L-氨基酸氧化酶的制作方法

专利名称：L-氨基酸氧化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的L—氨基酸氧化酶，其具有广范围的底物专一性，并可从Trichoderma harzianum获得。本发明的酶可用于各种情况的过氧化氢的原位(in situ)产生，并可以很好地与底物一起掺入洗涤剂组合物中，该组合物还含有过氧化物酶系，用于抑制洗涤过程中染料从一种染色织物传递到其它织物。
洗涤程序中漂白剂的应用以及其用作洗涤剂组合物的成份在本领域已众所周知。因此，漂白剂被掺入许多商品洗涤剂组合物中或被作为单独的制剂出售，洗涤时将其加入洗涤剂中。
混合入洗涤剂组合物的漂白剂大多常为过氧化氢的前体。过硼酸盐和过碳酸盐是最重要的用作漂白剂的化合物的例子。
向洗涤剂中加入漂白剂的最初目的是为了获得并保持衣料大体上洁白，更准确地说，是为了漂白上面的污迹，如茶、咖啡、果汁、红酒等。
后来要求含有过氧化氢或过氧化氢衍生的漂白体系能够减少染料的转移，即防止由于从染色织物上脱掉多余的染料而造成的褪色及染料在其它织物上的附着。但最近含有过氧化氢源和过氧化物酶的体系已公开，参见如国际专利申请WO 91/05839。该专利申请所报道的一个过氧化氢源的可能性是氧化酶体系，即氧化酶与其底物在一起的体系。当然，这种氧化酶必须能与洗涤基质共存，尤其是与过氧化物酶体系。
GB 2015532中报道了来自绿色木霉(trichoderma viride)、对L—赖氨酸具有高度底物专一性的L—氨基酸氧化酶。
现已发现，具有广范围的底物专一性的新的L—氨基酸氧化酶可由Trichoderma harzianum获得。该新型酶具有原位产生过氧化氢的优良性质。
因此，本发明提供一种L—氨基酸氧化酶(E.C.1.4.3.2)，其在15pH范围内的最适pH值为8.5至9.5(L—精氨酸存在时20°C下保温20分钟后测定)，pH9.5时相对于初始活力pH稳定性为80％或更高(在没有底物存在时40℃下保温1小时后测定)，并且对L—精氨酸、L—赖氨酸、L—蛋氨酸、L—天冬酰胺、L—苯丙氨酸及L—亮氨酸均具活性。
另一方面，本发明提供了一种制备本发明L—氨基酸氧化酶的方法，该方法包括，在含有碳源、氮源及无机盐的合适的培养基中培养L—氨基酸氧化酶的生产菌株Trichoderma harzianum，然后对所需要的酶进行回收。
再一方面，本发明提供一种含有本发明L—氨基酸氧化酶的洗涤剂添加剂，该添加剂以颗粒形式提供，优选无粉尘颗粒，以液体尤其是稳定化液体，浆或保护的酶的形式提供。
还有一方面，本发明提供一种含有本发明L—氨基酸氧化酶和该氧化酶底物的洗涤剂组合物。
根据用于专利程序目的的国际承认的微生物的保藏的布达佩斯条约，菌株Trichoderma harzianum，A611于1993年2月22日保藏于Centraal Bureau Voor Schimmelcultures(CBS)，Oosterstraat 1，3740 AG Baarn Netherlands，保藏号AccessionNo.CBS 223.93。
参考附图对本发明作进一步的说明，其中

图1表明本发明L—氨基酸氧化酶的pH—活力曲线(％活力)；图2表明本发明L—氨基酸氧化酶的pH稳定性(％残余活力)；图3表明本发明L—氨基酸氧化酶的温度稳定性(％残余活力)；图4A—4B表明与pHBS(促进剂)结合的过氧化物酶对本发明L—氨基酸氧化酶活力的影响(4A为无pHBS时情况；4B为50μM pHBS存在时情况)；图5表明以灰盖鬼伞过氧化物酶(cip)和过氧化氢或L—氨基酸氧化酶(AAO)在pH 8.5、35℃时对甲基橙(8μM)染料的漂白过程(时间持续以秒计，465nm下；110nM Cip，230μM H2O2；210nM Cip，1mM L—亮氨酸，16μg/ml AAO；310nM Cip，53μM pHBS，1mM L—亮氨酸，16μg/mlAAO；410hM Cip，53μM pHBS，230μM H2O2)；图6表明以灰盖鬼伞过氧化物酶(Cip)和过氧化氢或L—氨基酸氧化酶(AAO)在pH 8.5 35℃时对甲基橙(8μM)染料的漂白过程(时间延续以秒计，465nm下；116μg/ml AAO；1mM L—亮氨酸；232μg/ml AAO，1mM L—亮氨酸；3230μM H2O2)。
