一种机械法提取鸡胚成肌细胞的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物工程技术领域的细胞提取方法，具体涉及的是一种鸡胚成肌细胞的提取方法，包括如下步骤：第一步，鸡胚灭菌，取胸大肌放入加D?Hank’s的培养皿中；第二步，修剪肌肉；第三步，用漩涡振荡器振荡悬浮胸大肌；第四步，过滤、离心；第五步，细胞铺板，差速贴壁；第六步，消化获得成肌细胞；第七步，计数、种板。本发明鸡胚成肌细胞提取方法，即用机械振荡法提取鸡胚成肌细胞的技术，保证所提取成肌细胞的纯度、数量、纯度及活力均较其他方法高，为进一步开展家禽肌肉发育调控机理实验打下基础。
【专利说明】
一种机械法提取鸡胚成肌细胞
技术领域
[0001]本发明涉及一种生物工程技术领域的细胞提取方法，具体的说，涉及的是一种鸡胚成肌细胞的提取方法。
【背景技术】
[0002]肌肉组织中含有不同的细胞亚群，包括成肌细胞(Vanden et al.，2004)、肌卫星细胞(Mauro et al., 1961)、多能性前体细胞(Jiang et al., 2002)、多潜能干细胞(Caseet al., 2005)等。肌源干细胞目前已被广泛证明具有横向分化潜能，能够分化为3个胚层的组织细胞类型，包括(脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、内皮细胞和神经胶质细胞及血细胞)(Sun et al., 2004；Hwang et al., 2004；Farace et al., 2004)。成肌细胞是主要的肌干细胞，是肌再生修复的主要种子细胞，起源于胚胎中胚层的干细胞。成肌细胞包括胚胎中的成肌细胞和成熟肌肉组织中的卫星细胞，在成熟肌肉组织中，这些卫星细胞位于肌膜与肌纤维基底膜之间。在肌肉胚胎发育过程中先由间充质细胞分化为成肌细胞，然后成肌细胞分裂、融合成多核肌纤维，从而形成肌小管(Ehrhardt et al., 2007)。成肌细胞具有与宿主肌肉细胞融合的能力，这也是其移植后的主要归宿，可以在肌纤维中长期存活，有利于目的基因稳定、持续地表达(Ehrhardt et al.，2007)。成肌细胞具有自我更新和促进肌纤维再生的能力，是体外研究肌肉发育调控机理的理想载体。1961年至今，肌干细胞的研究已近半个世纪(Mauro et al., 1961 )，但是成肌细胞的分离与鉴定的方法仍然具有不确定性。
[0003]由于相关肌源干细胞的特异标志还不清楚，所以目前主要是利用细胞的物理特性来进行纯化。目前常用的分离方法有组织块贴壁、双酶消化、差速贴壁、percoll分离等(李俊玲等，2007) ο由于分离方法与间充质细胞分离方法类似，所以分离得到的细胞系中容易掺杂间充质细胞和脂肪细胞等(焦泽华等，2011)，且耗时长，细胞得率和纯度较低。
[0004]深入了解成肌细胞体外的分化过程，能相应地调控对应的体内肌肉发育形成过程。有关家禽成肌细胞的体外培养及生物学特性方面的研究国内少有报道。因此，建立有效的分离、纯化和培养方法，是成肌细胞应用的前提条件。因此如何将成肌细胞高效分离，纯度高，且价格低廉，易于推广，对更深入研究家禽种质资源特性与探究肌肉发育调控机理有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鸡胚成肌细胞提取方法，即用机械振荡法提取鸡胚成肌细胞的技术，保证所提取成肌细胞的纯度、数量、纯度及活力均较其他方法高，为进一步开展家禽肌肉发育调控机理实验打下基础。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种鸡胚成肌细胞提取方法，包括如下步骤:
第一步，鸡胚灭菌，取胸肌。
[0007]选取12胚龄发育良好的鸡胚，用75%酒精喷洒鸡胚蛋壳，用镊子钝头轻轻敲破气室后，再换用弯头小镊子轻轻将气室处蛋壳捏走，掀走白膜，用弯头小镊子将鸡胚取出放入超净台(放在紫外杀菌的滤纸上)，换用新的弯头镊子用钝面将鸡腹部皮肤抹去，将两侧胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌，放入已加D-Hank’s的培养皿中。
[0008]第二步，修剪肌肉
把剪下来的胸大肌用D-Hank’s洗三遍，然后把D-Hank’s吸掉，用一个镊子按住肌肉，另一个弯头镊子撕拉肌肉，使其破碎成糜散状，再用弯头剪刀剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml细胞培养液，将剪碎的胸大肌和细胞培养液一起转移到50ml离心管中，加细胞培养液至10ml。
[0009]第三步，用漩涡振荡器振荡悬浮胸大肌
用漩涡振荡器(功率12W，振荡频率>2600次/分钟)振荡悬浮胸大肌，振荡时间为I分钟(期间振荡1-2秒停止I秒)，静置3分钟后，用移液器收集上清细胞培养液(如此振荡悬浮4至5次)。
[0010]第四步，过滤、离心
