腮腺炎病毒的重组抗原及其在疫苗中的用途的制作方法

专利名称：腮腺炎病毒的重组抗原及其在疫苗中的用途的制作方法
腮腺炎病毒属于副粘病毒亚纲(subclass paramyxovirus)中的副粘病毒(paramyxoviridae)。它是引起包括腮腺炎的接触传染性婴儿病的病原体。在感染后的潜伏期间，病毒在呼吸道上皮复制再扩散到腮腺的分泌管道。随后其它腺体也可能被感染。已报道了大量脑膜炎的病例。在与感染相关的并发症中，脑炎较为严重，死亡率约为1％；聋症的病例也有报道。
可以使用抗腮腺炎病毒的疫苗它是由培养被感染的鸡胚细胞而产生的减毒活病毒制成。在接种过的个体中此疫苗会导致血清转化，它在超过95％的血清阴性个体中可产生抗感染保护。因而此疫苗可显著降低并发症的频率。
然而，在一些病例中，由于病毒感染效果保持为亚临床状态以致难以被检测到。儿童和老人最有可能由腮腺炎病毒感染发展为并发症。由于与使用减毒活疫苗相关的固有危险性，如已接种的个体自然病原体再次感染从而加重病情，因此需要改善疫苗的安全性，尤其是对于有被感染危险的群体而言。
本发明通过提供在宿主细胞，尤其是真核细胞中产生重组腮腺炎病毒蛋白质，尤其是F、HN和NP蛋白质以及衍生于它们的融合蛋白质的系统来提出此问题。本发明也涉及构建所说蛋白质的方法，其中所使用的中间体以及可得自此中间体的重组蛋白质。在本发明特别的实施方案中，腮腺炎病毒NP蛋白质也可在细菌中表达。本发明的重组蛋白质对于开发防治腮腺炎病毒感染的亚单位疫苗有潜在的用途。
腮腺炎病毒的融合蛋白质F含有538个氨基酸残基；氨基酸1至26与信号肽相对应，残基483至512与膜锚着区域相对应。此分子上存在有7个糖基化的潜在位点。F蛋白质以65-74KDa前体(F0)的形式合成，又经过蛋白酶水解成熟以产生由二硫键相连接的亚单位F1(58-61FDa)和F2(10-16KDa)。蛋白质F参与了病毒感染过程中的细胞融合，它具有溶血素活性，对于病毒穿透细胞起到一定作用。然而它不携有依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)，而在另一种腮腺炎病毒的糖蛋白HN中却可观察到ADCC(见下文)。
蛋白质HN(分子量为74-80KDa)携有血凝素和神经氨酸苷酶活性，它们参与病毒对细胞的吸附以及对宿主细胞膜的破坏。蛋白质HN(‘吸附蛋白质’或血凝素-神经氨酸苷酶)产生中和抗体，可能对ADCC的产生很重要。蛋白质HN由582个氨基酸组成；它携有一个N-末端锚着区域(残基33至52)以及9个潜在的糖基化位点。
核衣壳蛋白NP与病毒RNA相联并参与其转录过程。以流感病毒类推，腮腺炎病毒的NP蛋白对细胞免疫的产生可能是重要的。NP蛋白由553个氨基酸组成，其分子量为72KDa并且是磷酸化的。
本发明提供了重组DNA，它编码选自下组的腮腺炎病毒抗原(a)具有信号肽(s)和膜锚着区域(a)的全长融合蛋白(F)(本文称作Fs+a+)；全长吸附蛋白质或血凝素-神经氨酸苷酶(HN)；全长核衣壳蛋白质(NP)；
(b)缺乏膜锚着区域的截短融合蛋白(本文称作Fs+a-)；和(c)由F、HN和/或NP蛋白或其部分相融合而得到的杂合蛋白。
本发明特别的实施方案中，编码杂合蛋白的DNA编码(i)与融合蛋白信号区域相融合的缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白；(本文称作s+FHNa-)；或(ii)本文称作s+FHNa-xFa-的杂合蛋白；或(iii)与缺乏5′膜区域的吸附蛋白相融合的缺乏3′膜锚着区域的融合蛋白(本文称作Fs+a-xHNa-)。
根据本发明的重组DNA优选为一载体，最好为一表达载体，它应适于转染或转化适当宿主以致可得到大量由本发明DNA编码的蛋白质。
根据本发明的重组载体一方面可以是牛痘苗转移载体，例如下文所述的衍生于pULB5212的载体。
此类特殊载体在本文中被称作pNIV3205，pNIV3208、pNIV3213和pNIV3232。
根据本发明的重组载体另一方面可以是适于转染哺乳动物细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的载体。
此类载体最好为衍生于谷氨酰胺合成酶载体，例如下文所述的已知为pEE14的载体。根据本发明的特殊载体是pEE14s+FHNa-。
根据本发明的重组载体另一方面可以是适于转化细菌细胞(如大肠杆菌)的载体。