本发明提供可由下述性质来描述的新的L—氨基酸氧化酶(E.C.1.4.3.2)。物理—化学性质本说明书的实施例3描述了L—氨基酸氧化酶制剂的主要性质。
本发明L—氨基酸氧化酶在pH小于7至pH约为12的范围内均显示出活性。酶的最适pH值在pH8至10间，尤其是在pH8.5至9.5间，在pH9附近，这是在L—精氨酸存在时室温下保温20分钟后所测定的结果。
本发明L—氨基酸氧化酶在pH7—9.5范围内相对于初始活力的pH稳定性高于80％。在pH10下，本发明L—氨基酸氧化酶相对于初始活力的pH稳定性高于70％，优选高于80％，这是在40℃下、不存在底物、保温1小时后测定的结果。
本发明L—氨基酸氧化酶在低于22℃至高于60℃的温度范围内是稳定的。在25℃至60℃范围内该酶相对于初始活力的温度稳定性高于80％。
本发明L—氨基酸氧化酶对L—精氨酸，L—赖氨酸，L—蛋氨酸，L—天冬酰胺，L—苯丙氨酸及L—亮氨酸均显示活性。免疫化学性质本发明L—氨基酸氧化酶具有和来自菌株T.harzianumA611，CBS 223.93的那些L—氨基酸氧化酶完全相同或部分相同(即至少部分相同)的免疫化学性质。
免疫化学性质可用免疫学上的交叉反应一致性试验来测定。通过众所周知的Ouchterlong双免疫扩散程序或根据Axelsen N.H.的tandem交叉免疫电泳(Handbook of Immunoprecipitation—In—Gel Techniques；Blackwell Scientific Publications(1983)，Chapters 5 and 14)进行一致性试验。术语“抗原一改性”和“部分抗原一致性”描述于同一本书，第5、19和20章。
根据上述参考文献通过用本发明的纯化的L—氨基酸氧化酶对兔子进行免疫来产生单一特异性抗血清。免疫原与弗氏佐剂混合并每两周给兔子皮下注射一次。8周整个免疫期后得到抗血清，由此制得的免疫球蛋白如前面Axelsen N.H.所述。酶的制备通过在含有碳源、氮源和无机盐的合适的培养基中培养L—氨基酸氧化酶的生产菌株Trichoderma harzianum，然后回收所需要的酶来获得本发明的L—氨基酸氧化酶。
在优选实例中，对菌株T.harzianum A611.CBS 223.93或其突变体或其变异体进行培养。
本发明的L—氨基酸氧化酶也可通过重组DNA技术来获得。工些应用本发明的L—氨基酸氧化酶可以与其底物一起用于需原位产生过氧化氢的生产工艺中。
因此，在优选实例中，本发明的L—氨基酸氧化酶可很好地掺入洗涤剂组合物中，尤其是含有过氧化物酶系的洗涤剂组合物，如用于在洗涤过程中抑制染料的传递或改善衣物洗涤剂的漂白效果。
在其它优选实例中，本发明的L—氨基酸氧化酶可掺入牙膏中或用于化妆品的保存。
在另一实例中，本发明L—氨基酸氧化酶可用于废水处理工艺中，用于造纸工业中纸浆的漂白，用于处理纸浆生产中的废水以及用于木质素的改良，如用在刨花板生产中。POD体系在过氧化物酶系(POD体系)中需要使用本发明L—氨基酸，以形成过氧化氢。
本发明中，POD体系是一种包含一种具有过氧化物酶活性的酶、一种过氧化氢源和可选择的一种过氧化物酶增强剂的体系。此过氧化物酶系已用来抑制染料的转移，并已描述于例如国际专利申请WO 92/18687和WO 92/18683。
在这样的过氧化物酶系中，具有过氧化物酶活性的酶可以是任一过氧化物酶，包含由酶分类为EC 1.11.1.7或任一其衍生而来的片断，具有过氧化物酶活性(如卟啉环系或微过氧化物酶，参见如国际专利申请WO 91/05858和WO 92/16634)。已知这些酶来自微生物、植物和动物。
过氧化物酶可由植物生产(如辣根过氧化物酶)或由微生物如真菌或细菌生产。优选地，过氧化物酶来自鬼伞属，如灰盖鬼伞或长根鬼伞或来自芽孢杆菌属，如短小芽孢杆菌，特别是国际专利申请WO 91/05858中的过氧化物酶。
过氧化物酶还可以是一种由重组DNA技术生产的酶。特别地，重组生产的过氧化物酶是源于鬼伞属菌株，特别是国际专利申请WO 92/16634中的长根鬼伞或灰盖鬼伞的过氧化物酶。
在过氧化物酶系中，过氧化氢源可以是过氧化氢或过氧化氢的前体，如过碳酸盐或过硼酸盐，或产生过氧化氢的酶系，如氧化酶及该氧化酶的底物。
