGFR 和 NG2 (Cspg4)，与它们的体内对应物一致(图3)。EpiSC衍生的OPC是同步的，并且达?90%的高纯度，共表达OPC表面标志物NG2和TOGFR α，如通过流式细胞术不经筛选或分选所确定的。另外地，这些EpiSC衍生的OPC能扩增至少八代，产生以前不能得到的数目的纯的OPC ( > IO12细胞)。为了证明这种方法的稳健性质，四种独立地衍生的EpiSC系被同时分化(包括来自不同性另O、品系和发育阶段的小鼠的系)。所有四种细胞系有效地分化成OPC而没有任何细胞系特异修饰。
[0125]为了确定EpiSC衍生的OPC的分化能力，在不存在FGF2和TOGF-AA 二者时，将EpiSC衍生的OPC用甲状腺激素(Τ3)处理，甲状腺激素(Τ3)已知在体内和体外在调节OPC转变成少突神经胶质细胞时是重要的。这些条件引起了 EpiSC衍生的OPC停止增殖并在2-4天的过程中专门分化成少突神经胶质细胞。未分化的OPC不表达少突神经胶质细胞表面标志物04，但到分化的第二天，大于64%的细胞是强的04+细胞，具有多突起形态(multiprocessed morphology),其余的细胞保持为01ig2+0PC(田胞从独立系的随机视野人工计数，η > 480个细胞)。到第三天，这些04+少突神经胶质细胞上调了真实的少突神经胶质细胞的经典的和定义性的标志物，如髓鞘碱性蛋白(Mb P )、蛋白脂质蛋白I (PIPI)、髓鞘相关的糖蛋白(Mag)和髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(Mog)(图4)。分化是高度特异的，因为GFAP+星形胶质细胞和β II1-微管蛋白+神经元都没有观察到。到第四天，压倒性多数的EpiSC衍生的OPC已经变成少突神经胶质细胞，虽然细胞死亡和罕见的增殖事件造成了没有大规模的时间推移谱系分析的对精确定量的挑战。为了测试这个实验方案的稳健性质，将衍生自四种独立的EpiSC系的OPC分化成少突神经胶质细胞，并且在分化的效率或时间安排方面没有明显的不同。由于测试的所有代具有高度关联的总的基因表达模式并以相似的时间安排和效率产生少突神`经胶质细胞，EpiSC衍生的OPC培养物的冷冻-融化和大量扩增没有改变它们分化的性质或能力。
[0126]为了检查EpiSC衍生的OPC的功能性性质，通过与神经元一起体外培养、和在器官型切片培养物中、以及在体内通过注射入先天髓鞘形成不良的小鼠脑内测量髓鞘化潜能。对于体外培养研究，EpiSC衍生的OPC以低密度铺板于小鼠皮层神经元培养物上并允许分化。6天之后，EpiSC衍生的OPC分化成MBP+细胞。大部分MBP+染色与β II1-微管蛋白+轴突对齐，这暗示着成髓鞘的能力。以前暴露于Τ3的EpiSC衍生的OPC没有产生MBP+片段，MBP+片段用β II1-微管蛋白+细胞追踪，暗示着成髓鞘潜能的时间限制。为了进一步评估EpiSC衍生的OPC的功能，使用易处理的器官型切片培养物测试来评估成髓鞘潜能。将EpiSC衍生的OPC注射进早期出生后的哆嗦者(Mbpshi/shi)幼崽(其缺乏Mbp和致密的髓鞘)的冠状的、前脑切片中，导致10天之后大量的Mbp+片段和致密的髓鞘。在哆嗦者大脑切片中，移植的EpiSC衍生的OPC特异性地分化成少突神经胶质细胞并且没有形成神经元。使用低和高传代数的细胞，在切片培养物中评价了 EpiSC衍生的OPC将哆嗦者宿主轴突髓鞘化的能力，没有明显的不同。
[0127]为了评估EpiSC-OPC在体内髓鞘化的能力，将2.5 X IO5细胞递送到新生的有免疫功能的哆嗦者(Mbpshi/shi)幼崽的未来的胼胝体中。在注射之后3-7星期分析小鼠大脑，并测试大脑中髓鞘化纤维的存在。在用EpiSC衍生的OPC移植的小鼠中发现了许多MBP+髓鞘片，但在未移植的对照中未发现。另外，EpiSC衍生的OPC表现为广泛地迁移进宿主中枢神经系统，由于在远离注射的部位如对侧纹状体观察到髓鞘化。在评估的各个时间点，用EpiSC衍生的OPC移植的任何小鼠中没有观察到畸胎瘤或异常的细胞生长。总而言之，这些结果证明，EpiSC衍生的OPC作用来产生致密的髓鞘并提供易处理的细胞来源以优化用于髓鞘修复的基于细胞的移植策略。
[0128]接下来，研究了外来因子调节EpiSC衍生的OPC的分化的能力。因为本发明允许从多能细胞可放大规模地产生0PC，所以本发明提供平台来筛选能影响OPC转变成少突神经胶质细胞的分子；尤其是，与一些疾患如多发性硬化症相关的分子，其中NG2+0PC存在于或接近于脱髓鞘病变，但通常不会重新将脱髓鞘轴突髓鞘再生。作为使用系统筛选化合物的简单的原理论证，将EpiSC衍生的OPC暴露于涉及以前牵涉在少突神经胶质细胞的发育或分化中的信号传导通路(Notch、Wnt-β-连环蛋白和BMP)的调节的三种不同的处理方案。在Notch配体Jaggedl (Jagl)存在下，用T3分化培养基处理EpiSC衍生的0PC2天没有对04+少突神经胶质细胞的速率或数量产生影响。使用相似的实验方案，通过使用GSK3 0抑制剂CHIR99021处理EpiSC衍生的OPC来测试GSK3 β的作用，GSK3 β是一种Wnt- β -连环蛋白信号传导的负调节剂。这种处理导致少突神经胶质细胞分化的浓度依赖性抑制，据此，细胞保持为01ig2+0PC，并且没有发展为04+少突神经胶质细胞(图5)。这些结果表明，由GSK3 β的抑制激活的规范的Wnt- β -连环蛋白信号传导，正向地调节OPC状态并且阻碍向少突神经胶质细胞的转变。
[0129]最后的处理包括将EpiSC衍生的OPC暴露于已知重新特化体外的OPC为替代的神经胶质细胞命运星形胶质细胞的信号传导级联。用ΒΜΡ4和白血病抑制因子(LIF)处理EpiSC衍生的OPC导致大多数的细胞经历形态的和基因表达的变化，包括GFAP的上调，表示重新特化成星形胶质细胞。这些 结果证明，可放大规模的基于小鼠多能干细胞的系统提供一种强有力的方式来筛选少突神经胶质细胞发育和髓鞘化的调节剂。