选用100目、400目和600目滤筛放置于直径为1cm的培养皿上进行过滤，将悬液倒入100目滤筛，去除肉糜和杂质，之后将过滤后的细胞悬液再400目和600目逐级过滤，将过滤后的细胞悬液加入新离心管中，将过滤后的细胞悬液加入新离心管中，1200转离心7min，用移液器吸掉上清，加入D-Hanks吹打清洗，重悬后再1000转离心4min，吸掉上清，下层沉淀即为细胞。
[0011]第五步，细胞铺板，差速贴壁
在所得细胞的离心管中加入5ml细胞培养液，将细胞吹打重悬，吹打时动作要轻柔，以免损伤细胞，将细胞悬液移入直径为1cm的细胞培养皿中，加细胞培养液至1ml后放入培养箱正常培养。40分钟后将细胞培养液移入新的细胞培养皿中，如此差速贴壁2次后，隔夜培养。
[0012]第六步，消化获得成肌细胞
第二天早上，将培养皿中的上层细胞及细胞培养液吸掉，在培养皿表面加入2ml胰酶，I分钟后细胞基本脱落，加入5ml细胞培养液终止消化，将细胞重悬后加入离心管中，1000转离心4分钟，用移液器吸掉上清，下层沉淀即为所需成肌细胞。
[0013]第七步，计数、种板
在离心管中加入2ml细胞培养液，将成肌细胞吹打重悬，取1yL细胞悬液加入200ulPCR管中，再加入10此台盼蓝细胞活性染料，混匀后滴入细胞计数板计数。根据计数结果，将细胞悬液按照15?16的密度种板，之后加入适量细胞培养液(六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL)轻轻吹打均匀，注意种板一定要均匀。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点是:利用漩涡振荡器振荡鸡胚胸肌，在较短的时间内迅速释放大量的成肌细胞，且在短时间内的不连续振荡不会对细胞造成损伤，成活率较高，达到95%以上，另外结合了差速贴壁法，使细胞的纯度进一步提高，保证了成肌细胞后续试验的顺利进行。另外，此方法免去了percoll分离法和双酶消化法的繁琐步骤及时间，且省去percoll和酶的费用，价格低廉。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例做详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
[0016]实施例中所用的D-Hank’S为不含|丐离子和镁离子的平衡盐溶液，购自BeijingSolarb1 Science & Technology C0., Ltd ;DMEM为含2.5mM L-glutamine、15mM HEPESBuffer、0.IuM sterile Filtered，购自HyClone;膜酶为0.25% Trypsin-EDTA，双抗含量为10000 Units/ml Penicillin、10000ug/ml streptomycin，胎牛血清均购自gibco。
[0017]实施例中所用的细胞培养液配置如下(以50ml量为例):
胎牛血清:1ml
DMEM:40ml
双抗:5ul
实施例:
取6个发育良好的12胚龄鸡胚，75%酒精喷洒鸡胚蛋壳，用镊子钝头轻轻敲破气室后，再换用弯头小镊子轻轻将气室处蛋壳捏走，掀走白膜，用弯头小镊子将鸡胚取出放入超净台(放在紫外杀菌的滤纸上)，用弯头镊子的钝面将鸡腹部皮肤抹去，将两侧胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌，放入已加D-Hank’s的培养皿中。把剪下来的胸大肌用D-Hank’s洗三遍，然后把D-Hank’s吸掉，用一个镊子按住肌肉，另一个弯头镊子撕拉肌肉，使其破碎成糜散状，再用剪刀剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml细胞培养液，将剪碎的胸大肌和细胞培养液一起转移到50ml离心管中，加细胞培养液至10ml。
[0018]用漩涡振荡器(功率12W，振荡频率>2600次/分钟)振荡悬浮胸大肌，振荡时间为I分钟(期间振荡1-2秒停止I秒)，悬浮液静置3分钟后，用移液器收集上清细胞培养液(如此振荡悬浮4至5次)。
[0019]选用100目、400目和600目滤筛放置于直径为1cm的培养皿上进行过滤，将悬液倒入100目滤筛，去除肉糜和杂质，之后将过滤后的细胞悬液再400目和600目逐级过滤，将过滤后的细胞悬液加入新离心管中，1200转离心7min，用移液器吸掉上清，加入2ml D-Hank's吹打清洗，重悬后1000转离心4min，然后吸掉上清，下层沉淀即为细胞。
[0020]在所得细胞的离心管中加入5ml细胞培养液，将细胞吹打重悬，吹打时动作要轻柔，以免损伤细胞，将细胞悬液移入直径为1cm的细胞培养皿中，加细胞培养液至1ml后放入培养箱正常培养。40分钟后将细胞培养液移入新的细胞培养皿中，如此差速贴壁2次后，隔夜培养。
[0021]第二天早上，将培养皿中的上层细胞及细胞培养液吸掉，在培养皿表面加入2ml胰酶，I分钟后细胞基本脱落，加入5ml细胞培养液终止消化，将细胞重悬后加入离心管中，1000转离心4分钟，用移液器吸掉上清，下层沉淀即为所需成肌细胞。