在过氧化物酶系中，增强剂可以是可氧化的底物如金属离子或酚化合物如7—羟基香豆素(7HCm)，香草醛(VAN)和对一羟基苯磺酸盐(pHBS)，其描述于如国际专利申请WO 92/18683和WO 92/18687，和Kato M和Shimizu S，Plant Cell Physiol.198526(7)，pp.1291—1301(详见表1)或Saunders B C等，Peroxidase，London，1964，P.141ff。洗涤剂组合物根据本发明，L—氨基酸氧化酶通常可作为洗涤剂组合物的成份。即它能以无粉尘颗粒、稳定的液体或已保护的酶的形式包括在洗涤剂组合物中。无粉尘颗粒可以按US4,106,991和4,661,452(两者均为Novo Industri A/S)公开的方法生产，并可选择地按本领域已知方法包覆。蜡质包覆材料的例子是平均摩尔量为1000至20000的聚环氧乙烷产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子，并有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单酸甘油酯、甘油二酯和甘油三酯。适于流化床技术的膜形成包覆材料的例子由专利GB 1483591给出。液体酶制剂可以按已知方法通过加入多羟基化合物来达到稳定，如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸。其它酶稳定剂在本领域已熟知。可根据EP 238,216揭示的方法制备保护的酶。
本发明的洗涤剂组合物可以呈任一方便的形式如粉末状、颗粒状、糊状或液体。液体洗涤剂可以是水溶液，一般含有上限至70％的水和0—30％的有机溶液，或是非水溶液。
洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可为阴离子、非离子、阳离子或两性离子表面活性剂。洗涤剂通常含有0—50％的阴离子表面活性剂，如线型烷基苯磺酸盐(LAS)，α—烯属磺酸盐(AOS)，烷基硫酸盐(脂肪族醇硫酸盐)(AS)，脂肪醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)，二级链烷磺酸盐(SAS)，α—磺基脂肪酸甲酯，烷基—或烯基琥珀酸或皂。洗涤剂也可含有0—40％的非离子表面活性剂，如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)，羧化的脂肪醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基聚苷，烷基二甲基氧化胺，乙氧基脂肪酸单乙醇酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如与WO 92/06154中所描述的一样)。
另外，洗涤剂组合物还可包含一种或多种其它酶，如淀粉酶，脂肪酶，角质酶，蛋白酶，纤维素酶，过氧化物酶和其它氧化酶。
特别地，本发明提供一种洗涤剂的添加剂。通过分别加入一种或多种酶的各添加剂或加入含所有这些酶的组合添加剂，洗涤剂组合物中可包括这些酶。
在另一特别的实例中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂和一种洗涤剂组合物，其还包含一种该L—氨基酸氧化酶的底物。
适宜的底物可以是L—精氨酸，L—赖氨酸，L—蛋氨酸，L—天冬酰胺，L—苯丙氨酸和L—亮氨酸中的一种或多种。
洗涤剂中可包含1—65％的洗涤助洗剂或配位剂，如沸石、二磷酸、三磷酸、膦酸，柠檬酸，次氮基三乙酸(NTA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)，烷基或烯基琥珀酸，可溶性硅酸盐或多层式硅酸盐(如得自Hoechst的SKS—6)。洗涤剂还可以是未复配洗涤剂，即基本不含洗涤助洗剂。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物，例如羧甲基纤维素(CMC)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯如聚丙烯酸酯，马来酸/丙烯酸共聚物以及月桂异丁烯酸/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可包含一种漂白体系，该体系可包含一种H2O2源，如过硼酸盐成过碳酸盐，其可以与四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)这样的形成过酸类漂白的活化剂结合。可选择地，漂白体系可以包含如酰胺、酰亚胺或砜形式的过氧酸。