例如，适当的此类载体可衍生于熟知的载体pUC19。
本发明另一方面提供了被根据本发明的载体转化或转染的宿主。宿主适于从牛痘苗病毒；哺乳动物细胞或细菌细胞中选择。
本发明还提供了制备由根据本发明的DNA编码的重组蛋白质的方法，包括(a)在如上所述的适当重组宿主中表达所说DNA；和(b)如下文所述用标准技术分离产生的蛋白质。
由本发明方法制得的某些蛋白质是新的，因此这些蛋白质形成了本发明的另一方面，特殊的蛋白质包括缺乏膜锚着区域的截短融合蛋白(本文称作Fs+a-)；由F、HN和/或NP蛋白或其部分相融合得到的杂合蛋白，尤其是(i)与融合蛋白的信号区域相融合的缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白(本文称作s+FHNa-)；(ii)本文称作s+FHNa-xFa-的杂合蛋白；(iii)与缺乏5′膜区域的吸附蛋白相融合的缺乏3′膜锚着区域的融合蛋白(本文称作Fs+a-xHNa-)。
由本发明方法得到的蛋白质当与适当载体相混合时具有作为疫苗的潜能。
因此本发明的另一方面还提供了抗腮腺炎病毒感染的疫苗组合物，它含有根据本发明或根据本发明方法制备的免疫保护量的蛋白质以及药用可接受的载体。
在这种疫苗组合物中蛋白质最好是F或HN蛋白。
“免疫保护”一词指的是对腮腺炎病毒的攻击能引起免疫应答的必需的剂量，从而防止或减缓疾病，并可阻止或延缓疾病的传染。
疫苗的制备通常描述于New Trends and Developments in va-ccines，Voller et al(eds)，University park Press，Baltim-ore，Maryland，1978。
每种疫苗制剂中存在的本发明蛋白质的量依据在典型的疫苗中可引起免疫保护应答而不带有显著有害副作用的原则来选择。
此种用量依据所使用的特异性免疫原以及疫苗是否有佐剂而变化。通常期望每剂药含有1-1000μg蛋白质，优选为1-200μg。通过观察受治疗者的抗体效价及其它反应的标准实验可确定特定疫苗的最适量。最初接种后约4周，受治疗者最好接受一次加强免疫，随后只要被感染的危险仍存在，每隔6个月还需重复加强免疫。
本发明另一方面还提供了防治人类腮腺炎病毒感染的方法，此方法包括给有此需要的受治疗者施用免疫有效量的本发明蛋白质或由本发明方法制备的蛋白质。本发明还提供了使用根据本发明的蛋白质或根据本发明方法制备的蛋白质以制备疫苗组合物来防治受治疗人的腮腺炎病毒感染。
以下实施例和附图(解释见下文)阐明了本发明。实施例实施例1载体构建(A)用于转移进牛痘苗病毒(1)融会蛋白质Fs+a+从质粒pMF1，也即编码F蛋白质C-末端部分的900bp cDNA克隆(得自Dr.E.Norrby，Karolinska Institute，Stockholm，Sweden，描述于Elango et al，1989，J.Gen.Virology 70，8001-8007)出发，我们重新构建了编码完整Fs+a+蛋白的cDNA，即它既含有信号肽也含有膜锚着区域。为了这一目的，使用对应于腮腺炎病毒FmRNA的碱基1至20并具有序列(5′-AAG CCT AGA AGG ATA TCC TA-3′)的寡脱氧核苷酸(pO82)作为引物，将从腮腺炎病毒中提取的病毒基因组RNA复制成互补的单链DNA。然后使用引物pO82和pstFM1或pstFM2和pF1013通过聚合酶链式反应来扩增单链cDNA。扩增后第一套引物产生了对应于腮腺炎病毒FmRNA的碱基1至769的双链cDNA，第二套引物产生了覆盖碱基748至1035的cDNA片段。
引物pstFM1，pstFM2和pD1013的序列如下pstDM1 5′CCA CTG CAG GTG TCA TAC TTC C 3′PstI769 748pstFM2 5′GGA AGT ATG ACA CCT GCA GTC G 3′PstI748 769pF1013 5′ACA ATT CTT AGC TGG ATA GCG CC 3′1035 1013然后将扩增后的cDNA片段分别克隆进质粒pUC19的HindII-PstI位点并使用双脱氧核苷酸法测序(Sanger et al，1977，P.N.A.S.74，5463-5467)。两个DNA片段通过它们共有的PstI位点连接在一起并克隆进质粒pUC19的EcoRI位点；因而产生了中间构建体pNIV3204。用EcoRI和HaeII酶裂解质粒pNIV3204以重新得到FcDNA的5′末端。用PstI和HaeII消化质粒pMF1可重新得到FcDNA的3′末端。通过它们共有的HaeII限制性位点连接5′和3′末端可重建完整的FcDNA，将之引入克隆载体pUC19的EcoRI-PstI位点，产生质粒pNIV3214(