[0130]前面仅仅示例了本发明的原理。应领会的是，本领域技术人员将能够设计虽然没有在本文中明确地描述或显示，但体现了本发明的原理并被包括在本发明的精神和范围中的各种布置。而且，本文中列出的所有的实施例和条件性语言主要预期帮助读者理解本发明的原理和由发明人贡献的概念以进一步推动本领域，应被诠释为不限于这些具体的列出的实施例和条件。而且，本文中提及本发明的原理、方面和实施方案和其具体的例子的所有陈述预期包括其结构和功能上的同等物。另外地，预期这些同等物包括当前已知的同等物和未来开发的同等物，即，完成相同功能的开发的任何元素，而不论结构。因此，本发明的范围不预期被限制于在本文中所示的和描述的示例性方面。而是，本发明的范围和精神由所附的权利要求书体现。在下面的权利要求书中，除非使用术语“手段”，否则其中提及的性质或元素不应被解释为根据35U.S.C.§ 112,|6的手段加功能(means-plus-function)的限制。
【权利要求】
1.一种产生哺乳动物神经外胚层的方法，所述方法包括:提供多能细胞；以及通过在激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂和骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂存在下培养所述多能细胞来诱导所述多能细胞发育成神经外胚层。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂是SB431542。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂选自dorsomorphin、LDN-193189 或头蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞是外胚层干细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中从所述多能细胞的培养得到的细胞的至少75%或更多是神经外胚层细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中从所述多能细胞的培养得到的细胞的至少90%或更多是神经外胚层细胞。
7.—种产生哺乳动物模式的神经外胚层的方法，所述方法包括:提供多能细胞；通过在激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂和骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂存在下培养所述多能细胞来诱导所述多能细胞发育成神经外胚层；以及通过在音猬因子、视黄酸和头蛋白中的一种或多种存在下培养所述神经外胚层来诱导模式的神经外胚层的发育。
8.—种产生哺乳动物少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括:提供多能细胞；通过在激活素-nodal通路的一 种或多种抑制剂和骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂存在下培养所述多能细胞来诱导所述多能细胞发育成神经外胚层；通过在音猬因子、视黄酸和头蛋白中的一种或多种的存在下培养所述神经外胚层来诱导模式的神经外胚层的发育；以及通过在成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子中的一种或多种存在下培养所述模式的神经外胚层细胞来诱导少突神经胶质祖细胞的发育。
9.如权利要求8所述的方法，其中成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子中的两种或更多种用于所述模式的神经外胚层细胞的培养。
10.如权利要求9所述的方法，其中成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子用于所述模式的神经外胚层细胞的培养。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述成纤维细胞生长因子是FGF2，所述血小板衍生生长因子是I3DGF-AA。
12.如权利要求8所述的方法，其中视黄酸、音猬因子和头蛋白中的两种用于所述神经外胚层细胞的培养。
13.如权利要求8所述的方法，其中视黄酸、音猬因子和头蛋白用于所述神经外胚层细胞的培养。
14.如权利要求8所述的方法，其中从所述模式的神经外胚层细胞的培养得到的细胞的至少75%或更多是少突神经胶质祖细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其中从所述模式的神经外胚层细胞的培养得到的细胞的至少90%或更多是少突神经胶质祖细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中从所述模式的神经外胚层细胞的培养得到的细胞的至少95%或更多是少突神经胶质祖细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中从所述模式的神经外胚层细胞的培养得到的至少99 %或更多的细胞是少突神经胶质祖细胞。
18.如权利要求8所述的方法，其中所述激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂是SB431542。
19.如权利要求8所述的方法，其中所述骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂选自 dorsomorphin、LDN-193189 或头蛋白。
20.一种组合物，所述组合物含有根据权利要求8产生的少突神经胶质祖细胞。