本发明洗涤剂组合物的酶可以用常规稳定剂稳定，如多羟基化合物象丙二醇或甘油，糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯，并且组合物可按WO 92/19709和WO 92/19708中所述方法配制。
洗涤剂还可包含其它常规洗涤剂成份，如织物调理剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防蚀剂、污垢悬浮剂、防尘再沉淀剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香料。
pH(在水溶液中，使用浓度下测定)通常为中性或碱性，如7—11。
本发明范围内的洗涤剂组合物的特殊形式包括1)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒状的洗涤剂组合物，其包含—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算)7—12％—脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C12-18醇，1—2EO)或烷基硫酸盐(如C16-18) 1—4％—脂肪醇乙氧基化物(如C14-15醇，7EO)5—9％—碳酸钠(Na2CO3) 14—20％
—可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) 2—6％—沸石(NaAlSiO4) 15—22％—硫酸钠(Na2SO4) 0—6％—柠檬酸钠/柠檬酸(C6H5Na3O7/C6H8O7) 0—15％—过硼酸钠(NaBO3·H2O) 11—18％—TAED 2—6％—羧甲基纤维素 0—2％—聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 0—3％—酶0—5％—小成份(如抑泡剂，香料，荧光增白剂，光漂白剂) 0—5％2)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒状的洗涤剂组合物，其包含—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算) 6—11％—脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C12-18醇，1—2EO)或烷基硫酸盐(如C16-18) 1—3％—脂肪醇乙氧基化物(如C14-15醇，7EO) 5—9％—碳酸钠(Na2CO3)15—21％—可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) 1—4％
—沸石(NaAlSiO4) 24—34％—硫酸钠(Na2SO4)4—10％—柠檬酸钠/柠檬酸(C6H5Na3O7/C6H8O7) 0—15％—羧甲基纤维素0—2％—聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1—6％—酶 0—5％—小成份(如抑泡剂，香料) 0—5％3)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒状的洗涤剂组合物，其包含—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算)5—9％—脂肪醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO) 7—14％—脂肪酸皂(如C16-22) 1—3％—碳酸钠(Na2CO3)10—17％—可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) 3—9％—沸石(NaAlSiO4) 23—33％—硫酸钠(Na2SO4)0—4％—过硼酸钠(NaBO3·H2O) 8—16％—TAED2—8％—膦酸(如EDTMPA) 0—1％—羧甲基纤维素0—2％
—聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1—3％—酶 0—5％—小成份(如抑泡剂，香料，荧光增白剂) 0—5％4)配制成堆积密度至少为600g/l的颗粒状的洗涤剂组合物，其包含—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算)8—12％—脂肪醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO) 10—25％—碳酸钠(Na2CO3)14—22％—可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) 1—5％—沸石(NaAlSiO4) 25—35％—硫酸钠(Na2SO4)0—10％—羧甲基纤维素0—2％—聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1—3％—酶 0—5％—小成份(如抑泡剂，香料) 0—5％5)含水的液体洗涤剂组合物，其包含—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算)15—21％—脂肪醇乙氧基化物
(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO) 12—18％—脂肪酸(如油酸)皂 3—13％—烯基琥珀酸(C12-14) 0—13％—氨基乙醇 8—18％—柠檬酸 2—8％—膦酸 0—3％—聚合物(如PVP，PEG) 0—3％—硼酸盐(B4O7) 0—2％—乙醇 0—3％—丙二醇 8—14％—酶 0—5％—小成份(如分散剂，抑泡剂，香料，荧光增白剂) 0—5％6)含水的液体洗涤剂组合物，其包含—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算) 15—21％—脂肪醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO) 3—9％—脂肪酸(如油酸)皂 3—10％—沸石(NaAlSiO4) 14—22％—柠檬酸钾 9—18％—硼酸盐(B4O7) 0—2％—羧甲基纤维素 0—2％—聚合物(如PEG，PVP) 0—3％
—结合聚合物-3％如月桂基异丁烯酸/丙烯酸共聚物；摩尔比为25∶1；MW 3800 0—3％—甘油 0—5％—酶0—5％—小成份(如分散剂，抑泡剂，香料，荧光增白剂) 0—5％7)配制成的堆积密度至少为600g/l的颗粒状洗涤剂组合物，其包含—脂肪族醇的硫酸酯 5—10％—乙氧基脂肪酸单乙醇酰胺3—9％—脂肪酸皂 0—3％—碳酸钠(Na2CO3) 5—10％—可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) 1—4％—沸石(NaAlSiO4) 20—40％—硫酸钠(Na2SO4) 2—8％—过硼酸钠(NaBO3·H2O)12—18％—TAED 2—7％—聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG) 1—5％—酶 0—5％—小成份(如荧光增白剂，抑泡剂，香料) 0—5％8)配制成的颗粒状洗涤剂组合物，其包含
—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算) 8—14％—乙氧基脂肪酸单乙醇酰胺 5—11％—脂肪酸皂 0—3％—碳酸钠(Na2CO3) 4—10％—可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) 1—4％—沸石(NaAlSiO4) 30—50％—硫酸钠(Na2SO4) 3—11％—柠檬酸钠(C6H5Na3O7) 5—12％—聚合物(如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG) 1—5％—酶 0—5％—小成份(如抑泡剂，香料) 0—5％9)配制成的颗粒状洗涤剂组合物，其包含—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算) 6—13％—非离子表面活性剂 1—4％—脂肪酸皂 2—6％—碳酸钠(Na2CO3)14—22％—沸石(NaAlSiO4) 18—32％—硫酸钠(Na2SO4)5—20％—柠檬酸钠(C6H5Na3O7)3—8％—过硼酸钠(NaBO3·H2O) 4—9％—漂白活化剂(如NOBS或TAED) 1—5％