图1A)。从中通过用酶SmaI和AhaIII裂解可回收编码Fs+a+蛋白的cDNA分子(1701bp)，将之引入衍生于标准牛痘苗载体pSC11的牛痘苗转移载体pULB5213的SmaI位点(Chakrabati et al.，1985，Molecul-ar and Cellular Biology 5，3403-3409)。所得质粒pNIV3205示于图1B。
(2)吸附蛋白HN从质粒pMH1，编码HN蛋白C-末端部分的1000 bp cDNA克隆出发(得自Dr.E.Norrby，Karolinska Institute，Stockholm，Swe-den，由Kovamees et al，1989，Virus Research 1287-96公开)，我们重新构建了相应于腮腺炎病毒完整HN蛋白的cDNA克隆。为了这一目的，按上述F蛋白所用方法。简单地说，先用po83寡脱氧核苷酸作为引物(5′AAG CCA GAA CAG ACT TAG GAT 3′)，将腮腺炎病毒RNA复制成单链cDNA然后通过用两套引物，用PCR扩增此cDNA以产生相应于HNmRNA碱基79至629的第一个双链cDNA片段(引物为pHN-13和EcoHNM1)以及跨越碱基603至1005的第二个双链cDNA片段(引物为EcoHNM2和pH982)。
这些引物的序列如下7987pHN-13 5′ GAC CCG GG CCACC ATG GAG CCC 3′SmaI Kozak MetI起始共有序列EcoHNMI 5′ GAT GGA ATT CTT GTG CAA CCA TTG 3′EcoRI626 603
EcoHNM2 5′CAA TGG TTG CAC AAG AAT TCC ATC 3′EcQRI603 626pH9825′CCC CAC TCC TGG CAC CAA AGT AGC 3′1005982将扩增后的cDNA片段克隆进质粒pUC19的HindII-EcoRI位点，通过Sanger法测序(文献同上)，然后通过它们的EcoRI位点连接进pUC19克隆载体。所得中间构建体pNIV3207因而携有HN编码序列的5′末端，通过用HincII和BanI消化可将之从pNIV3207中切除。通过用BanI和HindIII消化质粒pMH1可重新得到HNcDNA的3′末端。通过它们共有的BanI位点连接5′和3′部分可重建完整的HNcDNA，并将之引入质粒pUC19的HincII和HindII位点，从而产生质粒pNIV3215(图2A)。通过用酶HindIII和SmaI裂解可回收编码完整HN蛋白的cDNA分子(1779bp)，将之平头引入经SmaI消化的牛痘苗转移载体pULB5213(文献同上)。所得质粒pNIV3208示于图2B。
(3)核衣壳蛋白Np从两个部分cDNA克隆pMN1和pMN2(得自Dr.E.Norrby，Karoli-nska Institute，Stockholm，Sweden，由Elango，1989，VirusResearch 12，77-86公开)装配编码完整的腮腺炎病毒NP蛋白的cDNA。
质粒pMN1携有缺乏Np cDNA 5′末端的1700bp的插入片段；pMN2具有未包含该分子3′末端的1700bp的cDNA插入片段。
用PstI消化pMN1以回收1100bp的片段，将其亚克隆进质粒载体pUC19的PstI位点。用Asp718I和EcoRV消化此中间构建体以回收编码NP蛋白248C-末端氨基酸并携有终止密码子的片段。用HgiAI和PvuII消化pMN2以回收跨越氨基酸残基6至458的1361bp片段。制备合成的双链核苷酸(Mum1/Mum2)以重新构建ATG起始密码子(Met1)以及编码NP蛋白氨基酸2至5的序列(图3A)。此合成片段两端有BamHI位点(5′)和HgiAI位点(3′)；它也含有最适于转译起始的KOZ-AK共有序列(Kozak，1984，Nature 308，241-246)。装配合成的衔接子和从pMN2中回收的1361bp DNA片段并克隆进质粒载体pUC19。