21.如权利要求20所述的组合物,还含有神经元或神经元前体。
22.—种研究工具，所述研究工具含有根据权利要求8产生的少突神经胶质祖细胞。
23.—种诊断工具，所述诊断工具含有根据权利要求8产生的少突神经胶质祖细胞。
24.一种在受治疗者中治疗CNS的医学病症的方法，所述方法包括向受治疗者施用治疗有效量的根据权利要求8产生的少突神经胶质祖细胞。
25.—种在细胞培养物中维持权利要求8的少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括:在Wnt-β-连环蛋白信号传导活化剂存在下培养所述少突神经胶质细胞。
26.—种在细胞培养物中维持权利要求8的少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括:在成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)和音猬因子(SHH)存在下培养所述少突神经胶质细胞。`
27.如权利要求26所述的方法，其中培养物中的细胞的至少95%是少突神经胶质组细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其中培养物中的细胞的至少99%是少突神经胶质组细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述Wnt-β -连环蛋白信号传导活化剂是GSK3 β抑制剂。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述GSK30抑制剂是CHIR99021。
31.一种组合物,含有根据权利要求25维持的少突神经胶质祖细胞。
32.如权利要求31所述的组合物，还含有神经元或神经元前体。
33.一种研究工具，所述研究工具含有根据权利要求25维持的少突神经胶质祖细胞。
34.一种诊断工具，所述诊断工具含有根据权利要求25维持的少突神经胶质祖细胞。
35.一种在受治疗者中治疗CNS的医学病症的方法，所述方法包括向受治疗者施用治疗有效量的根据权利要求25维持的少突神经胶质祖细胞。
36.一种从根据权利要求25维持的少突神经胶质祖细胞产生少突神经胶质细胞的方法，所述方法包括在FGF和TOGF不存在和Τ3存在下培养所述少突神经胶质祖细胞。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述少突神经胶质细胞分化活化剂是甲状腺激素。
38.一种从根据权利要求25维持的少突神经胶质祖细胞产生星形胶质细胞的方法，所述方法包括在骨形态发生蛋白和JAK/STAT通路活化剂存在下培养所述维持的少突神经胶质祖细胞。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白4，所述JAK/STAT通路抑制剂是白血病抑制因子。
40.一种产生哺乳动物少突神经胶质祖细胞和在培养物中维持所述哺乳动物少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括:提供多能细胞；通过在激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂和骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂存在下培养所述多能细胞以诱导所述多能细胞发育成神经外胚层；通过在音猬因子、视黄酸和头蛋白的存在下培养所述神经外胚层以诱导模式的神经外胚层的发育；通过在成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子的存在下培养所述模式的神经外胚层细胞来诱导少突神经胶质祖细胞的发育；以及在fct-β-连环蛋白信号传导活化剂的存在下维持所述少突神经胶质祖细胞并培养所述少突神经胶质细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述激活素-nodal通路的一种或多种抑制剂是SB431542，所述骨形态发生蛋白通路的一种或多种抑制剂选自dorsomorphin、LDN-193189或头蛋白。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述成纤维细胞生长因子是FGF2，所述血小板衍生生长因子是I3DGF-AA。
43.如权利要求40所述的方法，其中培养物中的细胞的至少95%是少突神经胶质祖细胞。
44.一种从神经外胚层产生模式的神经外胚层的方法，所述方法包括在音猬因子、视黄酸和头蛋白存在下培养所述神经外胚层。
45.一种从模式的神经外胚层产生少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括在成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和音猬因子存在下培养所述模式的神经外胚层细胞。
46.一种在细胞培养物中维持少突神经胶质祖细胞的方法，所述方法包括:在Wnt-β -连环蛋白信号传导活化剂存在下培养所述少突神经胶质细胞。
47.一种从少突神经胶质祖细胞产生星形胶质细胞的方法，所述方法包括在骨形态发生蛋白和JAK/STAT通路活化剂存在下培养所维持的少突神经胶质祖细胞。
48.一种从维持的少突神经胶质祖细胞产生少突神经胶质细胞的方法，所述方法包括在FGF和TOGF不存在和T3存在下培养所述少突神经胶质祖细胞。
【文档编号】C12N1/38GK103429734SQ201180062398
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年10月25日 优先权日:2010年10月26日
【发明者】保罗·J·特萨, 罗伯特·H·米勒, 法迪·J·纳杰姆 申请人:卡斯西部储备大学