—羧甲基纤维素 0—2％—聚合物(如聚羧酸酯或PEG) 1—5％—酶 0—5％—小成份(如荧光增白剂，香料) 0—5％10)含水的液体洗涤剂组合物，其包含—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算)15—23％—脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C12-15醇，2—3EO) 8—15％—脂肪酸乙氧基化物(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO) 3—9％—脂肪酸(如月桂酸)皂 0—3％—氨基乙醇1—5％—柠檬酸钠5—10％—水溶助长剂(如甲苯磺酸钠)2—6％—硼酸盐(B4O7) 0—2％—羧甲基纤维素0—1％—乙醇1—3％—丙二醇 2—5％—酶 0—5％—小成份(如聚合物，分散剂，香料，荧光增白剂) 0—5％11)含水的液体洗涤剂组合物，其包含
—线型烷基苯磺酸盐(以酸计算) 20—32％—脂肪醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)6—12％—氨基乙醇 2—6％—柠檬酸8—14％—硼酸盐(B4O7)1—3％—聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，结合聚合物如月桂基异丁烯酸/丙烯酸共聚物和CMC)0—3％—甘油 3—8％—酶0—5％—小成份(如水溶助长剂，分散剂，香料，荧光增白剂) 0—5％12)配制成的堆积密度至少为600g/l的颗粒状洗涤剂组合物，其包含—阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐，烷基硫酸盐，α—烯属磺酸盐，α—磺基脂肪酸甲酯，链烷磺酸盐，皂) 25—40％—非离子表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物) 1—10％—碳酸钠(Na2CO3) 8—25％
—可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) 5—15％—硫酸钠(Na2SO4) 0—5％—沸石(NaAlSiO4) 15—28％—过硼酸钠(NaBO3·4H2O) 0—20％—漂白活化剂(TAED或NOBS)0—5％—酶0—5％—小成份(如香料，荧光增白剂)0—3％13)如1)—12)中所述洗涤剂配方，其中，用烷基硫酸盐(C12—C18)代替线型烷基苯磺酸盐—或其一部分。
14)如1)—13)中所述的洗涤剂配方，其包含一种被稳定的或被包封的过酸，来作为添加成份或作为已指定的漂白体系的替代物。
15)如3)，7)，9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中的过硼酸盐成份用过碳酸盐替代。
16)配制成的非水溶液形式的液体洗涤剂组合物，其包含一种液体非离子表面活性剂，如线型烷氧基化伯醇，一种助洗剂体系(如磷酸)，酶和碱。洗涤剂也可包含阴离子表面活性剂和/或漂白体系。
本发明L—氨基酸氧化酶能以常规浓度掺入洗涤剂。本发明的洗涤剂组合物中，L—氨基酸氧化酶加入量可为每升洗涤液相应的酶为0.001—100mg。
下列这实施例进一步说明本发明，在任何意义上其都不限制权利要求书中所要求保护的本发明范围。
实施例1培养实施例该实施例说明了本发明制备L—氨基酸氧化酶产品的方法。
种子培养物在500ml折流式摇瓶中进行培养繁殖。摇瓶中盛有250ml培养基，其中含有2.4％玉米浸液，2.4％葡萄糖和0.4％CaCO3。培养基灭菌后，以来自琼脂斜面培养基上的菌株T.harzianum A611，CBS 223.93的菌丝体进行接种。然后摇瓶于26℃摇床上保温约70小时。