[0022]在离心管中加入2ml细胞培养液，将细胞吹打重悬，取1yL细胞悬液加入200ulPCR管中，再加入10 yL台盼蓝细胞活性染料，混匀。将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上；将混合液吸出少许，滴在盖片边缘，使细胞悬液充满盖片和计数板之间(中间不能有气泡)，在显微镜下观察，用细胞计数器计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。之后按照:细胞数/ml=4大格细胞总数/4 X 10000。再取一滴细胞悬液于载玻片上，用甲醛固定5min，瑞士染液染色，镜检(10 X 40)。计算得:单位体积细胞数为8.746 X 107±0.047/ml，成活率为98.14%±0.21。
[0023]根据计数结果，将细胞悬液按照15-1O6的密度种板，之后加入适量细胞培养液(六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL)轻轻吹打均匀，注意种板一定要均匀。
[0024]本发明在操作时一定要注意在漩涡振荡器上振荡时不可连续I分钟振荡，要振荡I，2秒后间歇I秒再继续振荡，这样可以保证细胞的活性。整个振荡过程重复4至5次可以保证细胞的得率较高，过滤的次数和滤筛目数较高时可以得到较纯的原代细胞。因此，用本方法获得的成肌细胞活性、成活率和纯度都保证了后续实验的顺利进行，减少了实验误差。
【主权项】
1.一种鸡胚成肌细胞提取方法，其特征是，包括如下步骤: 第一步，鸡胚灭菌，取胸大肌放入加D-Hank，s的培养皿中； 第二步，修剪肌肉 把胸大肌用0-他111^洗三遍，然后把0-他111^吸掉，剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml细胞培养液，将剪碎的胸大肌和细胞培养液一起转移到50ml离心管中，加细胞培养液至1ml ； 第三步，用漩涡振荡器振荡悬浮胸大肌 用漩涡振荡器振荡悬浮胸大肌，振荡时间为I分钟，静置3分钟后，用移液器收集上清细胞培养液，振荡悬浮次数为4-5次； 第四步，过滤、离心 选用100目、400目和600目的滤筛放置于培养皿上进行过滤，将步骤三得到的悬液倒入100目滤筛，去除肉糜和杂质，之后将过滤后的细胞悬液再400目和600目逐级过滤，将过滤后的细胞悬液加入新离心管中，1200转离心7min，用移液器吸掉上清，加入D-Hanks吹打清洗，重悬后再1000转离心4min，吸掉上清，下层沉淀即为细胞； 第五步，细胞铺板，差速贴壁 在步骤四所得细胞的离心管中加入5ml细胞培养液，将细胞吹打重悬，将细胞悬液移入直径为1cm的细胞培养皿中，加细胞培养液至1ml后放入培养箱正常培养;40分钟后将细胞培养液及没有贴壁的细胞移入新的细胞培养皿中，如此差速贴壁2次后，隔夜培养；第六步，消化获得成肌细胞 第二天早上，将培养皿中的上层细胞及细胞培养液吸掉，在培养皿表面加入2ml胰酶，I分钟后细胞基本脱落，加入5ml细胞培养液终止消化，将细胞重悬后加入离心管中，1000转离心4分钟，用移液器吸掉上清，下层沉淀即为所需成肌细胞； 第七步，计数、种板 在步骤六得到的含有成肌细胞的离心管中加入2ml细胞培养液，将成肌细胞吹打重悬，取1yL细胞悬液加入200ul PCR管中，再加入10 yL台盼蓝细胞活性染料，混匀后滴入细胞计数板计数;根据计数结果，将细胞悬液种板，之后加入细胞培养液。2.根据权利要求1所述的鸡胚成肌细胞提取方法，其特征是，所述鸡胚灭菌，取胸大肌的具体操作方法为:选取12胚龄发育良好的鸡胚，用75%酒精喷洒鸡胚蛋壳，用镊子钝头轻轻敲破气室后，再换用弯头小镊子轻轻将气室处蛋壳捏走，掀走白膜，用弯头小镊子将鸡胚取出放入超净台，用弯头镊子的钝面将鸡腹部皮肤抹去，将两侧胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌。3.根据权利要求1、2所述的鸡胚成肌细胞提取方法，其特征是，所述漩涡振荡器功率12W，振荡频率>2600次/分钟，漩涡振荡器振荡期间振荡1-2秒停止I秒。4.根据权利要求3所述的鸡胚成肌细胞提取方法，其特征是，所述吹打重悬细胞时吹打时动作要轻柔，以免损伤细胞。5.根据权利要求4所述的鸡胚成肌细胞提取方法，其特征是，所述步骤七中的种板按照15?16的密度进行，细胞培养液的加入量是六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL。
【文档编号】C12N5/077GK105886458SQ201610396066
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】赵振华, 李春苗, 黄华云, 黎寿丰, 王钱保, 梁忠, 刘帆, 刘一帆, 赵东伟, 卢建, 李新
【申请人】江苏省家禽科学研究所