用Asp718I和EcoRV消化此中间构建体以消除466bp的片段，并用衍生于pMN1、编码248 C-末端氨基酸的Asp718I和EcoRV片段置换。因而产生了质粒pNIV3216，它含有由载体pUC19携带的完整NP蛋白的1699 bp编码组件(图3B)。然后用BamHI和BclI消化质粒pNIV3216以切除平头插入牛痘苗转移质粒pULB5213 SmaI位点的编码盒(1682bp)(文献同上)，以产生最终构建体pNIV3213(图3C)。(4)缺乏膜锚着区域的融合蛋白Fs+a+用NSiI和SphI消化质粒pNIV3214(见上文)、即编码全长F蛋白的cDNA克隆。除去编码F蛋白的80C-末端氨基酸并携有膜锚着区域(残基483-512)和终止密码子的250bp的NSiI-SphI片段。制备合成的双链核苷酸(Fa-mu1/Fa-mu2)，以重新构建编码氨基酸残基459至462和终止密码子的序列(图4A)。此合成片段两端具有NsiI位点(5′)和SphI位点(3′)。将合成的衔接子克隆进pNIV3214的NsiI和SphI位点。将所得质粒，编码紧随有终止密码子的氨基酸残基1至462的pNIV3220，克隆于pUC19载体中。用BsphI和Asp718I消化质粒pNIV3220以产生KOZAK共有序列(文献同上)；用Klenow聚合酶补平突出的末端然后连接。所产生的质粒pNIV3221含有紧随有终止密码子并在起始密码子周围有KOZAK共有序列的F蛋白残基1至462的编码序列(图4B)。用Asp718I和SphI消化质粒pNIV3221，将1402 bp片段平头化并通过连接插入pULB5213的SmaI位点(文献同上)。所得质粒pNIV3226示于图4C。(5)缺乏5′膜锚着区域的血凝素-神经氨酸苷酶与融合蛋白的信号区域相融合，s+FHNa-用PvuII消化质粒pNIV3215(见上文)，即编码完整HN蛋白的cDNA克隆；纯化编码氨基酸残基79至582并携有终止密码子的1700bp片段。用HindIII消化编码融合蛋白(F)氨基酸残基1至462的质粒pNIV3221(文献同上)。将携有pUC19序列以及编码融合蛋白氨基酸残基1至51序列的2900bp片段平头化并与编码HN蛋白氨基酸残基79至582的1700bp PvuII片段及其后的终止密码子相连接，进入pUC19载体(图5A)。用Asp718I和HindIII消化质粒pNIV3222，纯化1694bp的平头DNA片段并通过连接插入pULB5213的SmaI位点(文献同上)，所得质粒pNIV3227示于图5B。(6)杂合蛋白s+FHNa-xFa-用HindIII消化含有编码缺乏锚着区域的F蛋白序列的质粒pNIV3221(文献同上)。纯化编码F蛋白氨基酸残基52至462的1246bp平头片段。用NheI消化编码融合蛋白氨基酸残基1至51、一个无关的苏氨酸(aa52(氨基酸残基52))和紧随有终止密码子的HN蛋白氨基酸残基79至582的质粒pNIV3222(文献同上)，它的裂解位点位于氨基酸残基576的密码子的3′侧。用NheI消化质粒pNIV3222并平头化，然后通过连接装配到编码F蛋白氨基酸残基52至462的1246bp片段上。所得质粒pNIV3223在pUC19载体中因而可编码氨基酸残基1至51(包含F蛋白的信号)、无关的苏氨酸、HN蛋白的氨基酸残基79至576，无关的谷氨酰胺以及紧随有终止密码子的F蛋白氨基酸残基53至462(图6A)。用Asp718I和HindIII消化质粒pNIV3223；将2945bp的DNA片段平端连接至pULB5213的SmaI位点(文献同上)。所得质粒示于图6B。
(7)缺乏3′膜锚着区域的融合蛋白与缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白相融合Fs+a-xHNa-用HindIII消化编码完整HN蛋白的质粒pNIV3215(文献同上)，用Klenow聚合酶补平突出末端，并用SacI消化；将1762bp的片段与经SmaI和SacI消化的pUC19载体相连接以产生质粒pNIV3229。制备合成的双链衔接子(fhnoligo l/fhnoligo 2)以构建F和HN编码序列之间的连接区，从而产生连续的开放阅读框(图7A)。用KpnI和BbsI消化质粒pNIV3229，除去编码HN蛋白氨基酸残基1至66的229bp片段并用合成的衔接子置换，因此得到pNIV3230。用KpnI和PstI消化编码缺乏锚着区域的F蛋白的质粒pNIV3221(文献同上)。纯化1387bp的片段并与经KpnI和NsiI消化的pNIV3230相连接。所得质粒pNIV3231含有由载体pUC19携带的、编码F蛋白氨基酸残基1至460的组件，以及随后的组氨酸和带有终止密码子的HN蛋白氨基酸残基63至578的组件(图7B)。用Asp718I和SphI消化质粒pNIV3231以除去3007bp的编码组件，平头插入牛痘苗转移质粒pULB5213 SmaI位点(文献同上)以产生pNIV3232。(B)用于转染CHO细胞(1)缺乏膜锚着区域的融合蛋白Fs+a-