来自该种子培养物的接种物接种于2升的发酵罐，其具有灭菌空气源和叶轮搅拌装置。发酵罐中盛有1.2升培养基，其含有10％玉米浸液，0.5％葡萄糖，0.5％(NH4)SO4，0.07％KH2PO4，0.2％L—精氨酸和1.0％CaCO3。盛有培养基的发酵罐在120℃高压灭菌60分钟。
接种后，发酵过程中培养基温度保持在28℃，通入空气速率为0.8体积的空气/体积培养基/分钟。搅拌速率为900转/分钟。在起初的24小时内通过滴加25％葡萄糖和2.5％H3PO4溶液将发酵培养基的pH值保持在6.0。从24小时起，pH值变为5.8，并在发酵过程中保持于此值。发酵进行约96小时。这时获得产量约为每升250mg酶蛋白。
实施例2纯化实施例调节按实施例1得到的2.7升培养液的pH至5.0，过滤除去不溶性物质。以悬浮于1升50mM醋酸缓冲液(pH5.0)中的约270g固体Ca3(PO4)来吸附L—氨基酸氧化酶。室温下搅拌2小时后，过滤浆液，用pH8.0约750ml的0.1M磷酸钠洗脱吸附的蛋白。通过超滤，洗脱缓冲液变为pH7的20mM磷酸钠。最后洗脱液浓缩至200ml。膜截留分子量为10,000Da。
将该样品置于Q Sepharose Fast Flow柱子上，柱子先用20mM磷酸钠(pH7.0)进行平衡。以2个柱体积的同一缓冲液清洗柱子并用0至1M NaCl的20mM磷酸钠(pH 7.0)溶液进行梯度洗脱。收集具有L—氨基酸氧化酶活性的级份。收集的蛋白以SDS—PAGE确定纯度。
纯化的L—氨基酸氧化酶的比活力为16u/mg，其是在pH8.5的50mM磷酸缓冲液中20℃下以1mM L—精氨酸为底物时测定的。一个酶单位每分钟形成1μmnol的过氧化氢。假设280nm下测定的光密度为1的L—氨基酸氧化酶溶液含有1mg蛋白/ml，由此来计算蛋白的量。L—氨基酸氧化酶的产量约为每升培养基中有50mg的纯蛋白。
实施例3性质实施例使用微滴板来进行如前述实施例得到的L—氨基酸氧化酶的性质的测定。微滴板在下述的温度和时间间隔下进行保温。
过氧化物酶活力以过氧化物酶单位(PODU)表示，在标准条件下(即pH7.0，温度30℃；反应时间3分钟)每分钟催化1μmol过氧化氢转化所用的酶量确定为1个单位。使用基于ABTS(2，2’—连氮双(3—乙基苯并三唑啉—6—磺酸盐))为发色团的分析方法测定活力，产生的绿蓝色在418nm下测定吸光度。
在下述性质实施例中，使用灰盖鬼伞过氧化物酶(Cip)进行过氧化氢的检测，过氧化物酶根据WO 92/16634而得。在4.5PODU/ml水平和0.4mM ABTS的pH7.0的磷酸缓冲液中检测。过氧化氢浓度以相对于新制备的过氧化氢标准溶液来确定。最适pH测定分两步进行。第一步，在不同pH条件下L—氨基酸氧化酶与1mM的L—精氨酸在100mM磷酸缓冲液中保温20分钟。第二步，产生的过氧化氢以上述方法进行检测。
结果示于图1。正如该试验所测定的，本发明L—氨基酸氧化酶在pH低于7至PH约12的范围内均显示出活性。酶的最适pH范围为pH8至10。pH稳定性L—氨基酸氧化酶在不同的pH下于40℃在50mM的磷酸缓冲液中保温1小时。稀释后，用上述的两步法测定残余活力。
结果示于图2。正如此试验所测定的，本发明的L—氨基酸氧化酶在pH7—9.5范围内，pH稳定性相对于初始活力而言高于80％。在pH10下本发明L—氨基酸氧化酶的pH稳定性相对于初始活力而言高于70％，优选高于80％。温度稳定性在不同温度下，L—氨基酸氧化酶在pH8.5的磷酸缓冲液中保温1小时。稀释后，使用上述两步法测定残余活力。
结果示于图3，正如本试验所测定的，本发明L—氨基酸氧化酶在低于22℃至高于60℃的温度范围内是稳定的。在25℃至60°C间该酶显示的温度稳定性相对于初始活力而言高于80％。底物专一性以不同的L—氨基酸作底物来测定L—氨基酸氧化酶的活力。室温下，L—氨基酸氧化酶与底物在pH8.5的磷酸盐缓冲液中保温20分钟。产生的过氧化氢用上述的ABTS和Cip检测。比活力由上述实施例2描述的方法测定。
通过1/V对1/S作图(Lineweaver—Burk曲线)，确定不同底物的Km值。结果示于下列表1。
表1
从表1可见，精氨酸和赖氨酸显示出最小的Km值，考虑到在低底物浓度时高的比活力，由此认为它们是优选底物，从表1中所列的比活力值也可证明这一点。
从这些实施例中可见，优选底物为L—精氨酸。
实施例4与POD促进体系的相容性为研究本发明L—氨基酸氧化酶与促进的过氧化物酶系(POD体系)的相容性，通过同时检测过氧化氢，对pH8.5时的酶活力监测10分钟。