用Asp718I和HindIII消化质粒pNIV3221(见上文)；纯化1402bp的平头片段并将其克隆进谷氨酰胺合成酶(GS)载体pEE14的SmaI位点(Cockett et al，1990，Bio/Technology 8，662-667)。所得质粒pEE14-Fa-含有处于人巨细胞病毒(hCMV-MIE)主要的立即早期启动子控制之下的缺乏锚着区域的融合蛋白(图4D)。(2)缺乏5′膜锚着区域的血凝素-神经氨酸苷酶与融合蛋白的信号区域相融合，s+FHNa-用Asp718I和HindIII消化质粒pNIV3222，纯化1649bp的平头DNA片段并通过连接插入pEE14载体的SmaI位点(文献同上)。所得质粒pEE14s+FHNa-含有处于hCMV启动子控制之下的F蛋白氨基酸残基1至51(包含F蛋白的信号区域)、无关的苏氨酸以及HN蛋白氨基酸残基79至582的序列(图5C)。(3)杂合蛋白s+FHNa-xFa-用Asp718I和HindIII消化质粒pNIV3223(见上文)；回收2945bp的DNA片段并与DEE14载体的SmaI位点平头连接(文献同上)。所得质粒pEE14s+FHNa-xFa-含有处于hCMV启动子控制之下的编码F蛋白信号区域(aa1至51)、一个无关的谷氨酰胺、缺乏其信号和锚着区域的F蛋白的序列(图6C)。(4)缺乏3′膜锚着区域的融合蛋白与缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白相融合，Fs+a-xHNa-用Asp718I和SphI消化质粒pNIV3231(见上文)以除去平头连接于pEE14载体(见上文)SmaI位点的3007 bp片段。所得质粒pEE14Fs+a-xHNa-含有处于hCMV启动子控制之下的、编码缺乏其膜锚着区域(aa1-460)和一个组氨酸的F蛋白与紧随有终止密码子、缺乏其膜锚着区域(aa63-578)的HN蛋白相融合的序列(图7C)。(C)用于转化细菌NP蛋白用BamHI消化含有pUC19载体中完整NP蛋白cDNA的质粒pNIV3216(见上文)。纯化1682 bp的平头片段并克隆进大肠杆菌表达载体pAS1(Rosenberg et al，in Methods in Enzymology；Wu，R.etal，Eds.，Vol.101，PP.123-138，Academic Press，New York，1983)的平头BamHI位点。所得质粒pNIV3217含有处于噬菌体λPL启动子控制之下的与完整NP蛋白序列融合的7个无关氨基酸的序列(包括ATG起始密码子)(图8)。实施例2在真核细胞中的表达(A)通过牛痘苗病毒重组体将重组转移质粒pNIV3205，pNIV3208，pNIV3213和pNIV3232转染进经痘苗感染的CV-1细胞中，根据在X-gal存在下它们的蓝色显示，在溴代尿嘧啶核苷选择和噬菌斑纯化后分离重组病毒。它们分别被称为VV3205、VV3208、VV3213和VV3232。RAT2 TK株为WR型(来源于Borisewitz，U.K.)。
该方法是按照前述的获得牛痘苗病毒重组体的方法进行的(Ma-ckett，M.and Smith，G.L.，J.Gen.Virology 67，2067-2082，1986；Mackett，M.，Smith，G.L.and Moss，B.，J.Virology 49，857-864，1984)。(1)融合蛋白Fs+a-用重组牛痘苗病毒VV3205感染培养中的CV-1细胞，感染复数为1(m.o.i＝1)。感染后16和48小时之间收集被感染的细胞(每次试验约3.105)以及用过的培养基(约2ml)。通过对细胞抽提物和用过的培养基进行免疫沉淀可证明Fs+a+蛋白的存在。
免疫沉淀实验是按下述进行的。简单地说，即通过在35S-甲硫氨酸的存在下培养重组牛痘苗病毒体内标记重组产物。将被标记的样品、细胞抽提物和培养基相继与单克隆抗体混合物(Mab 2.049，2.159，5.369，5.414，5418，5.439，Orvell，J.Immunol.，1494132，2622-2629，得自Dr.E.Norrby，Karolinska Institute，St-ockholm，Sweden)和兔抗鼠血清一起温育；然后通过与结合于琼脂糖凝胶的蛋白A相结合回收特定的复合体。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析免疫沉淀物，干燥后进行放射自显影。在SDS-PAGE上，细胞内重组产物以70KDa(F0)前体，和还原状态的60KDa(F1)亚单位迁移。存在于用过的培养基中的产物全部以F1亚单位的形式存在，在试验中观察不到F2亚单位，因为在其序列中缺少甲硫氨酸。另外，免疫沉淀实验也可以用3H-葡糖胺来进行。在这种情况下，细胞抽提物应与Mab 2.019和2.159(文献同上)一起温育。通过与吸附于琼脂糖凝胶上的蛋白A相结合回收特定的复合物并在17％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析免疫沉淀物。重组产物以还原状态的60KDa带形式迁移，分别表示融合糖蛋白糖基化的和被蛋白酶裂解的F1和F2亚单位(图9，泳道3)。(2)血凝素-神经氨酸苷酶HNs+a+用重组牛痘苗病毒VV3208感染培养中的CV-1细胞。通过放射免疫沉淀法分析表达产物。所用35S-甲硫氨酸标记的方法同上所述，但免疫沉淀法中所用的单克隆抗体混合物(Mab 741，743，1.933，2.072，2.073，2.075，与实施例2-A1的参考文献相同，由Dr.E.Norrby提供，文献同上)有所不同。仅在细胞抽提物中发现以80KDa产物的形式存在的重组蛋白。用3H-葡糖胺标记细胞抽提物时，方法也与上述相同，除了用Mab 2.075替代Mab混合物。重组体表现为表现大小为75KDa的糖基化单体(图9，泳道2)。(3)核衣壳蛋白用重组牛痘苗病毒VV3213感染CV-1细胞。通过Western印迹法鉴定表达产物。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析细胞抽提物和用过的培养基。转移至硝酸纤维素膜后，用单克隆抗体的混合物(Mab 705，728，2.099，文献同实施例2，A，1，由Dr.E.Norrby提供，文献同上)探测分离的蛋白质，按照标准方法，使用与碱性磷酸酶相偶联的兔抗鼠IgG和适当的显色底物来鉴别该复合物。
发现重组产物仅在细胞抽提物中以70 KDa蛋白质的形式存在。(B)在CHO细胞中的表达(稳定转化子)(1)缺乏膜锚着区域的融合蛋白，Fs+a-使用每1.25 106个细胞20μg DNA的量，通过磷酸钙共沉淀法将pEE14-Fa-质粒转染进CHO-K1细胞。在GME-S培养基中培养CHO-K1细胞。转染后两天通过加入25μM甲硫氨酸sulfoximine选择GS转柒子。十至十四天后，挑选抗性集落并转移至96孔培养板。然后将每个转化子转移至24孔培养板，随后再转移至80cm2的瓶中。当细胞达到约80％汇合时检测GS转化子中的Fs+a-蛋白。此方法可按描述于Cockett，M.I.，Bebbington，C.R.and Yarranton，G.T.，Bio/Technology 8，662-667，1990中的方法进行。
在GS转化子用过的培养基中可发现Fs+a-蛋白。它是通过West-ern印迹实验来鉴别的，使用的是抗纯化的腮腺炎病毒颗粒的兔多克隆抗体。可现察到两条带，它们构成蛋白的两个亚单位(50KDa和20KDa)。(2)缺乏5′膜锚着区域的血凝素-神经氨酸苷酶与融合蛋白的信号区相融合，s+FHNa-在CHO细胞中表达s+FHNa-的方法如上述，通过使用抗纯化的腮腺炎病毒颗粒的兔多克隆抗体的免疫沉淀法鉴别用过的培养基中的s+FHNa-蛋白；它表现为84KDa的单体。(3)杂合蛋白s+FHNa-xFa-在CHO细胞中表达s+FHNa-xFa-的方法如上所述。(4)缺乏3′膜锚着区域的融合蛋白与缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白相融合，Fs+a-xHNa-在CHO细胞中表达Fs+a-xHNa-的方法如上所述。(C)在大肠杆菌中表达NP蛋白用质粒pNIV3217转化大肠杆菌菌株AR58(Mott，J.E.，Grant，R.，Ho，Y.Z.and Platt，T.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，88-92)，它含有编码温度敏感型阻遏物的缺陷型λ噬菌体cI857ts(在低温下pL转录受抑制但温度升高时不受抑制)。