根据实施例2得到的8μg/ml L—氨基酸氧化酶被加入POD体系中，该体系由WO 92/16634得到的酶量为5PODU/ml的灰盖鬼伞过氧化物酶(Cip)和pH8.5磷酸缓冲液中的1.7mMABTS和作为促进剂的50μM对—羟基苯磺酸盐(pHBS)组成，并含有1mM L—亮氨酸。
结果示于图4A—4B，(4A是没有pHBS的情况；4B是存在50μM pHBS的情况)，在周围环境温度下监测418nm处的吸光度。正如这些图所表明的，本发明L—氨基酸氧化酶的活力不受pHBS加入的影响。
实施例5漂白实施例本实施例证明由实施例1—2得到的L—氨基酸氧化酶在漂白甲基橙染料(得自Merch)过程中的应用。
pH8.5、35℃下在磷酸缓冲液中进行甲基橙的漂白。漂白效果以465nm处的吸光度值来监测。为进行对比，实验在起始加入H2O2以及L—氨基酸氧化酶和L—亮氨酸的情况进行。两项实验均在促进剂pHBS存在时和不存在时进行。
所有实验均采用10nM的灰盖鬼伞过氧化物酶(Cip)，其根据WO 92/16634获得。
结果示于图5—6。从这些图可见，通过采用本发明的L—氨基酸氧化酶(及其底物)可获得的漂白效果与加入230μM的过氧化氢获得的效果相同。
权利要求
1.一种L—氨基酸氧化酶(E.C.1.4.3.2)，其特征在于具有下列性质(A)最适PH值范围为PH 8.5至9.5(L—精氨酸存在时，20℃下保温20分钟后测定的)；(B)相对于初始活力，PH 9.5下PH稳定性为80％或更高(在底物不存在时，40℃下保温1小时后测定的)；以及(C)对L—精氨酸，L—赖氨酸，L—蛋氨酸，L—天冬酰胺，L—苯丙氨酸和L—亮氨酸均具活性。
2.根据权利要求1的L—氨基酸氧化酶，其具有的免疫化学性质与由菌株Trichoderma harzianum A611，CBS 223.93得到的L—氨基酸氧化酶的性质相同或部分相同。
3.根据权利要求1或2的L—氨基酸氧化酶，其可从菌株Trichoderma harzianum获得。
4.根据权利要求3的L—氨基酸氧化酶，其可从菌株T.harzianum A611，CBS 223.93或其突变体或变异体中获得。
5.一种制备权利要求1—4的L—氨基酸氧化酶的方法，该方法包括在含有碳源和氮源以及无机盐的适合的培养基中培养L—氨基酸氧化酶的生产菌株Trichoderma harzianum，然后回收所需要的酶。
6.一种根据权利要求5的方法，其中对菌株T.harzianumA611，CBS 223.93或其突变体或其变异体进行培养。
7.根据权利要求1—4的L—氨基酸氧化酶用于过氧化氢的原位产生。
8.一种包含权利要求1—4的L—氨基酸氧化酶的洗涤剂添加剂，该洗涤剂添加剂以颗粒状形式提供，优选无粉尘颗粒，以液体，尤其是稳定的液体，浆或已保护的酶形式提供。
9.根据权利要求8的一种洗涤剂添加剂，其进一步包含氧化酶的底物。
10.一种洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1—4的L—氨基酸氧化酶，并包含该氧化酶的底物。
11.根据权利要求10的洗涤剂组合物，其进一步包含一种或多种其它酶，尤其是蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶，过氧化物酶和其它氧化酶。
12.一种根据权利要求11的洗涤剂组合物，其中过氧化物酶来自鬼伞属，如灰盖鬼伞或长根鬼伞，或来自芽孢杆菌属，如短小芽孢杆菌，或者，其中的过氧化物酶来自植物，如辣根过氧化物酶。
13.一种(当在洗衣液体中一同洗涤和/或漂洗所述织物时)抑制纺织品染料从染色织物向另一织物传递的方法，该方法包括，向洗涤和/或漂洗所述织物的洗衣液中加入权利要求1—4的L—氨基酸氧化酶。
全文摘要
本发明涉及一种新的L-氨基酸氧化酶，其具有广范围的底物专一性，能从Trichoderma harzianum获得。本发明的酶可很好地掺入洗涤剂组合物中，该组合物是用于抑制洗涤过程中染料从一种染色织物传递到另一织物上。
文档编号C12S11/00GK1124979SQ9419227
公开日1996年6月19日 申请日期1994年4月27日 优先权日1993年4月30日
发明者P·施耐德, A·H·皮德森, S·A·哈森 申请人:诺沃挪第克公司