在20ml含有氨苄西林(100μg/ml)的加富(LB)培养基中培养经转化的细菌直至O.D.630为0.6。通过将培养基温度从30℃变至42℃，可引发PL启动子。
收集1ml培养物的等分试样并离心，将沉淀物重新悬浮于100μl 1％NaDodSO4，6M尿素、5％2-疏基乙醇和10％甘油中，煮沸5分钟，将10μl样品于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离。转移至硝酸纤维素膜后，用抗NP单克隆抗体的混合物(文献同上，参考实施例IIA.3)探测分离的蛋白质。
仅在诱导的样品中发现了相应于NP蛋白的69 KDa产物。实施例3对新生仓鼠模型的激发实验如前所述(Overman et al，1953；Burr and Nagler，1953；Love et al，1985；Love et al，1986)在新生仓鼠模型中评价牛痘苗重组体VV3205(F蛋白)，VV3208(HN蛋白)和VV3213(NP蛋白)的保护能力。
此实验以几个步骤进行(a)用上述牛痘苗重组体的每一种和对照牛痘苗构建体(2×108pfu/每只动物)通过皮肤多次划破法感染雌性仓鼠。(b)接种后几周内定期地测定对特定蛋白质的抗体效价以确证产生了免疫应答。(c)然后交配免疫雌性仓鼠以得到新生动物用以实际的激发实验。(d)用Kilham品系的腮腺炎病毒脑内接种新生仓鼠(9.105pfu/每只动物)，激发后10天由于脑炎引起了死亡。结果用于免疫的牛痘苗重组体 母体HI Ab效价后代激发后总的存活率(感染后10天)VV-β-内酰胺酶(对照)＜10 33.3％(5只存活/激发了15只)VV3205(F蛋白) 80 44.4％(4只存活/激发了9只)VV3208(HN蛋白) 80 100％(4只存活/激发了4只)VV3213(NP蛋白) 10215.8％(3只存活/激发了19只)VV3208(HN)+80 38.9％(7只存活/激发VV3205(F) 了18只)结果表明，表达NP蛋白的VV3213未降低经腮腺炎病毒激发的新生仓鼠的死亡率。
然而，来源于经VV3205(F)或3208(HN)免疫过的仓鼠母体的新生仓鼠之死亡率却降低了，这表明从母体转递给其后代的抗F和抗HN抗体具有对抗腮腺炎病毒感染的能力。实施例4从重组牛痘苗病毒VV3208中纯化腮腺炎病毒的HN蛋白用VV3208感染17个150cm2瓶CV1细胞，感染复数＝2。再取一只瓶并补加35S-甲硫氨酸以作为随后纯化中的示踪剂。感染后2天，收集细胞并裂解之，离心除去细胞碎片，将澄清的上清液穿过基于单克隆抗体Mab 2072的亲和柱(10.8mg抗体与1ml被CNBr激活的琼脂糖凝胶4B相偶联，Pharmacia；其方法为本技术中熟知的)。
重组HN蛋白结合于亲和柱上，洗涤后，用3M KSCN从基质中将之洗脱下来。通过计数经掺入35S-甲硫氨酸标记的等分试样来测定洗脱液。
然后集中含有重组蛋白的级分，透析以除去KSCN并冷冻干燥。通过在SDS-PAGE上迁移，干燥凝胶和放射自显影可检测该制品的纯度。此实验表明重组HN蛋白正如所期望的表现出分子量约为80KDa，其纯度超过90％。纯化后得到250μg纯化的HN重组蛋白。此物质可用于加强上述动物模型的免疫应答，另外还可在小鼠和兔中产生抗体以提供用于检测的工具。参考文献Overman，J.R.，Peers，J.H.and Kilham，L.(1953)Arch.Pathol，55，457-465.Burn，M.M.and Nagler，F.P.(1953)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.8 3，714-717。Love，A.，Rydbeck，R.，Kristensson，K.，Orvell，C.and No-rrby，E.(1985)J.Virol.58，67-74，Iove，A.et al(1986)J.Virol.59，220-224.
权利要求
1.重组DNA，它编码选自下组的腮腺炎病毒抗原(a)具有信号肽(S)和膜锚着区域(a)的全长融合蛋白(F)(本文称作Fs+a+)；全长吸附蛋白或血凝素-神经氨酸苷酶(HN)；全长核衣壳蛋白(NP)；(b)缺乏膜锚着区域的截短融合蛋白(本文称作Fs+a-)；(c)融合F、HN和/或NP蛋白或其部分得到的杂合蛋白。
2.根据权利要求1的重组DNA，其中(c)组的杂合蛋白选自(i)与融合蛋白的信号区域相融合的缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白(本文称作s+FHNa-)；(ii)本文称作s+FHNa-xFa-的杂合蛋白；(iii)与缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白相融合的缺乏3′膜锚着区域的融合蛋白(本文称作Fs+a-xHNa-)。
3.根据权利要求1或2的重组DNA是一种载体。
4.根据权利要求3的载体衍生于牛痘苗转移载体。
5.根据权利要求4的载体衍生于pULB5212。
6.根据权利要求5的载体选自pNIV3205，pNIV3208，pNIV3213和pNIV3232。
7.根据权利要求3的载体适于转染哺乳动物细胞。
8.根据权利要求7的载体衍生于谷氨酰胺合成酶载体。
9.根据权利要求8的载体衍生于pEE14。
10.根据权利要求3的载体适于转化细菌细胞。
11.根据权利要求10的载体衍生于pUC19。
12.被根据权利要求3的载体转化或转染的宿主。
13.根据权利要求12的宿主选自牛痘苗病毒；哺乳动物细胞或细菌细胞。
14.制备由权利要求1或2中DNA编码的重组蛋白的方法，包括(a)在根据权利要求13的重组宿主中表达所说DNA；和(b)用标准技术分离产生的蛋白质。
15.一种蛋白质，它选自下组缺乏膜锚着区域的截短融合蛋白(本文称作Fs+a-)；通过融合F、HN和/或NP蛋白或其部分所得的杂合蛋白。
16.根据权利要求15的蛋白质，其中该杂合蛋白选自(i)与融合蛋白的信号区域相融合的缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白(本文称作s+FHNa-)；(ii)本文称作s+FHNa-xFa-的杂合蛋白；(iii)与缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白相融合的缺乏3′膜锚着区域的融合蛋白(本文称作Fs+a-xHNa-)。
17.一种疫苗组合物，其含有免疫保护剂量的根据权利要求14方法制备的蛋白质或根据权利要求15或16的蛋白质以及药用可接受的载体。
18.防止人腮腺炎病毒感染的方法，包括给有此需要的人施用免疫有效剂量的根据权利要求17的疫苗组合物。
全文摘要
本发明提供了重组DNA，它编码选自含有下列各组的腮腺炎病毒抗原(a)具有完整的信号肽(s)和膜锚着区域(a)的全长融合蛋白(F)(本文称作Fs+a+)；全长吸附蛋白或血凝素-神经氨酸苷酶(HN)；全长核衣壳蛋白(NP)；(b)缺乏膜锚着区域的截短融合蛋白(本文称作Fs+a-)；(c)通过融合F、HN和/或NP蛋白或其部分得到的杂合蛋白。本发明范围内还包括含有本发明DNA的载体，以及被载体转化或转染的宿主，和由宿主表达的蛋白质。
文档编号C12N15/45GK1126492SQ94192620
公开日1996年7月10日 申请日期1994年4月26日 优先权日1993年4月30日
发明者亚历克斯·博伦, 索菲·霍阿德, 厄林·C·J·诺尔比, 塔马斯·M·瓦桑伊 申请人:史密斯克莱·比奇曼生物公司